寨卡等蚊蟲傳播傳染病實(shí)驗(yàn)室檢測策略

寨卡等蚊蟲傳播傳染病實(shí)驗(yàn)室檢測策略第一頁，共七十三頁，2022年，8月28日黃病毒的系統(tǒng)發(fā)生第二頁，共七十三頁，2022年，8月28日黃病毒生物學(xué)特性概述

黃病毒科成員共同特征：1、病毒球狀，直徑約40～70nm，核衣殼20面體對(duì)稱，脂質(zhì)包膜

2、病毒通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞3、病毒在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)復(fù)制，形成中間體

4、基因組RNA具有mRNA、復(fù)制模板RNA和遺傳物質(zhì)RNA5、病毒蛋白均有一個(gè)經(jīng)宿主蛋白酶和病毒蛋白酶切而成單一的多蛋白前體6、子代病毒在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出芽，通過宿主細(xì)胞分泌通路，轉(zhuǎn)運(yùn)至包膜，成熟釋放7、病毒對(duì)熱、脂溶劑和去氧膽酸鈉敏感第三頁，共七十三頁，2022年，8月28日黃病毒基因組結(jié)構(gòu)與病毒蛋白第四頁，共七十三頁，2022年，8月28日黃病毒屬病毒發(fā)病機(jī)制隱性感染：蚊蟲叮咬病毒進(jìn)入體內(nèi)，將病毒限制在局部并清除顯性感染：當(dāng)侵入的病毒量較大且人體免疫功能不足以清除病毒時(shí)，病毒入血引起病毒血癥，病毒突破血腦屏障進(jìn)入人中樞神經(jīng)系統(tǒng)引起腦膜和腦實(shí)質(zhì)炎癥。第五頁，共七十三頁，2022年，8月28日黃病毒屬病毒發(fā)病機(jī)制病毒進(jìn)入機(jī)體后，在樹突狀細(xì)胞中復(fù)制，然后播散到局部淋巴結(jié)和血流中，產(chǎn)生病毒血癥。繼而引起外周器官的感染。TOLL樣受體3通過TNF-a改變內(nèi)皮細(xì)胞的通透性，從而使病毒透過血腦屏障到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)。黃病毒屬的成員可誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，病毒直接侵犯神經(jīng)細(xì)胞引起損害。感染的神經(jīng)細(xì)胞被CTL特異性殺傷。第六頁，共七十三頁，2022年，8月28日一、寨卡病毒病

第七頁，共七十三頁，2022年，8月28日

1947年：首先從烏干達(dá)Zika森林的猴血清中分離到

1948年：在同一地區(qū)的伊蚊中分離到寨卡病毒1952年：在烏干達(dá)和坦桑尼亞發(fā)現(xiàn)人感染寨卡病毒1954年：從西非“黃疸”暴發(fā)中的病人分離到2013-2014年：在大洋洲的法屬波利尼西亞，感染約32000人。2015年5月-2016年1月：巴西共報(bào)道4000例感染孕婦分娩小頭畸形兒，較往年上升20倍。2016年8月27-9月6號(hào)：新加坡275例。

2007年以來，全球共有52個(gè)國家或地區(qū)有寨卡病毒流行的證據(jù)，其中2015年以來，報(bào)告寨卡病毒病本地傳播病例的國家或地區(qū)40個(gè)（中國CDC寨卡疫情防控簡報(bào)）；第八頁，共七十三頁，2022年，8月28日寨卡病毒病疫情第九頁，共七十三頁，2022年，8月28日臨床表現(xiàn)潛伏期尚不明確（3-12d?）。約1/5的感染者出現(xiàn)臨床癥狀典型病例的臨床表現(xiàn)為急性發(fā)熱、頭疼、舌紅、皮疹、肌肉痛、關(guān)節(jié)痛、結(jié)膜炎、眶后痛、手掌足底紅腫等臨床表現(xiàn)一般較輕，癥狀持續(xù)數(shù)天到1周，癥狀嚴(yán)重需要住院者少見，病死率低

第十頁，共七十三頁，2022年，8月28日寨卡病毒病并發(fā)癥一、神經(jīng)系統(tǒng)

格林巴利綜合征、腦膜腦炎二、免疫系統(tǒng)血小板減少性紫癜、白細(xì)胞減少癥三、出生缺陷

新生兒小頭畸形第十一頁，共七十三頁，2022年，8月28日Zika病毒分為亞洲型和非洲型第十二頁，共七十三頁，2022年，8月28日寨卡病毒的宿主和媒介

寨卡病毒宿主：尚不完全明確非人靈長類可感染寨卡病毒

寨卡病毒媒介：伊蚊1、在不同的伊蚊中分離到寨卡病毒2、埃及伊蚊：重要傳播媒介（海南、廣東、云南、廣西）3、白紋伊蚊：可作為傳播媒介（北至沈陽、大連，經(jīng)天水、隴南至西藏墨脫一線及其東南側(cè)的大部分地區(qū)）

第十三頁，共七十三頁，2022年，8月28日傳播途徑伊蚊叢林循環(huán)靈長類人城市循環(huán)一、蚊媒是主要傳播途徑，埃及伊蚊為最重要的媒介，在白紋伊蚊、非洲伊蚊和黃頭伊蚊等蚊中發(fā)現(xiàn)寨卡病毒二、性傳播三、通過宮內(nèi)感染、產(chǎn)程感染第十四頁，共七十三頁，2022年，8月28日標(biāo)本采集、保存、運(yùn)輸

一、病例標(biāo)本采集

對(duì)懷疑感染寨卡病毒的患者，推薦采集血液、尿液（精液、羊水、腦脊液）等開展檢測。非抗凝血5mL，及時(shí)分離血清，分裝2管，標(biāo)記清楚后低溫保存。對(duì)病例應(yīng)盡可能采集雙份血液標(biāo)本，兩份標(biāo)本之間相隔14天為宜，住院病例可于入院當(dāng)天和出院前1天各采集1份。二、蚊媒標(biāo)本采集

疫點(diǎn)內(nèi)采集的伊蚊成蚊及幼蟲，分類鑒定，填寫媒介標(biāo)本采集信息表，按照采集地點(diǎn)分裝，每管10-20只。三、標(biāo)本保存、運(yùn)送

能夠在24小時(shí)內(nèi)開展檢測，2-8℃保存；能在7天內(nèi)開展檢測，-20℃保存；如保存7天以上，-70℃以下。運(yùn)送時(shí)低溫冷藏運(yùn)輸，避免凍融，遵守國家關(guān)于三類病原體的相關(guān)生物安全規(guī)定。第十五頁，共七十三頁，2022年，8月28日寨卡病毒感染和細(xì)胞因子第十六頁，共七十三頁，2022年，8月28日寨卡病毒感染和細(xì)胞因子第十七頁，共七十三頁，2022年，8月28日寨卡病毒和其他黃病毒交叉反應(yīng)第十八頁，共七十三頁，2022年，8月28日寨卡病毒的檢測一、核酸檢測

熒光定量RT-PCR、傳統(tǒng)PCR+測序，是目前早期診斷寨卡病毒病的主要檢測手段二、抗體檢測IgM抗體檢測（發(fā)病3天后可檢出病毒特異性IgM抗體，但發(fā)病7天后檢出率高）、中和抗體檢測（PRNT空斑減少中和試驗(yàn)，恢復(fù)期血清中和抗體陽轉(zhuǎn)或滴度較急性期呈4倍及以上升高，且排除登革、乙腦等其他常見黃病毒感染，可以確診）三、病毒分離

C6/36、BHK21、乳鼠四、抗原檢測

免疫組化第十九頁，共七十三頁，2022年，8月28日第二十頁，共七十三頁，2022年，8月28日第二十一頁，共七十三頁，2022年，8月28日二、西尼羅病毒病第二十二頁，共七十三頁，2022年，8月28日1950年埃及描述了該病的生態(tài)學(xué)特征。1957年以色列發(fā)生了暴發(fā)流行，被認(rèn)為是引起老年人嚴(yán)重的腦膜腦炎的原因。1994年以來，相繼在羅馬尼亞、摩洛哥、突尼斯、意大利、俄羅斯、美國、以色列、法國、加拿大等地爆發(fā)。1996年，羅馬尼亞，大約400人發(fā)生腦炎,近40人死亡。1999年，俄羅斯南部發(fā)生了范圍廣泛的流行，近1000人發(fā)病，至少40人死亡。美國：自1999年8月發(fā)現(xiàn)首例病人，截至到2005年累計(jì)共有19655人感染，死亡782人。2012年，美國大暴發(fā)，已造成236人死亡，另有五千余人感染。第二十三頁，共七十三頁，2022年，8月28日病原學(xué)黃病毒科，單股正鏈ＲＮＡ,呈球形，直徑20～50nm，二十面體對(duì)稱，有囊膜和蛋白衣殼。分為Ⅰ型和Ⅱ型兩個(gè)基因型，引起人類感染的為Ⅰ型病毒。一個(gè)編碼區(qū)，編碼3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，C-prM-E，和7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5。與乙型腦炎、圣路易腦炎等病毒有明顯抗原性交叉反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)表明：小白鼠用乙腦病毒、蜘蛛猴用黃熱病毒弱毒株、地鼠用乙腦病毒、圣路易腦炎病毒免疫后，均可抵抗WNV神經(jīng)外途徑的攻擊。第二十四頁，共七十三頁，2022年，8月28日病原學(xué)根據(jù)wNVE蛋白基因的差別，將現(xiàn)在已經(jīng)分離的不同病毒株分為2個(gè)譜系。譜系I：引起人類WNV感染的主要基因型，又分3個(gè)分枝Ia：括歐洲／地中海／肯尼亞分離株以及美國、以色列分離株；Ib：澳大利亞分離株；Ic：印度分離株。譜系Ⅱ：只在非洲撒哈拉地區(qū)和馬達(dá)加斯加小范圍傳播。第二十五頁，共七十三頁，2022年，8月28日流行病學(xué)傳染源主要是鳥類,包括烏鴉、家雀、知更鳥、杜鵑、海鷗等。該病毒還可以感染馬、貓、鼠類、家兔等,目前還沒有人-人、動(dòng)物-動(dòng)物、動(dòng)物-人、鳥-人等直接傳播的記錄。家燕是其重要脊椎動(dòng)物儲(chǔ)存宿主。傳播途徑蚊子是本病的主要傳播媒介,以庫蚊為主。還可通過輸血、器官移植、哺乳、垂直傳播以及皮膚黏膜接觸感染等多種途徑傳播。易感性人群對(duì)西尼羅腦炎病毒普遍易感,感染后可產(chǎn)生較持久的免疫力。熱帶地區(qū)全年均有發(fā)病，溫帶地區(qū)發(fā)病主要在夏秋季節(jié)。第二十六頁，共七十三頁，2022年，8月28日臨床標(biāo)本采集采集對(duì)象：流行季節(jié)不明原因發(fā)熱，病毒性腦炎、腦膜炎等患者急性期標(biāo)本血清，腦脊液，尸檢腦組織，臟器，其他體液核酸檢測，病毒培養(yǎng)，抗體篩查恢復(fù)期標(biāo)本血清抗體篩查2023/2/3第二十七頁，共七十三頁，2022年，8月28日標(biāo)本種類鳥：血液，組織，咽試紙，血清（活鳥）馬：組織蚊：研磨液人：腦組織，器官，血液，血清，腦脊液病原檢測抗體檢測2023/2/3第二十八頁，共七十三頁，2022年，8月28日2023/2/3第二十九頁，共七十三頁，2022年，8月28日病原檢測核酸檢測BSL-2常規(guī)RT-PCR/瓊脂糖凝膠電泳實(shí)時(shí)熒光定量PCR(TaqMan)分離病毒BSL-3細(xì)胞培養(yǎng):Vero,BHK,C6-36,其他小鼠抗體檢測

IgM（ELISA、IFA)IgG（ELISA、IFA)中和抗體（PRNT,定量分析）2023/2/3第三十頁，共七十三頁，2022年，8月28日病原檢測比較核酸IgM抗體IgG抗體中和抗體1.與其他黃病毒無交叉，一經(jīng)明確即可確診

2.低敏感性3.需要重復(fù)，不同基因組位置

1.最常用急性期感染檢測2.第一周僅50%出現(xiàn)

3.與其他黃病毒存在一定交叉

4.持續(xù)時(shí)間長，單獨(dú)的IgM陽性并不能作為急性診斷標(biāo)準(zhǔn)，尤其是流行區(qū)

1.交叉嚴(yán)重，如JE,SLE疫苗接種.

2.IgG陰性，IgM陽性提示近期感染(疑似病例).

3.無癥狀的不推薦，不能作為疫苗效果評(píng)價(jià)

4.恢復(fù)期較急性期水平升高意味近期感染了黃病毒或者接種了疫苗

1.重要鑒別診斷及確診指標(biāo)

2.與其他黃病毒有一定交叉，但可以定量比較差異以鑒別

3.恢復(fù)期較急性期血清存在4倍及以上增高，具有重要診斷意義

2023/2/3第三十一頁，共七十三頁，2022年，8月28日疑似病例檢測結(jié)果意義第三十二頁，共七十三頁，2022年，8月28日核酸檢測-引物序列第三十三頁，共七十三頁，2022年，8月28日市售血清學(xué)檢測試劑種類FocusDiagnostics(WNBIgGDxSelect,WNVIgMCaptureDxSelect,Cypress,CA)PANBIODiagnostics(WNVIgMCapture,WNVIgGIndirect,Wind-sor,Australia)InBiosInternational(WestNileDetectIgGCaptureELISA,WestNileDetectIgMCaptureELISA,Seattle,WA).2023/2/334第三十四頁，共七十三頁，2022年，8月28日三、基孔肯雅熱第三十五頁，共七十三頁，2022年，8月28日基孔肯雅熱（chikungunyafever）:1952年首次在坦桑尼亞證實(shí)了基孔肯雅熱流行，1956年分離到病毒。是由基孔肯雅病毒(chikungunyavirus,CHIKV)引起，經(jīng)伊蚊傳播，以發(fā)熱、皮疹及關(guān)節(jié)疼痛為主要特征的急性傳染病。2010年，廣東東莞報(bào)告91例疑似病例。第三十六頁，共七十三頁，2022年，8月28日基因結(jié)構(gòu)通過對(duì)E1基因的系統(tǒng)發(fā)生分析可將CHIKV分為3個(gè)組：第1組包含了全部西非的分離株，第2組是亞洲分離株，第3組為東、中、南部非洲的分離株。第三十七頁，共七十三頁，2022年，8月28日基因結(jié)構(gòu)CHIKV屬于披膜病毒科甲病毒屬，為不分節(jié)段的正鏈RNA，直徑約70nm，有包膜，含有3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白（衣殼蛋白C、包膜蛋白E1和E2）和4個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（nsP1、nsP2、nsP3和nsP4）。長度約為11～12kb。病毒基因組編碼順序?yàn)?’－NS1－NS2－NS3－NS4－C－E3－E2－E1－3’。第三十八頁，共七十三頁，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)室檢查第三十九頁，共七十三頁，2022年，8月28日實(shí)驗(yàn)室檢查第四十頁，共七十三頁，2022年，8月28日第四十一頁，共七十三頁，2022年，8月28日第四十二頁，共七十三頁，2022年，8月28日第四十三頁，共七十三頁，2022年，8月28日四、登革病第四十四頁，共七十三頁，2022年，8月28日重要免疫原診斷標(biāo)記RT-PCRNS1：膜相關(guān)NS1，mNS1分泌型NS1，sNS1病毒發(fā)病第1-9天出現(xiàn)血癥期必然出現(xiàn)的分子標(biāo)識(shí)物可高達(dá)50μg/mLYYYYYYYYYYYY第四十五頁，共七十三頁，2022年，8月28日1、核酸檢測（NESTEDPCR，RealtimePCR）2、ELISA（NS1抗原，IgM，IgG，IgA）3、膠體金（NS1、IgM，IgG）4、C6/36白紋伊蚊卵細(xì)胞分離登革熱病毒5、間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）鑒定登革熱病毒6、新生小白鼠分離登革熱病毒實(shí)驗(yàn)室檢測方法第四十六頁，共七十三頁，2022年，8月28日登革病毒首次感染7071421天IgM~90天IgA~45天IgG潛伏期病毒血癥發(fā)熱期急性期恢復(fù)期病毒分離核酸檢測NS1抗原檢測IgM抗體檢測病毒中和實(shí)驗(yàn)IgG抗體檢測病毒中和實(shí)驗(yàn)PLoSNeglTropDis5(9):e1309.第四十七頁，共七十三頁，2022年，8月28日登革病毒再次感染7071421天IgMIgAIgG潛伏期病毒血癥發(fā)熱期急性期恢復(fù)期病毒分離核酸檢測NS1抗原檢測IgM、IgG、IgA檢測病毒中和實(shí)驗(yàn)PLoSNeglTropDis5(9):e1309.第四十八頁，共七十三頁，2022年，8月28日合適的時(shí)機(jī)采用合適的檢測方法檢測方法登革NS1抗原RT-PCR病毒分離登革IgM抗體登革IgG抗體發(fā)病天數(shù)1-6天1-5天1-5天5天以后10天以后確診標(biāo)準(zhǔn)檢出NS1抗原檢出病毒核酸檢出病毒檢出IgM抗體，雙份（間隔期不少于7天）IgM陽轉(zhuǎn)繼發(fā)感染出現(xiàn)高水平IgG抗體（捕獲法）或滴度4倍升高世界衛(wèi)生組織登革防控指南2009第四十九頁，共七十三頁，2022年，8月28日登革實(shí)驗(yàn)室檢測方法特點(diǎn)世界衛(wèi)生組織登革防控指南2009第五十頁，共七十三頁，2022年，8月28日早期檢測宜用PCR、NS1，發(fā)病5天后宜采用抗體檢測第五十一頁，共七十三頁，2022年，8月28日寨卡病毒、登革病毒和基孔肯雅病毒共流行新喀里多尼亞第五十二頁，共七十三頁，2022年，8月28日寨卡、登革、基孔肯雅臨床比較臨床癥狀寨卡病毒病登革熱基孔肯雅熱發(fā)熱++++++++++斑丘疹+++++++肌痛/關(guān)節(jié)痛+++++++++結(jié)膜炎+++-+四肢水腫++--眼眶后痛+++++淋巴結(jié)腫大+++++肝腫大--+++白細(xì)胞/血小板減少-++++++出血-+-.第五十三頁，共七十三頁，2022年，8月28日第五十四頁，共七十三頁，2022年，8月28日五、流行性乙型腦炎第五十五頁，共七十三頁，2022年，8月28日乙型腦炎流行背景TomSolomon,ThenewEnglandjournalofmedicine,2004

重要的黃病毒性腦炎

引起人類嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病覆蓋人群:

約30億每年發(fā)病人數(shù)：>35,000病死率：10-30%后遺癥：20-30%第五十六頁，共七十三頁，2022年，8月28日乙腦病毒的鑒定—分子生物學(xué)鑒定引物目的基因

序列信息

片段大小1JEVPrM5‘-251CGTTCTTCAAGTTTACAGCATTAGC275-3’5'925-CCYRTGTTYCTGCCAAGCATCCAMCC901-3'

674bp2JEVE5'955-TGYTGGTCGCTCCGGCTTA

973-3'5'2536-AAGATGCCACTTCCACAYCTC

2516-3'1561bp3FlavivirusesNS55‘-TACAACATGATGGGAAAGAGAGAG-3'5'-GTGTCCCAGCCGGCGGTGTCATCAGC-3'310bpPrM基因:鑒定病毒分離物是否為乙腦病毒E基因:除了鑒定乙腦病毒外，還可以進(jìn)行乙腦病毒的基因分型研究ssRNA(+)10.9kbCPrMENS1NS3NS2bNS2aNS4aNS4bNS55’UTR3’UTR第五十七頁，共七十三頁，2022年，8月28日乙型腦炎病毒分子特征基因組

單股正鏈RNA病毒僅有一個(gè)開放閱讀框（openingreadingframe,ORF）編碼一個(gè)大蛋白基因長度大約在11kb(40-60nm)3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，C，prM,E7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白，NS1,NS2a/b，NS3，NS4a/b，NS5黃病毒屬EMRNA第五十八頁，共七十三頁，2022年，8月28日檢測方法ELISAIFA中和實(shí)驗(yàn)PCR測序病毒分離第五十九頁，共七十三頁，2022年，8月28日蚊蟲標(biāo)本病毒分離第六十頁，共七十三頁，2022年，8月28日蚊蟲標(biāo)本病毒分離—研磨操作場所：二級(jí)或三級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室個(gè)人防護(hù)：防護(hù)服、口罩、帽子、乳膠手套研磨器要插入冰浴中進(jìn)行預(yù)冷整個(gè)操作過程中蚊蟲標(biāo)本都要保存在冰浴中第六十一頁，共七十三頁，2022年，8月28日蚊蟲標(biāo)本病毒分離—研磨12341、從冰浴中取出研磨器和蚊蟲標(biāo)本2、從研磨器中拔出研磨杵3、將蚊蟲標(biāo)本倒入研磨器中4、向研磨器中加入1ml研磨液第六十二頁，共七十三頁，2022年，8月28日蚊蟲標(biāo)本病毒分離—研磨565、旋轉(zhuǎn)研磨器快速反復(fù)研磨6、直至蚊子大的組織塊消失7、使用毛細(xì)管將研磨液吸出8、將研磨液加入無菌1.5mlEP管中78第六十三頁，共七十三頁，2022年，8月28日蚊蟲標(biāo)本病毒分離—研磨液離心要使用冷凍離心機(jī)4℃12,000rpm離心20min3裝有研磨液上清的EP管要迅速插入冰浴中第六十四頁，共七十三頁，2022年，8月28日蚊蟲標(biāo)本病毒分離—儀器研磨時(shí)間短，效率高，可節(jié)省人力物力有利于病毒存活，提高病毒的分離率第六十五頁，共七十三頁，2022年，8月28日動(dòng)物分離病毒法：乳小白鼠（3日齡）優(yōu)點(diǎn)，很敏感，易掌握；病毒可隨傳代次數(shù)的增加而增強(qiáng)，有利于病毒分離但是，小白鼠本身存在多種病毒性疾病，往往會(huì)影響結(jié)果

組織培養(yǎng)分離法：沒有隱性感染沒有免疫能力的抵抗力接種量大培養(yǎng)條件易于控制加速病毒的分離過程C6/36：對(duì)蚊傳蟲媒病毒較為敏感，蚊傳蟲媒病毒分離的首選細(xì)胞BHK-21：對(duì)絕大多數(shù)蟲媒病毒敏感BHK-21C6