醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)原理之基因工程基本技術(shù)

基因操作*1

基因工程基本技術(shù)

GeneticEngineeringTechnology*2

20世紀(jì)70年代以來(lái)，生物技術(shù)(biotechnology)的出現(xiàn)和發(fā)展為醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域帶來(lái)了巨大變化。基因工程(geneticengineering)是生物技術(shù)最主要的研究?jī)?nèi)容之一，又稱為DNA重組技術(shù)(recombinantDNAtechnique)或分子克隆(molecularcloning)。它涉及到特定基因（被稱為目的基因或外源DNA片段）的制備、分離、鑒定、改造及其在不同生物間的轉(zhuǎn)移等多項(xiàng)技術(shù)。*3一、基因工程技術(shù)的產(chǎn)生及其科學(xué)意義

DNA重組技術(shù)之所以能夠付諸實(shí)現(xiàn)，主要得益于DNA限制性內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）和DNA連接酶（DNAligase）的發(fā)現(xiàn)。1972年，美國(guó)斯坦福大學(xué)PaulBerg等在實(shí)驗(yàn)室制造出了第一個(gè)人工重組DNA：首先用限制酶EcoRI從SV40切下一段DNA，同時(shí)

將λ噬菌體DNA進(jìn)行切割；將其導(dǎo)入細(xì)菌體內(nèi)。然后用DNA末端轉(zhuǎn)移酶在DNA片段的末端分別加

上同聚A或同聚T尾；最后在體外用連接酶將SV40DNA與λ噬菌體DNA

連接后將其導(dǎo)入細(xì)菌體內(nèi)。*4此后的另外三項(xiàng)起到了決定性的作用工作：

（1）JanetMertz和RonaldDavis在同一年發(fā)現(xiàn)EcoRI酶切后的DNA片段留下的是一種粘性末端；

（2）HerbertBoyer和StanleyCohen等式分別于1973年和1974年利用質(zhì)粒作為載體，導(dǎo)入細(xì)菌后載體可以自我復(fù)制擴(kuò)增，而且質(zhì)粒載體帶有抗生素抗性基因可以用于篩選；

（3）1974年，Boyer和Cohen又證明了，外源基因用質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)菌后不僅可以在其中復(fù)制，而且可以在其中轉(zhuǎn)錄為RNA。*5推動(dòng)基因工程技術(shù)快速發(fā)展的主要因素：（1）更多的限制性內(nèi)切酶的純化、鑒定及商品化，使獲得適合克隆的DNA片段變得極為容易；（2）DNA瓊脂糖電泳分析技術(shù)的建立使得人們可以較為容易地分離純化所需要的DNA片段；（3）核酸分子雜交和DNA序列分析技術(shù)的發(fā)展，發(fā)推動(dòng)了重組DNA的鑒定；（4）大量高效率的克隆和表達(dá)載體的構(gòu)建和商品化，尤其是用于構(gòu)建cDNA或基因組文庫(kù)載體的發(fā)展；（5）成功地將外源基因?qū)氩溉閯?dòng)物細(xì)胞并在其中表達(dá)等等?？寺』?cloning)：

獲取這類相同的DNA分子群體、細(xì)胞群體或個(gè)體群體的過(guò)程，即無(wú)性繁殖。重組DNA(recombinantDNA)：又稱嵌合DNA（chimeraDNA），采用克隆技術(shù)把來(lái)自不同生物的外源DNA插入載體分子所形成的雜合DNA分子。*6克隆(clone)：指從來(lái)自同一始祖的一群相同分子、細(xì)菌、細(xì)胞或動(dòng)物（常被稱為副本或拷貝）。相關(guān)概念二、基因工程技術(shù)的基本原理和步驟分－－(1)獲取目的基因并進(jìn)行必要的改造切－－(2)限制酶切割目的基因與載體接－－(3)將目的基因與載體拼接成重組載體轉(zhuǎn)－－(4)將重組載體轉(zhuǎn)導(dǎo)入受體細(xì)胞篩－－(5)篩選出含重組DNA的細(xì)胞等DNA重組技術(shù)的基本步驟*7思考題1重組DNA技術(shù)的基本過(guò)程（1）*8重組DNA技術(shù)的基本過(guò)程（2）*9載體（vector）的概念克隆載體(cloningvector)表達(dá)載體(expressionvector)在克隆載體的基礎(chǔ)上，增添了與宿主細(xì)胞相適應(yīng)的強(qiáng)啟動(dòng)子等式元件，可使插入的外源DNA片段被轉(zhuǎn)錄、翻譯成多肽鏈。含有復(fù)制起始點(diǎn)oriC，可使插入的外源DNA序列被擴(kuò)增或保存的載體。指能攜帶外源DNA分子進(jìn)入受體細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)的運(yùn)載工具。應(yīng)具備的基本條件：*10

三、基因工程常用載體①含有復(fù)制起始點(diǎn)，具有自主復(fù)制的能力；⑥具有較高的遺傳穩(wěn)定性。⑤拷貝數(shù)較多，易于與受體細(xì)胞的染色體DNA分開；④分子質(zhì)量相對(duì)較小，以容納較大的外源DNA；③具有一個(gè)以上的選擇性遺傳標(biāo)記，便于重組體的篩選和鑒定；②具有多個(gè)單一酶切位點(diǎn)，稱為多克隆位點(diǎn)；克隆載體應(yīng)具備的基本條件：*11重組DNA技術(shù)中常用載體：(1)質(zhì)粒載體：最常用的對(duì)目的基因克?。徽沉］d體：用于克隆大片段DNAM13噬菌體載體：用于Sanger雙脫氧DNA測(cè)序(2)噬菌體載體：構(gòu)建基因組DNA或cDNA文庫(kù)(4)病毒載體：包括人或哺乳動(dòng)物病毒、昆蟲及植物病

毒用于在真核細(xì)胞中表達(dá)目的蛋白(3)人工染色體載體：用于更大DNA片段的克隆*12

(一)質(zhì)粒(plasmid)載體細(xì)菌培養(yǎng)

質(zhì)粒是存在于細(xì)菌染色質(zhì)以外，具有自我復(fù)制能力的雙鏈環(huán)狀DNA。小的約2~3kb,大的數(shù)百kb。大腸桿菌染色質(zhì)質(zhì)粒質(zhì)粒擴(kuò)增并表達(dá)蛋白質(zhì)

嚴(yán)緊型質(zhì)粒（stringentplaxmid）

松弛型質(zhì)粒（relaxedplaxmid）AmprORITetr1.pBR322質(zhì)粒：一種克隆質(zhì)粒ORI：Ampr,

Tetr：兩個(gè)抗性基因，用于篩選陽(yáng)性克隆。PstI,BamHI：兩個(gè)酶切位點(diǎn)，用于插入目的基因分子量較小拷貝數(shù)較高復(fù)制起始點(diǎn)，保證高拷貝自我復(fù)制。*14克隆3,5,7,9,10是陽(yáng)性克隆TetTet平板123456789101112123456789101112Amp*15BamH

I酶切插入目的基因，

Tetr失效：陽(yáng)性克隆*16AmpTet2.pUC質(zhì)粒載體系列OripUC192686bpAmprP(BLA)PlacAvaI(413)BamHI(418)EcoRI(397)HindIII(448)PstI(440)SmaI(415)XmaI(413)ApaLI(178)ApaLI(1121)ApaLI(2367)MCS提供多個(gè)單酶切位點(diǎn)用于克隆操作LacZ’藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性克隆分子量更小拷貝數(shù)更高*17pUC質(zhì)粒載體插入了β半乳糖苷酶N端α肽片段的編碼基因lacZ’；產(chǎn)物α肽也無(wú)活性，也不能分解培養(yǎng)基中的X-gal。藍(lán)白斑篩選

DH5a宿主菌染色體插入了β半乳糖苷酶C端的ω肽片段的編碼基因lac’△M15；產(chǎn)物ω肽無(wú)活性；不能分解培養(yǎng)基中的X-gal。有活性的β半乳糖苷酶由α肽和ω肽互補(bǔ)(α互補(bǔ))而成，可使培養(yǎng)基中的X-gal分解形成藍(lán)色化合物而出現(xiàn)藍(lán)色菌落。*18α*19X-gal藍(lán)色化合物-半乳糖苷酶（α+ω）白色藍(lán)白斑篩選：ωDH5a宿主菌藍(lán)色菌落：陰性克隆;

白色菌落：陽(yáng)性克隆*20藍(lán)白斑篩選

3.其它質(zhì)粒載體(1)能在體外轉(zhuǎn)錄克隆基因的質(zhì)粒載體由pUC系列質(zhì)粒載體派生而來(lái)，帶有來(lái)自噬菌體T7、SP6的啟動(dòng)子，為RNA聚合酶的附著提供了特異性識(shí)別位點(diǎn)。如pGEM-3Z/4Z.(2)穿梭質(zhì)粒載體（shuttleplasmidvector）是一類人工構(gòu)建的，具有兩種不同復(fù)制起始點(diǎn)和選擇標(biāo)記，可在兩種不同的宿主細(xì)胞中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。*21

(3)TA克隆載體

許多耐熱的DNA聚合酶(如Taq、Tth等)擴(kuò)增時(shí)，都在PCR產(chǎn)物3’-末端加上了A堿基。是專為克隆PCR產(chǎn)物而設(shè)計(jì)的，在其MCS兩側(cè)的3′-末端攜帶有未配對(duì)的T堿基的載體。3′3′5′PCR產(chǎn)物AA5′Taq酶T載體TT5′5′3′3′*22在連接酶的作用下可直接將PCR產(chǎn)物克隆到TA載體中。

(二)噬菌體載體噬菌體(bacteriophage,phage)

是一類細(xì)菌病毒，可用于克隆和擴(kuò)增特定的DNA片段，是廣泛使用的基因克隆載體。野生λ噬菌體的基因組為線狀雙鏈DNA，兩端為12bp彼此完全互補(bǔ)，稱之為cos位點(diǎn)的5’-單鏈突出黏性末端；進(jìn)入宿主細(xì)胞后形成壞狀雙鏈結(jié)構(gòu)，按θ方式及滾環(huán)方式進(jìn)行復(fù)制。感染細(xì)菌后，可進(jìn)入溶菌生命周期及溶源生命周期。*23λgt10/11系列(插入型，適用于cDNA克隆)EMBL3/4系列(置換型，適用于基因組DNA文庫(kù)構(gòu)建)可容納7kb以下的外源片段。λgt10和λgt11分別在阻遏劑λCI基因和lacZ’基因上，有供外源基因片段插入的單一內(nèi)切酶位點(diǎn)。可容納9~23kb的外源片段。具有兩個(gè)或兩組內(nèi)切酶位點(diǎn)，經(jīng)酶切除去基因組中噬菌體正常生長(zhǎng)非必需的序列，由外源基因片段取代。

1.λ噬菌體載體可插入的外源DNA片段大，感染效率遠(yuǎn)高于質(zhì)粒載體的轉(zhuǎn)化效率。*24EMBL3/4系列(置換型，適用于基因組DNA文庫(kù)構(gòu)建)λgt10/11系列(插入型，適用于cDNA克隆)黏粒載體結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：④分子小，可插入45kb的外源DNA片段；②含質(zhì)粒自主復(fù)制成分ORI，和耐藥基因Ampr；③含帶有一個(gè)或多個(gè)單一酶切位點(diǎn)的多聚物接頭；①含噬菌體cos黏性末端及與包裝有關(guān)的短序列；

2.黏粒載體

粘粒又稱柯斯質(zhì)粒(cossite-carryingplasmid,cosmid),是由噬菌體的cos黏性末端和細(xì)菌的質(zhì)粒構(gòu)建而成。⑤接上在真核細(xì)胞生活的元件，如SV40復(fù)制區(qū)及啟

動(dòng)子，可作為穿梭載體。*27*28ORI

3.M13噬菌體載體

M13噬菌體基因組為閉環(huán)單鏈DNA，感染雄性大腸埃希菌后，在菌體內(nèi)復(fù)制成相當(dāng)于質(zhì)粒的復(fù)制型（RF）M13雙鏈DNA，可用作基因克隆載體。M13mp系列(攜帶有含MCS序列的lacZ’基因),外源DNA不宜大于1500bp。

pBluescriptKS（+/-）是一類從pUC載體派生而來(lái)的噬菌粒載體。當(dāng)RF型M13在細(xì)菌內(nèi)達(dá)到100~200個(gè)拷貝后，M13只合成單鏈DNA，并包裝成噬菌體顆粒分泌到細(xì)胞外。可用于DNA測(cè)序、體外定點(diǎn)突變和核酸雜交。*29

pBluescriptSK（+/-）噬菌粒載體的分子結(jié)構(gòu)示意圖。SK表示多克隆位點(diǎn)區(qū)的一種取向，即lacZ基因是按照SacI→KpnI的方向轉(zhuǎn)錄；（+/-）表示單鏈?zhǔn)删wf1復(fù)制起點(diǎn)的兩種相反的取向。

(三)人工染色體載體

酵母人工染色體載體，簡(jiǎn)稱YAC載體，由酵母染色體、酵母2μmDNA質(zhì)粒的復(fù)制起始序列等元件衍生而成；可插入100kb～2,000kb外源DNA片段，是人類基因組計(jì)劃中物理圖譜繪制采用的主要載體。

細(xì)菌人工染色體載體，簡(jiǎn)稱BAC載體，以細(xì)菌F因子為基礎(chǔ)構(gòu)建而成；可插入100kb～300kb外源DNA片段，是人類基因組計(jì)劃中序列分析采用的主要載體。*31YAC結(jié)構(gòu)圖及基因克隆過(guò)程*32常用于構(gòu)建載體的RNA病毒（整合型）：逆轉(zhuǎn)錄病毒(retrovirus,RV)慢病毒(lentivirus):也屬于RV家族常用于構(gòu)建載體的DNA病毒（游離型）：腺病毒(adenovirus,Ad)腺相關(guān)病毒(adeno-associatedvirus,AAV)單純皰疹病毒(herpessimplexvirus,HSV)埃-巴二氏病毒(Epstein-Barrvirus,EBV)痘苗病毒(vacciniavirus)

(四)病毒載體*33

(一)限制性核酸內(nèi)切酶

是一類能識(shí)別雙鏈DNA中的某些特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈的核酸內(nèi)切酶，又稱為限制酶（restrictionenzyme）。主要是從原核生物中分離純化而來(lái)。與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源DNA，保護(hù)自身DNA。*34四、基因工程常用工具酶（restrictonEndonuclease）第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫斜體；第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫斜體；第四個(gè)字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。

1.限制酶的命名：HindⅢ

屬種

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶*35Ⅰ和Ⅲ型限制酶通常是相對(duì)分子量較大的多亞基蛋白質(zhì)復(fù)合物，同時(shí)具有內(nèi)切酶和甲基化酶活性，反應(yīng)過(guò)程中需有Mg2+和ATP參與。Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型（基因工程技術(shù)中常用Ⅱ型）。

2.限制酶的分類：Ⅱ型限制酶通常以同源二聚體形式存在，只具有核酸內(nèi)切酶活性而無(wú)甲基化酶活性，反應(yīng)過(guò)程中只需有Mg2+參與而不需有ATP參與。*36Ⅱ類酶識(shí)別序具有回文結(jié)構(gòu)(palindrome)特點(diǎn)，

即具有雙重旋轉(zhuǎn)對(duì)稱結(jié)構(gòu)的兩條DNA鏈的堿基序列的反向重復(fù)。

3.Ⅱ型限制酶的作用特點(diǎn)：(1)基本特性：大部分Ⅱ型限制酶都能識(shí)別由4~8個(gè)核苷酸組成的特定序列。*37*38圖20-3限制酶EcoRⅠ對(duì)雙鏈DNA分子的切割作用BamHⅠGGATCCCCTAGGGTCCAGGACCTG+平端切口GCCTAGGATCCG+粘端切口HindⅡGTCGACCAGCTG平或鈍末端（bluntend)粘性末端（stickyend)切口：平端切口、粘端切口*39GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ(2)同裂酶來(lái)源不同但能識(shí)別相同序列的酶，又稱同功異源酶。*40BamHⅠBg

lⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAGGATCTA(3)同尾酶識(shí)別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的黏性末端，這類限制性內(nèi)切酶稱為同尾酶。這兩個(gè)相同的黏性末端稱為配伍未端(compatibleend)。*41(4)可變酶識(shí)別DNA序列中的一個(gè)或幾個(gè)堿基是可變的，并且識(shí)別序列往往超過(guò)6個(gè)核苷酸。為Ⅱ型限制酶的特例。

如：BstpⅠGGTNACC

CCANTGG*42

如：BblⅠCGGN(N)4CCG;

GCC(N)4NGGC

4.限制酶的應(yīng)用及影響因素(1)限制酶的應(yīng)用重組DNA技術(shù)、基因組DNA物理圖譜繪制、基因組DNA同源性研究、切割基因組DNA或cDNA構(gòu)建基因組文庫(kù)或cDNA文庫(kù)等。(2)影響限制酶作用的因素

DNA純度、結(jié)構(gòu)及甲基度程度；酶切反應(yīng)的溫度、時(shí)間及緩沖液體系等。*43

只能封閉DNA鏈上的缺口（nick）,而不能封閉裂口（gap）。

是一種能夠催化在兩條DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵的酶。

(二)DNA連接酶(DNAligase)需要在一條DNA鏈的3末端具有游離的羥基、另一條DNA鏈的5末端有磷酸基團(tuán)，而且反應(yīng)過(guò)程需要由ATP提供能量。*44(2)T4DNA連接酶

連接的底物可以是兩個(gè)雙鏈DNA分子的互補(bǔ)黏性末端或平末端。最早是從T4噬菌體感染的大腸埃希菌分離，易制備，應(yīng)用廣。

1.DNA連接酶的類型：(1)大腸埃希菌DNA連接酶

只能連接具有互補(bǔ)黏性末端的兩個(gè)雙鏈DNA分子底物。需要NAD+作為輔助因子。*45連接黏性末端作用模式圖：*******GAATTC*****************CTTAAG**********5′3′5′3′EcoRIDNA連接酶*********G*********CTTAA5′3′3′5′—OH—PAATTC*********G*********5′3′3′5′—P

OH—+*46連接平末端作用模式圖：*************AGCT***************************TCGA**************5′3′5′3′AluIT4DNA連接酶—OH—P5′3′3′5′************TC************AG5′3′3′5′

OH——PCT*************GA*************+*47(1)DNA連接酶應(yīng)用

2.DNA連接酶的應(yīng)用及影響因素：催化兩個(gè)具有黏性末端或平末端的DNA片段形成磷酸二酯鍵，形成新的重組DNA分子；接合由復(fù)制叉上不連續(xù)復(fù)制鏈上產(chǎn)生的缺口；縫合DNA損傷修復(fù)、遺傳重組及DNA鏈剪接中缺口。*48(2)影響DNA連接酶作用的因素①對(duì)黏性末端的連接效率遠(yuǎn)高于對(duì)平末端的連接；*49②連接黏性末端的溫度一般在4~15℃；③連接酶的用量，平末端連接用量高；④ATP濃度一般為0.01~1mmol/L;⑤載體分子與插入片段的摩爾數(shù)比為1:10~1:3。

(三)DNA聚合酶能夠催化以DNA或RNA為模板合成DNA的反應(yīng)，把脫氧核糖核苷酸連續(xù)地添加到雙鏈DNA分子或引物鏈的3′-OH末端，催化核苷酸的聚合作用。1.大腸埃希菌DNA聚合酶Ⅰ2.Klenow片段具有53聚合酶，53及35核酸外切酶活性。具有53聚合酶，35核酸外切酶活性。*503.TaqDNA聚合酶4.反轉(zhuǎn)錄酶：依賴RNA的DNA聚合酶。具有53聚合酶，53核酸外切酶活性，對(duì)Mg2+濃度非常敏感。是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的、耐熱的、依賴DNA的DNA聚合酶，

最佳反應(yīng)溫度為70~75℃。

普遍使用的是來(lái)源于AMV(鳥類成髓細(xì)胞白血病病毒)及M-MLV(莫洛尼鼠白血病病毒)的反轉(zhuǎn)錄酶，具有53聚合酶。*511.末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（terminaldeoxynucleotidyl

transferase）

(四)

其它修飾酶是一種無(wú)需模板的DNA聚合酶，催化脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移到單鏈或雙鏈DNA分子的3′-OH末端上。(1)底物是單鏈DNA或有3′突出末端的雙鏈DNA。5′3′OHMg2+dNTPnppi5′3′(A/G/C/T)n*52(2)底物是3’平端或3’凹端的雙鏈DNA。Co2+dNTPnppi5′3′OH5′3′(A/G/C/T)nCo2+dNTPnppi5′3′OH5′3′(A/G/C/T)n用途：

（1）主要作用是在載體或目的基因3’末端加上同源多聚尾巴，形成人工黏性末端，便于DNA重組。（2）DNA3’末端的同位素標(biāo)記。*53

2.堿性磷酸酶（alkalinephosphatase）能特異地切除DNA、RNA和dNTP上5’-磷酸基團(tuán)。

3.多核苷酸激酶（polynuleotidekinase）又稱T4多核苷酸激酶，能催化ATP的γ-磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到DNA或RNA片段的5’-OH末端。*54重組DNA技術(shù)中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰5′磷酸和3′羥基間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個(gè)DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ①缺口合成；②雙鏈cDNA分子或片段連接；③平移制作高比活探針；④DNA序列分析；⑤填補(bǔ)3′末端TaqDNA聚合酶具有DNA聚合酶I的53聚合、53外切活性。常用于DNA的合成反轉(zhuǎn)錄酶①合成cDNA；②替代DNA聚合酶I進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶在3′羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基

(一)目的基因的獲取—分1.化學(xué)合成法要求已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列。2.PCR或RT-PCR要求已知目的基因的全序列或基因片段兩側(cè)的DNA序列。3.從基因組文庫(kù)中篩選要求建有或購(gòu)有g(shù)DNA文庫(kù)或cDNA文庫(kù)。*56五、目的基因的獲得和重組載體的構(gòu)建思考題21.化學(xué)合成法*已知氨基酸序列推測(cè)可能的DNA序列。*57**避免使用稀缺密碼子，及宿主細(xì)胞的密碼偏好。反轉(zhuǎn)錄AAnATTnT5′5′mRNA反轉(zhuǎn)錄酶mRNAcDNA3′TTnTAAnA核糖核酸酶HTTnT3′DNApolyIcDNA核酸酶S1雙鏈cDNA3′5′3′5′5′加熱變性加入特異性引物DNA聚合酶重復(fù)上述步驟擴(kuò)增出大量的產(chǎn)物聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)退火延伸2.PCR或RT－PCRmRNAcDNA雙鏈cDNA重組cDNA分子反轉(zhuǎn)錄酶載體受體菌復(fù)制(1)cDNA文庫(kù)構(gòu)建

cDNA文庫(kù)存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有cDNA的集合。*59含重組cDNA分子的轉(zhuǎn)化菌λgt10/11系列噬菌體載體(插入型，適用于cDNA文庫(kù)構(gòu)建)

3.從基因文庫(kù)中篩選限制酶切位點(diǎn)限制酶消化cosLRcoscosL左臂Rcos右臂限制酶部分消化外源DNA與載體DNA混合連接反應(yīng)體外包裝用重組噬菌體感染大腸桿菌~7KbDNA片段cosLRcos~7Kb外源cDNA片段cDNA文庫(kù)λgt10/11系列(插入型，適用于cDNA克隆)cDNA片段*60組織或細(xì)胞染色體DNA基因片段克隆載體重組DNA分子含重組DNA分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶包裝、受體菌基因組DNA文庫(kù)存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有g(shù)DNA的集合。(2)

gDNA文庫(kù)構(gòu)建*61EMBL3/4系列噬菌體載體(置換型，適用于基因組DNA文庫(kù)構(gòu)建)限制酶切位點(diǎn)限制酶消化除去中間片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色體DNA限制酶部分消化外源DNA與載體DNA混合連接反應(yīng)體外包裝用重組噬菌體感染大腸桿菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段gDNA文庫(kù)EMBL3/4系列(置換型，適用于基因組DNA文庫(kù)構(gòu)建)*62gDNA文庫(kù)：g-文庫(kù)cDNA文庫(kù)：c-文庫(kù)方法：

用目的基因上的一段DNA做成探針與文庫(kù)中的DNA作核酸雜交，從基因文庫(kù)中“釣出”有目的基因的克隆。(3)從基因文庫(kù)中篩選目的基因*63Screeningagenomiclibrarybycolonyhybridization.

(二)重組載體的構(gòu)建—接在分別獲得了目的基因DNA片段及純化的質(zhì)粒閉環(huán)載體后，還要利用凝膠電泳分別將目的片段和載體片段分離純化后才相互連接為重組體。(1)

目的基因和載體的限制酶切設(shè)計(jì)和應(yīng)用(2)目的基因和線狀載體DNA片段分離和回收(3)目的基因與載體的連接BamHⅠ切割反應(yīng)GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶，15oC+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體目的基因自連載體自連

1.黏性末端連接(1)同一限制酶切位點(diǎn)連EcoRⅠ切割位點(diǎn)BglⅡ切割位點(diǎn)+EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切T4

DNA連接酶，15oC重組體(2)不同限制酶切位點(diǎn)連*67目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶，15oC重組體載體自連目的基因自連

2.平末端連接

*68EcoRⅠCCGAATTCGGGCTTAAGC5′-3′-EcoRⅠ由平端加上新的酶切位點(diǎn)，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進(jìn)行粘端連接。

3.人工接頭(linker)連接*695′3′3′5′載體DNA5′3′3′5′目的基因限制酶或機(jī)械剪切限制酶5′3′3′5′5′3′T(T)nTT(T)nT3′5′5′

3′3′5′λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶+dATP末端轉(zhuǎn)移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA連接酶15oC重組體3′A(A)nA

A(A)nA3′5′5′

4.同聚物加尾連接*70PCR擴(kuò)增+3′3′5′PCR產(chǎn)物AA5′T載體TT5′5′3′3′連接轉(zhuǎn)化藍(lán)白篩選Taq酶5.T-A克隆*71

(一)重組DNA分子的導(dǎo)入—轉(zhuǎn)宿主細(xì)胞應(yīng)具備的特征：①處于感受態(tài)②對(duì)載體無(wú)嚴(yán)格限制③限制酶和重組酶缺陷④不對(duì)外源DNA進(jìn)行修飾⑤能表達(dá)重組體所提供表型特征將體外構(gòu)建的重組DNA分子導(dǎo)入用于復(fù)制、擴(kuò)增和表達(dá)的原核或真核受體細(xì)胞。*72六、重組載體的導(dǎo)入、鑒定和表達(dá)1.轉(zhuǎn)化(transformation)

指將質(zhì)粒DNA或以質(zhì)粒為載體構(gòu)建的重組DNA導(dǎo)入細(xì)菌（原核細(xì)胞）的過(guò)程。如大腸桿菌K12突變株低滲CaCl2,0℃處理進(jìn)入感受態(tài)。2.轉(zhuǎn)染(transfection)

指將噬菌體、病毒或以它們?yōu)檩d體構(gòu)建的重組DNA分子導(dǎo)入真核細(xì)胞的過(guò)程。3.感染(infection)

指以人工改造的噬菌體或病毒為載體構(gòu)建的重組DNA，經(jīng)體外包裝成具有感染性的噬菌體或病毒顆粒后，通過(guò)感染宿主細(xì)胞而借助外殼蛋白將重組DNA注入到細(xì)菌或真核細(xì)胞內(nèi)復(fù)制擴(kuò)增的過(guò)程。*731.磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染2.DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染3.脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染4.電穿孔轉(zhuǎn)染5.顯微注射2.轉(zhuǎn)染(transfection)*74非轉(zhuǎn)化子(不能生長(zhǎng)）單抗生素篩選轉(zhuǎn)化子陽(yáng)性重組子自身環(huán)化載體未酶解完全載體非目的基因插入載體(1)根據(jù)載體的耐藥性標(biāo)記（初步）篩選

1.根據(jù)重組載體的遺傳表型進(jìn)行篩選

(二)重組DNA分子的篩選與鑒定—篩*75(2)根據(jù)載體的耐藥性標(biāo)記插入失活選擇例：載體中的Tetr基因被目的基因插入而失去活性，不能表達(dá)抗Tet蛋白，故細(xì)菌不能在含Tet的培養(yǎng)基中存活。*76Atypicalbacterialtransformationexperiment.用PstI酶切DNA連接酶重組質(zhì)粒目的基因AmprTetrPstI目的基因與pBR322經(jīng)PstI酶切后進(jìn)行重組如何篩選得到陽(yáng)性克隆？課堂討論*78ApmrMCSLacZ’在LacZ’中插入目的基因(3)根據(jù)β-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)篩選*79

α互補(bǔ)的檢測(cè)*80組氨酸缺陷型大腸桿菌無(wú)組氨酸的培養(yǎng)基咪唑甘油磷酸脫水酶促進(jìn)組氨酸合成λDNA重組體標(biāo)志補(bǔ)救(4)根據(jù)篩選插入的外源基因的性狀進(jìn)行篩選*812.限制性內(nèi)切酶酶切電泳鑒定4.PCR3.核酸分子雜交法

用插入點(diǎn)的限制酶酶切重組DNA，行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)是不有目的基因和載體的泳帶來(lái)判斷重組成功與否。

是從基因文庫(kù)中挑選含有目的基因的陽(yáng)性克隆的常用方法。

根據(jù)MCS兩側(cè)的保守序列設(shè)計(jì)引物，對(duì)提取的重組載體進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，并可直接進(jìn)行測(cè)序。*825.免疫化學(xué)檢測(cè)法利用特異性抗體與目的基因表達(dá)的蛋白質(zhì)相互結(jié)合通過(guò)放射免疫、化學(xué)發(fā)光來(lái)篩選轉(zhuǎn)化菌。思考題3重組DNA技術(shù)操作的主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）gDNA文庫(kù)cDNA化學(xué)合成RT-PCR限制酶消化開環(huán)載體DNA目的基因連接酶重組體轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定核酸分子雜交法*83

表達(dá)體系的建立包括表達(dá)載體的構(gòu)建、受體細(xì)胞的建立和表達(dá)產(chǎn)物的分離、純化等技術(shù)和策略。

外源基因表達(dá)涉及目的基因的克隆、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋白質(zhì)產(chǎn)物的加工及分離純化等過(guò)程，需要在適合的表達(dá)系統(tǒng)中完成。表達(dá)系統(tǒng)可根據(jù)受體細(xì)胞的不同分為原核表達(dá)系統(tǒng)和真核表達(dá)系統(tǒng)。*84（三）重組載體的表達(dá)產(chǎn)品功能組織胞漿素原激活劑抗凝血液因子VIII促進(jìn)凝血顆粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落剌激因子剌激白細(xì)胞生成促紅細(xì)胞生成素剌激白細(xì)胞生成生長(zhǎng)因子(bFGF,EGF)刺激細(xì)胞生長(zhǎng)與分化生長(zhǎng)素治療侏儒癥胰島素治療糖尿病干擾素(1b,2a,2b,)抗病毒感染及某些腫瘤白細(xì)胞介素激活、剌激各類白細(xì)胞超氧化物歧化酶抗組織損傷單克隆抗體利用其結(jié)合特異性進(jìn)行診斷試驗(yàn)、腫瘤導(dǎo)向治療乙肝疫苗(CHO,酵母)預(yù)防乙肝口服重組B亞單位菌體霍亂菌苗預(yù)防霍亂

重組DNA醫(yī)藥產(chǎn)品

----大腸桿菌（E.coli）表達(dá)體系最常用優(yōu)點(diǎn):*86（1）原核表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)缺點(diǎn)培養(yǎng)方法簡(jiǎn)單、迅速、經(jīng)濟(jì)而又適合大規(guī)模生產(chǎn)。1.重組載體在原核細(xì)胞中的表達(dá)①只適合于表達(dá)克隆的cDNA，不宜用于表達(dá)真核基

因組DNA；

②表達(dá)的真核蛋白不能形成正確的折疊和修飾；③真核蛋白常以無(wú)生物活性的包含體形式存在；④難以實(shí)現(xiàn)大量分泌性蛋白的表達(dá)；⑤真核蛋白不穩(wěn)定，易被細(xì)菌蛋白酶降解；⑥原核細(xì)胞周質(zhì)中常含有種類繁多的內(nèi)毒素。*87缺點(diǎn):

(2)對(duì)外源目的基因的要求①外源真核基因不能帶有5′端非編碼區(qū)和內(nèi)含子結(jié)

構(gòu)，必須用cDNA或化學(xué)合成基因；②外源基因必須置于原核細(xì)胞的強(qiáng)啟動(dòng)子和SD序列

等元件控制下；③重組載體必須形成正確的開放閱讀框架；④外源基因轉(zhuǎn)錄生成的mRNA必須相對(duì)穩(wěn)定并能被有

效翻譯，所表達(dá)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物穩(wěn)定不能對(duì)宿主菌