實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝臟DNA提取

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝臟DNA提取第一頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、掌握動(dòng)物組織總DNA的特性2、掌握動(dòng)物組織總DNA提取方法及其原理。第二頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日二、實(shí)驗(yàn)原理:要獲得純的DNA樣品，必須考慮以下幾點(diǎn)：如何選材，如何破碎組織細(xì)胞？如何除去蛋白質(zhì)？(在真核細(xì)胞內(nèi)，DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合成核蛋白的形式存在。因此，分離DNA時(shí)必須使其與蛋白質(zhì)解離，并除去蛋白質(zhì)。)設(shè)法除去RNA的污染；防止DNA酶的降解作用；（一）動(dòng)物肝臟DNA制備原理第三頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日選材要提取動(dòng)物組織DNA，一般選擇細(xì)胞膜較脆弱，容易破碎的動(dòng)物臟器，如胸腺、肝臟、脾臟、胰臟等。第四頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日研磨：將剪碎的動(dòng)物組織置于研缽或勻漿器中，加入少量石英砂研磨或勻漿，破碎細(xì)胞。這種方法溫和，適合實(shí)驗(yàn)室使用。組織搗碎器：較劇烈的破碎細(xì)胞的方法，為了防止發(fā)熱和升溫過(guò)高，通常是轉(zhuǎn)10秒—20秒，停10秒—20秒，可反復(fù)多次。壓榨法：在1000×105Pa—2000×105Pa的高壓下使幾十毫升的細(xì)胞懸液通過(guò)一個(gè)小孔突然釋放至常壓，細(xì)胞將徹底破碎。溫和的、徹底破碎細(xì)胞的方法，但儀器費(fèi)用較高。細(xì)胞破碎方法—機(jī)械物理法：第五頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日反復(fù)凍融法：將待破碎的細(xì)胞冷至－15℃到－20℃，然后放于室溫(或40℃)迅速融化，由于細(xì)胞內(nèi)形成冰粒使剩余胞液的鹽濃度增高而引起細(xì)胞溶脹破碎。超聲波處理法：借助超聲波的振動(dòng)力破碎細(xì)胞壁和細(xì)胞器。使用時(shí)注意降溫，防止過(guò)熱。冷熱交替法：在90℃左右維持?jǐn)?shù)分鐘，立即放入冰浴中使之冷卻，如此反復(fù)多次，絕大部分細(xì)胞可以被破碎。細(xì)胞破碎方法—機(jī)械物理法第六頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日細(xì)胞破碎方法—化學(xué)方法有機(jī)溶劑處理法：利用氯仿、甲苯等脂溶性溶劑或SDS（十二烷基硫酸鈉）等表面活性劑處理細(xì)胞，可將細(xì)胞膜溶解，從而使細(xì)胞破裂，此法也可以與研磨法聯(lián)合使用。溶脹法：細(xì)胞膜為天然的半透膜，在低滲溶液和低濃度的稀鹽溶液中，由于存在滲透壓差，溶劑分子大量進(jìn)入細(xì)胞，將細(xì)胞膜脹破釋放出細(xì)胞內(nèi)含物。第七頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日(三)除去RNA的方法

脫氧核糖核蛋白在濃NaCl（1-2mol／L）溶液中溶解度很大，但在0.14mol／LNaCl溶液中溶解度很低，而核糖核蛋白則溶于0.14mol／LNaCl溶液中，利用這一性質(zhì)可將脫氧核糖核蛋白與絕大部分核糖核蛋白分離開來(lái)。第八頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日(四)除去蛋白質(zhì)的方法

用氯仿一異戊醇混合液振蕩核蛋白溶液，使蛋白質(zhì)變性，然后離心除去變性蛋白質(zhì)，此時(shí)蛋白質(zhì)凝膠停留在水相及氯仿相中間，而DNA溶于上層水相。用兩倍體積95％乙醇溶液可將DNA鈉鹽沉淀出來(lái)。用十二烷基硫酸鈉（SDS）等去污劑使蛋白質(zhì)變性，可以直接從生物材料中提取DNA。第九頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日純的DNA樣品的獲得為了防止DNA酶的降解，提取時(shí)可加入適量EDTA（乙二胺四乙酸）、檸檬酸，以降低DNA酶的活性。加入RNA酶降解剩余的RNA，獲得純的DNA。保存：將DNA于濾紙上干燥，溶于1mlTE中低溫保存。第十頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日

（二）瓊脂糖凝膠電泳分離核酸的原理：瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂糖凝膠作為支持介質(zhì)的一種電泳分離方法，是一種簡(jiǎn)便、快速分離鑒定核酸的方法，已成為分子生物學(xué)及基因工程研究中常用實(shí)驗(yàn)方法之一。瓊脂糖英文名agarose，是從瓊脂中提取出來(lái)的，由半乳糖和3.6-脫水-L-半乳糖相互結(jié)合的鏈狀多糖。瓊脂糖和瓊脂都可在不同濃度的水溶液下可形成多孔的凝膠，電泳中具有分子篩效應(yīng)。但瓊脂糖含硫酸根比瓊脂少，電滲作用降低，因而分離效果明顯提高。第十一頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日DNA分子在pH高于其等電點(diǎn)的溶液中帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)（電荷效應(yīng)）。DNA分子泳動(dòng)速率的大小除與DNA分子的帶電量有關(guān)外，還與DNA分子的大小和空間構(gòu)象有關(guān)（瓊脂糖凝膠的分子篩效應(yīng)）。電泳時(shí)，用溴酚藍(lán)做前沿指示劑，用溴化乙啶（ethidiumbromide，EB）指示DNA樣品在凝膠中的確切位置。溴化乙啶是一種熒光染料，可插入DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的兩個(gè)堿基對(duì)之間，與DNA分子形成絡(luò)合物，在紫外光的激發(fā)下發(fā)出橙黃色的熒光。第十二頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日熒光來(lái)自兩方面，一是核酸吸收260nm的紫外光，并將能量傳給EB；二是EB本身吸收波長(zhǎng)為302nm和360nm的紫外光。這兩方面的能量最終激發(fā)EB發(fā)出波長(zhǎng)為590nm的紅橙色熒光。溴化乙啶可加入凝膠中，也可以在電泳后，將凝膠放在含EB的溶液中浸泡.溴化乙啶檢測(cè)DNA的靈敏度很高，可檢出10ng甚至更少的DNA。第十三頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日瓊脂糖凝膠電泳分離核酸的影響因素（1）核酸大小與瓊脂糖凝膠電泳分離的關(guān)系

凝膠中，DNA片段遷移率與DNA分子大小(堿基對(duì)的對(duì)數(shù))成反比(≤20kb)，因此通過(guò)已知大小的標(biāo)準(zhǔn)物移動(dòng)的距離與未知片段的移動(dòng)距離時(shí)行比較，便可測(cè)出未知片段的大小。（2）核酸構(gòu)型與瓊脂糖凝膠電泳分離的關(guān)系

不同構(gòu)型DNA的移動(dòng)速度次序?yàn)椋洪]環(huán)DNA>直線DNA>開環(huán)的雙鏈環(huán)狀DNA.（3）不同大小的DNA需要用不同濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離。

瓊脂糖濃度/%

0.3

0.6

0.7

0.9

1.2

1.5

2.0

線狀DNA大小/kb

60-5

20-1

10-0.8

7-0.5

6-0.4

3-0.2

2-0.1

注：DNA片段在5-500bp之間時(shí)，一般用聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）進(jìn)行電泳分離。第十四頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日瓊脂糖凝膠電泳具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）操作簡(jiǎn)單、制備容易快速、凝膠機(jī)械性能好、電泳速度快、分離DNA片段范圍廣、樣品不需事先處理就可以進(jìn)行電泳。

（2）凝膠結(jié)構(gòu)均勻，對(duì)樣品吸附小，電泳圖譜清晰，分辨率高，重復(fù)性好。

（3）瓊脂糖透明無(wú)紫外吸收，電泳過(guò)程和結(jié)果可直接用紫外光檢測(cè)及定量測(cè)定。

（4）電泳后區(qū)帶易染色，樣品極易洗脫，便于定量測(cè)定。制成干膜可長(zhǎng)期保存。

因此，瓊脂糖凝膠電泳已成為分子生物學(xué)及基因工程研究中常用實(shí)驗(yàn)方法之一，DNA樣本的分離、純化、鑒定以及相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定常用瓊脂糖凝膠電泳。第十五頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日

熒光染料EB染色后，在紫外燈(λ305nm)下觀察到的電泳結(jié)果：第十六頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日

*熒光染料EB染色的原理和優(yōu)點(diǎn)是什么？1、原理：

EB：即3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲錠溴鹽(EthidiumBromide)。

EB是一種扁平分子，它可以嵌入核酸的堿基之間，在紫外線激發(fā)下，發(fā)出紅橙色熒光。激發(fā)的熒光的能量來(lái)源于兩個(gè)方面：一是核酸吸收260nm的紫外線后將能量傳遞給EB，二是EB本身吸收302nm和360nm的紫外線的能量。這兩方面的能量最終激發(fā)EB發(fā)射波長(zhǎng)為590nm的可見光（紅橙區(qū)）。第十七頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日2、優(yōu)點(diǎn)：（1）染色比較簡(jiǎn)便、快捷，一般在10－15min就可反應(yīng)。（2）EB對(duì)核酸分子無(wú)破壞作用，這是其它染料所不能做到的。（3）EB靈敏度高，可檢測(cè)出10ng或更少的DNA含量。（4）既可用于DNA也可用于RNA的檢測(cè)。（5）EB可加到樣品中，也可加到凝膠中，可隨時(shí)用紫外燈檢測(cè)電泳的進(jìn)程和效果。（6）EB-DNA復(fù)合物中的EB發(fā)出的熒光比游離的EB強(qiáng)10倍，因此不需洗凈凝膠中游離的EB也可檢測(cè)出DNA的條帶。第十八頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日3、缺點(diǎn)：

溴化乙啶是一種強(qiáng)的致突變劑，在操作和配制試劑時(shí)應(yīng)戴手套。含溴化乙啶的溶液不能直接倒入下水道，應(yīng)進(jìn)行處理。（1）每100ml溶液中加入100mg粉狀活性炭；（2）室溫下放置1小時(shí)，不時(shí)的搖動(dòng)；（3）用新華一號(hào)濾紙過(guò)濾，棄濾液；（4）用塑料袋封裝濾紙和活性炭，作為有害廢物處理。*溴化乙啶在260℃分解，在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行焚化后不會(huì)有危險(xiǎn)性。第十九頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日二、實(shí)驗(yàn)材料、試劑和儀器:

(一)材料：動(dòng)物肝臟

(二)試劑：

（1）0.14mol／LNaCl－0.15mol／LEDTA-Na溶液：（2）20％SDS溶液：（3）氯仿一異戊醇(24:1)混合液：（4）95％乙醇溶液。（5）80％乙醇溶液。（6）pH8.0TE緩沖液：10mmol／LTris－HCI，lmmol／LEDTANa，其中含RNA酶20ug／mL。第二十頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日（7）電泳緩沖液：Tris-硼酸－EDTA（50×TBE）pH8.0。（8）加樣緩沖液：0.25%溴酚藍(lán)（BPB）40%蔗糖。（9）溴化乙啶（EB）溶液：10μg/ml。（10）瓊脂糖凝膠：濃度為0.7%。(三)儀器（1）穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（2）可調(diào)微量移液器

（3）水平電泳槽（4）暗箱紫外透射儀等。第二十一頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日移液器的使用自動(dòng)取液器的構(gòu)造

自動(dòng)取液器的使用

吸入液體

排出液體使用注意事項(xiàng)：不超量程使用；不倒置；使用完畢調(diào)至最大刻度上。第二十二頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日三、實(shí)驗(yàn)步驟：1．取新鮮動(dòng)物肝，稱取1g，切成小塊，加入2ml0.14mol／LNaCl－0.15mol／LEDTA溶液，于研缽中研磨至勻漿，再加2ml清洗轉(zhuǎn)入離心管中，以4000r／min的轉(zhuǎn)速離心10min。第二十三頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日2．在上述沉淀物中加入2mL0.14mol／LNaCl－0.15mol／LEDTA溶液，然后在60℃下，滴加20％SDS溶液3－5滴，邊加邊搖動(dòng)，再搖動(dòng)10min，使核酸與蛋白質(zhì)分離。3.加固體氯化鈉0.2g混勻，使其最終濃度達(dá)到l.4mol／L，水浴30min。第二十四頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日

4．加等體積的氯仿一異戊醇，混勻，搖動(dòng)5min，以4000r／min的轉(zhuǎn)速離心10min。離心管內(nèi)的物質(zhì)分為三層，上層為含DNA的水相層，下層為氯仿一異成醇混合物，中間層為變性蛋白凝膠。第二十五頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日5．吸出上清液，加入2倍體積95％乙醇溶液（預(yù)冷），產(chǎn)生沉淀。6.再以4000r／min的轉(zhuǎn)速離心溶液10min，棄去上清液(沉淀用80％乙醇溶液離心洗滌)。7．將沉淀置于吸水紙上，除盡乙醇，室溫自然干燥后，加入200ul電極緩沖液，使DNA充分溶解，待用。第二十六頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日8.凝膠板的制備：（1）取瓊脂糖0.7