第七章 免疫組織化學(xué)技術(shù)

免疫組織化學(xué)技術(shù)AlbertHewettCoons（1912—1978）20世紀(jì)40年代Coons利用FITC標(biāo)記抗體成功地檢測了小鼠肺臟組織內(nèi)存在的肺炎雙球菌多糖抗原，標(biāo)志著免疫組化技術(shù)的誕生。免疫組織化學(xué)技術(shù)

（Immunohistochemistry）免疫學(xué)技術(shù)與組織化學(xué)技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物，它以抗原抗體特異性反應(yīng)為基礎(chǔ)，并結(jié)合化學(xué)的呈色反應(yīng)，最后在組織/細胞層面原位顯示跟蹤物質(zhì)的位置，綜合反映了靜態(tài)的組織細胞形態(tài)和組成以及動態(tài)的機體功能代謝生理狀態(tài)。第九章免疫組織化學(xué)技術(shù)第一節(jié)免疫組織化學(xué)技術(shù)的類型第二節(jié)免疫組織化學(xué)技術(shù)基本流程第九章免疫組織化學(xué)技術(shù)第一節(jié)免疫組織化學(xué)技術(shù)的類型第二節(jié)免疫組織化學(xué)技術(shù)基本流程免疫組織化學(xué)技術(shù)的類型按標(biāo)記物的不同分類按反應(yīng)方式的不同分類按應(yīng)用方式不同分類1．按標(biāo)記物的不同分類（1）免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)

（immunofluorescencecytochemistry）（2）免疫酶組織化學(xué)技術(shù)

（immunoenzymaticcytochemistry）（3）免疫鐵蛋白組織化學(xué)技術(shù)

（immunoferritincytochemistry）（4）免疫膠體金組織化學(xué)技術(shù)

（immuno-colloidalgoldcytochemistry）（5）放射免疫組織化學(xué)技術(shù)

（radio-immunocytochemistry）２．按反應(yīng)方式的不同分類（1）直接標(biāo)記法（directlabeling）（2）間接標(biāo)記法（indirectlabeling）（3）抗體橋聯(lián)法（immunobridge）（4）抗酶抗體法（peroxidase-antiperoxidase）（5）半抗原夾心法（haptensandwich）（6）葡萄球菌蛋白介導(dǎo)的免疫組織化學(xué)方法

（proteinAimmunocytochemistry）（7）生物素-親合素系統(tǒng)介導(dǎo)的免疫組織化學(xué)方法

（biotin-avidinsystemcytochemistry）3．按應(yīng)用方式不同分類（1）免疫電鏡組化技術(shù)

（immunoelectromicroscopycytochemistry）（2）雙標(biāo)記或多重染色組化技術(shù)

（doublelabelingcytochemistry）（3）定量免疫組化技術(shù)

（quantitativeimmunocytochemistry）（4）原位雜交與免疫組化技術(shù)（insitehybridizationandimmunocytochemistry）第九章免疫組織化學(xué)技術(shù)第一節(jié)免疫組織化學(xué)技術(shù)的類型第二節(jié)免疫組織化學(xué)技術(shù)基本流程免疫組織化學(xué)技術(shù)基本流程一、樣品的制備二、抗原抗體反應(yīng)三、化學(xué)呈色反應(yīng)四、免疫組織化學(xué)結(jié)果及其分析免疫組織化學(xué)技術(shù)基本流程一、樣品的制備二、抗原抗體反應(yīng)三、化學(xué)呈色反應(yīng)四、免疫組織化學(xué)結(jié)果及其分析組織的取材動物標(biāo)本手術(shù)活檢標(biāo)本尸體解剖標(biāo)本細胞標(biāo)本動物的處死空氣栓塞法麻醉法斷頭法頸椎脫臼股/頸動脈放血法取材注意事項迅速干脆注意保持組織的完整性和代表性活檢標(biāo)本注意區(qū)別病變組織、邊緣組織和正常組織腎穿刺標(biāo)本小標(biāo)本細胞的取材

（Drawingmaterials）印片穿刺涂片體液沉淀涂片培養(yǎng)細胞組織切片技術(shù)冰凍切片石蠟切片取材固定洗滌和脫水透明浸蠟包埋切片與粘片烤片

脫蠟水化染色封片

固定

（Fixation）將組織置于某些化學(xué)試劑中，使細胞內(nèi)的物質(zhì)盡量接近于原始狀態(tài)的形態(tài)結(jié)構(gòu)和位置。組織細胞的固定

（Fixation）要求：完整性、天然性、抗原性、便于后期操作策略：快速脫水、阻斷酶活、保持抗原性試劑：醛、醇、酮、酸方法：浸泡法、灌流法、微波固定法抗原分類不穩(wěn)定抗原細胞表面標(biāo)志半穩(wěn)定抗原B細胞表面IgG較穩(wěn)定抗原小分子蛋白，多肽類常用固定液簡單固定液福爾馬林（4%甲醛）、乙醇（80-95%）、氯化汞（5-7%）、苦味酸（0.9-1.2%）、重鉻酸鉀（1-3%）、鉻酸（0.5-1%）、鋨酸（1-2%）、丙酮混合固定液中性甲醛、乙醇甲醛、4%多聚甲醛-磷酸緩沖液、4%多聚甲醛-氫氧化鈉、Carnoy液（冰醋酸、氯仿、乙醇）、Bouin液（苦味酸、甲醛、冰醋酸）、Zenker液（升汞、重鉻酸鉀、蒸餾水、冰醋酸）、PLP（過碘酸鹽-賴氨酸-多聚甲醛）固定劑選擇血涂片：丙酮，福爾馬林（胞質(zhì)蛋白，BCR）細胞涂片：95%乙醇、carbowax.冰凍切片：乙醇、丙酮、多聚甲醛石蠟切片：福爾馬林（需抗原修復(fù)）、氯化汞（胞漿蛋白）PLP/PLDP（糖類、脂類）、乙醇、丙酮固定方法浸泡法蒸汽法注射、灌注法微波固定注意事項固定液的量固定的條件（溫度、濃度、時間）組織提取組織塊的體積固定后的清洗組織的脫水目的：去除組織中的水分，便于后期的有機溶劑處理。方法：有機溶劑逐級吸收試劑：乙醇、丙酮、正丁醇、叔丁醇、環(huán)己酮、松脂醇組織的透明目的：便于浸蠟包埋方法：逐級浸泡試劑：二甲苯、甲苯、氯仿、香柏油、苯甲酸甲酯、苯胺油浸蠟、包埋一般光學(xué)顯微鏡觀察的切片，用石蠟、火棉膠、炭蠟、明膠等作包埋劑；電子顯微鏡則用環(huán)氧樹脂、聚苯乙烯樹脂、異丁烯樹脂及水溶性樹脂組織切片載玻片處理黏片劑明礬-明膠、多聚賴氨酸、樹脂、甲醛-明膠等免疫組織化學(xué)技術(shù)基本流程一、樣品的制備二、抗原抗體反應(yīng)三、化學(xué)呈色反應(yīng)四、免疫組織化學(xué)結(jié)果及其分析抗原抗體反應(yīng)抗原的暴露和修復(fù)酶消化技術(shù)熱誘導(dǎo)修復(fù)技術(shù)抗體孵育抗原修復(fù)抗原修復(fù)緩沖液0.01MTRIS-HCLPh1/10胰蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶（細胞間抗原）、鏈霉蛋白酶、無花果蛋白酶熱誘導(dǎo)修復(fù)微波、滅菌鍋、蒸汽、壓力鍋、水浴70-100度（10-60min）注意事項：自然冷卻、避免蒸干、條件統(tǒng)一，結(jié)構(gòu)改變，適當(dāng)加入螯合劑免疫組織化學(xué)技術(shù)基本流程一、樣品的制備二、抗原抗體反應(yīng)三、化學(xué)呈色反應(yīng)四、免疫組織化學(xué)結(jié)果及其分析染色策略ABCPROCEDUREUTILIZINGCATALYZEDSIGNALAMPLIFICATION(CSA)biotinyl-tyramide顯色系統(tǒng)DAB顯色液AEC顯色液（顯色為紅色）Hanker-yater試劑（藍黑色）TMB顯色液（脂溶性，顯色為藍色）顯色效果的提高蛋白酶消化抗原修復(fù)高敏感顯色方法的使用放射免疫組織化學(xué)技術(shù)免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)免疫酶組織化學(xué)技術(shù)雙標(biāo)記或多重染色組化技術(shù)免疫電鏡組化技術(shù)原位雜交技術(shù)膀胱癌和癌旁組織上用ADAM12T3反義探針檢測到陽性雜交信號(C,D)，而正義探針在癌旁的正常組織中只見到很弱或陰性信號(E,F)。D和F分別是C和D的黑視野圖像。免疫組化定量免疫組化技術(shù)免疫組織化學(xué)技術(shù)基本流程一、樣品的制備二、抗原抗體反應(yīng)三、化學(xué)呈色反應(yīng)四、免疫組織化學(xué)結(jié)果及其分析染色對照表達特異性陰性結(jié)果判斷出血、壞死、邊緣部位的判定綜合評價染色結(jié)果四、免疫組織化學(xué)結(jié)果及其分析陽性對照陰性對照陰性組織陰性試劑（無關(guān)抗體、反向吸收、抑制試驗）自身對照對照的設(shè)定非特異性染色組織內(nèi)源性干擾標(biāo)記物干擾抗體干擾組織處理不當(dāng)組織內(nèi)源性干擾自發(fā)和誘發(fā)熒光膠原纖維和彈力纖維藍綠色軟骨和角蛋白呈黃綠色脂褐素呈棕黃色甲醛固定后的腎上腺素，5羥色胺組織內(nèi)源性干擾內(nèi)源性過氧化物酶內(nèi)源性生物素標(biāo)記物干擾熒光素（F/P>2）HRP（RZ>3）親和素（優(yōu)先使用鏈霉親和素）抗體干擾抗體的非特異吸附免疫原的交叉反應(yīng)IgG之間的交叉反應(yīng)天然抗體交叉反應(yīng)組織處理不當(dāng)血清及分泌性抗原干擾組織固定不及時流程操作不規(guī)范非特異性熒光的消除襯染法（伊文思藍抑制自發(fā)熒光）熒光抗體（純化）胰蛋白酶消化吸收血清孵育雙重標(biāo)記提高抗體質(zhì)量非特異性染色的消除抗體特異性不好：提高免疫抗原純度，組織吸收，采用單克隆抗體連接抗體：提高二抗純度酶標(biāo)抗體：避免Fc受體的結(jié)合，醛基的著色DAB：含有雜質(zhì)及沉淀抗體濃度：結(jié)締組織假陰性結(jié)果試劑缺少二抗不匹配抗體失效抗體濃度過低抗體干涸抗原修復(fù)失敗酶處理時間太長染色時間過短，酶活性小疊氮化鈉抑制HRP顯色液失效顯色緩沖液沖突陽性對照錯誤陽性不強固定不當(dāng)抗體反復(fù)凍融抗體濃度過低緩沖液殘留過多抗原修復(fù)不徹底底物失效顯色時間過短，疊氮化鈉干擾緩沖液不匹配復(fù)染、脫水、封片劑與顯色系統(tǒng)的干擾抗原表達少

染色過強抗體濃度過高顯色時間過長組織封閉效果不好洗滌時間及次數(shù)不夠過氧化氫阻斷不足切片上的雜質(zhì)洗滌不徹底DAB析出二甲苯不及時更換固定時間過長燃料沉淀抗原未按預(yù)期表達封閉不當(dāng)一抗過高二抗交叉反應(yīng)蛋白酶消化過度抗原熱修復(fù)過度