第十四章+維生素類藥物的分析

第十四章

維生素類藥物的分析維生素類藥物的分析維生素維持人類機體正常代謝功能所必須的一類活性物質(zhì),主要用于機體的能量轉(zhuǎn)移和代謝調(diào)節(jié),體內(nèi)不能合成,須從食物中攝取。通俗來講，即維持生命的物質(zhì)，是維持人體生命活動必須的一類有機物質(zhì)，也是保持人體健康的重要活性物質(zhì)。維生素在體內(nèi)的含量很少，但不可或缺。維生素類藥物的分析維生素醇從化學(xué)結(jié)構(gòu)上來講，維生素類均屬于有機化合物，但并非同一類化合物。酯酸胺酚醛各具有不同的理化性質(zhì)和生理作用按溶解度分維生素類藥物的分析方法生物法微生物法化學(xué)法物理化學(xué)法都是依據(jù)藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)與生物特性來進行分析AB1CDEVitaminsContents主要講解維生素A是一種不飽和脂肪醇，在自然蜀中主要來源于鮫類海魚肝臟中提取的脂肪油（魚肝油）。具有多種異構(gòu)體，有不同的名稱，其中活性最好的是維生素A1，也是通常所指的維生素A第一節(jié)VitA維生素A具有一個共軛多烯醇側(cè)鏈的環(huán)已烯，具有多個異構(gòu)體維生素A具有一個共軛多烯醇側(cè)鏈的環(huán)已烯，具有多個異構(gòu)體維生素A醇（Retinol)維生素A具有一個共軛多烯醇側(cè)鏈的環(huán)已烯，具有多個異構(gòu)體維生素A醋酸酯

（VitaminAAcetate)維生素A具有一個共軛多烯醇側(cè)鏈的環(huán)已烯，具有多個異構(gòu)體維生素A棕櫚酸酯

（VitaminAPalmitate)維生素A具有一個共軛多烯醇側(cè)鏈的環(huán)已烯，具有多個異構(gòu)體去氫維生素A

（A2dehydroretinol)維生素A具有一個共軛多烯醇側(cè)鏈的環(huán)已烯，具有多個異構(gòu)體去水維生素A

（A3anhydroretinol)912345678Retinol(VitAalcohol)VAacetateVApalmitate一、主要性質(zhì)溶解性:與三氯甲烷、乙醚、環(huán)已烷或石油醚能任意混合，在乙醇中微溶，在水中不溶。不穩(wěn)定性：含有多個不飽和鍵，性質(zhì)不穩(wěn)定，易被被空氣中氧或氧化劑氧化，易被紫外光裂解，特別是在加熱和金屬離子存在時更易氧化變質(zhì)從而失活。紫外吸收：共軛多烯醇側(cè)鏈結(jié)構(gòu)，在325-328nm之間有最大吸收，可用于鑒別與三氯化銻呈色:三氯甲烷+三氯化銻=不穩(wěn)定的藍(lán)色二、鑒別試驗VitASbCl3CHCl3(無水無醇)藍(lán)色紫紅色1.三氯化銻反應(yīng)(Carr-Price反應(yīng))維生素A和氯化銻中存在的親電試劑氯化高銻作用形成不穩(wěn)定的藍(lán)色碳正離子反應(yīng)應(yīng)在無水無醇條件下進行。因為水可使三氯化銻水解，而乙醇可以使碳正離子作用使其正電荷消失而使反應(yīng)不能進行。Notice2.UVVitA維生素A在無水乙醇鹽酸溶液中溶解,立即進行UV掃描,在360nm處有一最大吸收峰.如1.水浴加熱30s,迅速冷卻,此過程發(fā)生脫水反應(yīng),掃描時出現(xiàn)三個吸收峰VitA3.TLC：三氯化銻顯色，磷鉬酸顯色維生素A去水維生素A最大吸收峰向長波方向移動：紅移三、含量測定維生素A的測定CHP收載三種HPLC法UV三氯化銻法UV維生素A?；煊须s質(zhì)，包括多種異構(gòu)體，氧化降解產(chǎn)物，合成中間體，副產(chǎn)物等以及常用稀釋油類。都有紫外吸收，干擾測定。咋辦呢？請用三點校正法！維生素A在325-328nm的波長范圍內(nèi)具有最大吸收，其最大吸收峰的位置隨溶劑的不同而異。如下：AnmVitAsamplepureVAacetateimpurities測定原理雜質(zhì)的無關(guān)吸收在310~340nm波長范圍內(nèi)呈一條直線，且隨波長的增大吸收度減??；物質(zhì)對光的吸收具有加和性的原理。波長的選擇：（1）1

VitA的max（328nm）（2）23

分別在1的兩側(cè)各選一點測定對象VitA醋酸酯第一法等波長差法第二法等吸收比法測定對象VitA醇測定方法一、基本步驟第一步：選擇A

（A328或A328(校正后)）選擇依據(jù)——所選A值中雜質(zhì)的干擾已基本消除第二步：求第三步：求效價（每克供試品所含維生素A的國際單位數(shù)）規(guī)定具體步驟測定A1IU=0.344μgVitA醋酸酯1gVitA醋酸酯=106μg/0.344(μg/IU)=2.907×106IU

VitA

醋酸酯換算因子=1900第四步：求標(biāo)示量(百分)Why?第四步：求標(biāo)示量這是因為標(biāo)示量是以效價的形式存在的第四步：求標(biāo)示量測定含量單位質(zhì)量1g對應(yīng)的效價效價占單位樣品質(zhì)量的百分比效價占單位質(zhì)量的百分比經(jīng)過變形可得下式第四步：求標(biāo)示量測定方法這是因為標(biāo)示量是以效價的形式存在的方法：二、

直接測定法維生素A醋酸酯判斷是否在326～329nm之間在326～329nm之間改用第二法是否求算并與規(guī)定值比較

規(guī)定值差值

判斷差值是否超過規(guī)定值的有一個以上超過無超過

計算A328（校正）

用A328計算A328不校正?A=A328校正?第二法?三、皂化法

——VitAalcohol（6/7)①樣品前處理酯乙醚提取VA醇，洗滌，過濾異丙醇溶解殘渣在300，310，325，334nm處分別測Ai②λmax應(yīng)為325nm。若λmax不在323～327nm之間，則供試品中雜質(zhì)含量過高，改為色譜法將未皂化部分純化后進行測定。③計算，選擇AA.若(A300/A325)≤0.73A325不校正?A=A325校正?A325(校正)=6.815A325-2.555A310-4.260A334B.若(A300/A325)>0.73色譜法純化后再測應(yīng)用示例一VitAD膠丸中VitA的含量測定精密稱取本品(規(guī)格10,000VitAIU/丸)裝量差異項下（平均裝量0.07985g/丸）的內(nèi)容物0.1287g至50ml量瓶中，用環(huán)己烷稀釋至刻度，搖勻；精密量取2.0ml，置另一50ml量瓶中，用環(huán)己烷稀釋至刻度，搖勻。以環(huán)己烷為空白，測定最大吸收波長為328nm，并在下列波長處測得吸收度如下，計算VitA的標(biāo)示量百分含量。A=A328校正應(yīng)用示例二稱取VitA滴劑0.1082g(標(biāo)示量50000I.U./g)，加環(huán)已烷至50.0ml，取出5.0ml置于另一50ml量瓶中，加環(huán)已烷至刻度，搖勻后置石英比色皿中，以環(huán)已烷為空白，分別于以下波長處測得相應(yīng)的吸收度值，試求此滴劑中VitA的標(biāo)示量百分率：A=A328校正(二)HPLCRF-HPLC同時測定人血清中VitA和VitE含量色譜條件

色譜柱：C18

流動相：甲醇-水流速：1.2ml/min

檢測波長與AUFS：

0～8min(330nm);8min后(292nm)

內(nèi)標(biāo)：VitA酯VitAVitE(三)三氯化銻比色法λmax618nm～620nm缺點呈色不穩(wěn)定（5~10s內(nèi)）水分干擾與標(biāo)準(zhǔn)曲線溫差≤1℃專屬性差三氯化銻有腐蝕性第二節(jié)VitB亦稱鹽酸硫胺,具有維持糖代謝及神經(jīng)傳導(dǎo)與消化的正常功能，主要用于治療腳氣病、多發(fā)性神經(jīng)炎和胃腸道疾病氨基嘧啶環(huán)噻唑環(huán)亞甲基季銨性質(zhì)溶解性干燥品在空氣中迅速吸收4%的水分。在水中易溶，在乙醇中微溶，在乙醚中不溶，水溶液呈酸性性質(zhì)硫色素反應(yīng)噻唑環(huán)在堿性介質(zhì)中可開環(huán)，再與嘧啶環(huán)上的氨基環(huán)合，經(jīng)鐵氰化鉀等氧化劑氧化成具有熒光的硫色素，后者溶于正丁醇中呈藍(lán)色熒光性質(zhì)分子中具有兩個雜環(huán)，可與某些生物堿沉淀試劑如碘化鉀、三硝基苯酚、碘溶液、硅鎢酸反應(yīng)生成恒定的沉淀紫外吸收特性性質(zhì)維生素B1為鹽酸鹽，可呈氯化物的鑒別反應(yīng)氯化物的特征一、Identification1.硫色素?zé)晒夥磻?yīng)——為維生素B1所特有NaOH－H2O噻唑環(huán)在堿性介質(zhì)中可開環(huán)，再與嘧啶環(huán)上的氨基環(huán)合，經(jīng)鐵氰化鉀等氧化劑氧化成具有熒光的硫色素，環(huán)合[O]－2H硫色素Thiochtome溶于丁醇，顯藍(lán)色熒光取本品約5mg，加NaOHT.S.2.5ml溶解后，加鐵氰化鉀T.S.0.5ml與正丁醇5ml，強力振搖2min，放置使分層，上層顯強烈的藍(lán)色熒光；加酸使呈酸性，熒光即消失；再加堿使呈堿性，熒光又重現(xiàn)。方法2.沉淀反應(yīng)維生素B1與碘化汞鉀生成淡黃色沉淀[B].H2HgI4維生素B1與苦酮酸生成扇形白色結(jié)晶維生素B1與碘生成紅色沉淀[B].HI.I2維生素B1與硅鎢酸反應(yīng)生成白色沉淀[B]2.SiO2(OH)2.12WO3.4H2O3.氯化物反應(yīng)本品是鹽酸鹽,水溶液呈氯化物的鑒別反應(yīng)4.硫元素反應(yīng)5.紅外分光光度法本品對照品對照三、含量測定

非水溶液滴定法

(Non-aqueousTitrimetry)

紫外分光光度法

(UV)

硫色素?zé)晒夥?/p>

(Thiochrone

Fluoremetry)非水滴定法原理維生素B1分子中含有兩個堿性的已成鹽的伯胺和季銨基團,在非水溶液中均可與高氯酸作用,以電位指示終點.根據(jù)消耗的高氯酸量即可算出維生素B1的含量.Non-aqueousTitrimetry喹那啶紅－亞甲藍(lán)

（紫紅→天藍(lán)）紫外分光光度法原理維生素B1分子中含有共軛雙鍵結(jié)構(gòu),在紫外區(qū)有吸收,根據(jù)最大吸收波長處的吸光度即可以計算含量.1——0.1MHCl2——H203——H3PO4buffer4——alcohol246232255VitB1鐵氰化鉀NaOH硫色素異丁醇熒光λex-365nmλem-435nm+NaOH+鐵氰化鉀+異丁醇+NaOH+異丁醇對照液+NaOH+鐵氰化鉀+異丁醇+NaOH+異丁醇供試液SdAb硫色素?zé)晒夥ǖ谌?jié)VitC一、主要性質(zhì)

溶解性酸性旋光性還原性L-抗壞血酸(有生物活性)L-二酮古羅糖酸L-去氫抗壞血酸無生物活性烯二醇結(jié)構(gòu)，具有內(nèi)酯環(huán)

水解性

糖類性質(zhì)50℃

UV二、鑒別1.與AgNO3反應(yīng)2.與2,6-二氯靛酚反應(yīng)氧化型還原型酸式色堿式色3.與氧化劑反應(yīng)4.與糖類反應(yīng)H2O-CO2戊糖-3H2O糠醛50℃藍(lán)色其它還有薄層色譜法,百分吸收系數(shù)法雜質(zhì)檢查溶液的澄清度與顏色檢查維生素C長期貯存會被氧化變色,因而應(yīng)通過此項檢查控制其純度.鐵與銅離子的檢查維生素C中可能存在一些鐵與銅離子,因而可以采用標(biāo)準(zhǔn)添加對照法進行檢查.草酸的檢查一般加CaCl2形成草酸鈣對測定其濁度.三、含量測定(強還原性)1.碘量法取本品約0.2g，精密稱定，加新沸過的冷水100ml與稀醋酸10ml使溶解，加淀粉指示液1ml，立即用碘滴定液（0.05mol/L）滴定，至溶液顯藍(lán)色，在30秒內(nèi)不褪。每1ml碘滴定液(0.05mol/L)相當(dāng)于8.806mg的C6H8O62.2,6-二氯靛酚滴定法快速滴定，用于含VitC的制劑與食品分析3.HPLC人血漿中VitC濃度的HPLC法測定標(biāo)準(zhǔn)溶液制備：取VC對照品約25mg，精密稱定，置25ml量瓶中，加10%偏磷酸稀釋至刻度，得維生素C儲備液濃度為1mg/ml，置冰箱中2℃保存，3日內(nèi)可用。血漿樣品預(yù)處理：取受試者靜脈血，立即置肝素化的離心試管中，3000rpm離心5min；取血漿0.5ml，加入0.5ml10%偏磷酸溶液，渦旋混合0.5min，離心，分取上清液，置冰箱2℃貯存，直至測定。穩(wěn)定性考察：VC在血漿中不穩(wěn)定，在5%偏磷酸溶液中也難以保持長期穩(wěn)定，應(yīng)盡可能縮短藥物分離和處理時間。樣品測定：每天抽取的血樣應(yīng)當(dāng)日測定，每天建立一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，并隨行測定高、中、低濃度的雙樣本質(zhì)控樣品。維生素D2－骨化醇一、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)第四節(jié)VitD維生素D3－膽骨化醇維生素D2維生素D3溶解性:在三氯甲烷中極易溶解,在丙酮乙醇乙醚中易溶.

不穩(wěn)定性:雙鍵極不穩(wěn)定,易氧化變色,毒性增強.

旋光性:有五到六個手性碳原子,均具有旋光性.

顯色反應(yīng):在三氯甲烷+醋酐+硫酸會從黃到紫再到綠色.

紫外吸收:具有吸收基團二、鑒別顯色反應(yīng):三氯甲烷+醋酐+硫酸三氯甲烷+三氯化銻三氯化鐵=橙黃色初顯黃色逐漸變紅迅即變紫最后變綠溶液顯橙紅色,逐漸變粉紅色二氯丙醇和乙酰氯=綠色比旋度鑒別測定比旋度進行鑒別其它鑒別法TLC\HPLC\熔點\UV\IR等三、雜質(zhì)檢查1、麥角醇的檢查90％乙醇溶解后，加洋地黃皂苷溶液，放置18h，不得發(fā)生渾濁。2、前維生素D的光照產(chǎn)物λ＝280nm~320nmCh.P2010——NP-HPLC四含量測定USP34-NF29化學(xué)法色譜法微生物法BP2010化學(xué)法色譜法光譜法

固定相：硅膠

流動相：正己烷－正戊醇（997：3）

檢測波長：254nm第一法：用于無維生素A醇及其他干擾的供試品第二法：(1)皂化提取;(2)凈化用色譜柱系統(tǒng)分離收集維生素D，得供試品溶液B;(3)按第一法進行測定。第三法：當(dāng)樣品經(jīng)皂化提取及凈化用色譜系統(tǒng)分離收集后，前維生素D峰仍受干擾時，采用此法。第五節(jié)VitER1R2﹡﹡苯并二氫吡喃醇VitE(dl-α-TocopherylAcetate)SyntheticNatural苯并二氫吡喃環(huán)+飽和烴鏈溶解性水解性氧化性紫外吸收△二、鑒別1.硝酸反應(yīng)生育酚HNO3（橙紅色）生育紅2.三氯化鐵反應(yīng)生育酚[O]對-生育醌3.UV0.01%無水乙醇中，λmax=284nm，λmin=254nm4.TLC薄層板硅膠G展開劑環(huán)己烷-乙醚（4：1）顯色劑硫酸（105℃5′）VitERf

=0.7三、雜質(zhì)檢查1.酸度