基因工程的基本操作程序

基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序主要包括四個(gè)基本步驟：1）目的基因的獲取2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建3）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4）目的基因的檢測(cè)與鑒定基因工程的基本操作流程步驟一：目的基因的獲取

目的基因是人們所需要轉(zhuǎn)移或改造的基因,獲取目的基因是實(shí)施基因工程的第一步。

如蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因，還有植物的抗病（抗病毒、抗細(xì)菌）基因、種子貯藏蛋白的基因，以及人的胰島素基因、干擾素基因等。補(bǔ)：原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)啟動(dòng)子終止子RNA聚合酶能夠識(shí)別調(diào)控序列中的結(jié)合位點(diǎn)，并與其結(jié)合。

轉(zhuǎn)錄開始后，RNA聚合酶沿DNA分子移動(dòng)，并以DNA分子的一條鏈為模板合成RNA。

轉(zhuǎn)錄完畢后，RNA鏈釋放出來(lái)，緊接著RNA聚合酶也從DNA模板鏈上脫落下來(lái)。①不能轉(zhuǎn)錄為信使RNA，不能編碼蛋白質(zhì)。：能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的信使RNA，能編碼蛋白質(zhì)編碼區(qū)非編碼區(qū)原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)②有調(diào)控遺傳信息表達(dá)的核苷酸序列，在該序列中，最重要的是位于編碼區(qū)上游的RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)。啟動(dòng)子補(bǔ)：真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)含子外顯子能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)含子啟動(dòng)子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游內(nèi)含子：外顯子：真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列：有調(diào)控作用的核苷酸序列，包括位于編碼區(qū)上游的RNA

聚合酶結(jié)合位點(diǎn)。非編碼序列：包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較思考編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質(zhì)，原核細(xì)胞與真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)一樣長(zhǎng)嗎？連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)非編碼一、目的基因的獲取1、目的基因主要是指______________________編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因與生物抗逆性、優(yōu)良品種，生物藥物以及工業(yè)所需用酶有關(guān)的基因，也可以是一些具有調(diào)控作用的因子。2、獲取目的基因的常用方法有哪些?（1）從基因文庫(kù)中獲?。?）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增（3）人工合成（一）從基因文庫(kù)中獲取目的基因（序列未知）1.什么叫基因文庫(kù)？

基因文庫(kù)

基因組文庫(kù)部分基因文庫(kù)（cDNA文庫(kù)）基因文庫(kù)中不是直接保管相應(yīng)基因，而是保存受體菌，菌中含基因。將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入到受體菌的群體中儲(chǔ)存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫(kù)。基因組文庫(kù)與部分基因文庫(kù)的關(guān)系基因組文庫(kù)的構(gòu)建模式圖部分基因文庫(kù)的構(gòu)建模式圖基因組文庫(kù)和部分基因文庫(kù)的比較小大無(wú)有無(wú)有某種生物的部分基因某種生物的全部基因可以部分基因可以基因組文庫(kù)與部分基因文庫(kù)的關(guān)系怎樣從基因文庫(kù)中得到我們所需的目的基因呢?目的基因的提取方法直接分離基因人工合成基因反轉(zhuǎn)錄法根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA：鳥槍法鳥槍法：供體細(xì)胞中的DNA許多DNA片段運(yùn)載體限制酶與載體連接載入受體細(xì)胞產(chǎn)生特定性狀導(dǎo)入外源DNA擴(kuò)增目的基因分離(直接分離法)1、直接分離基因1）反轉(zhuǎn)錄法：以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。目的基因的mRNA單鏈DNA(cDNA)雙鏈DNA(即目的基因)反轉(zhuǎn)錄合成2.人工合成基因法2）根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法：

根據(jù)已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列，推測(cè)出相應(yīng)的信使RNA序列，然后按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，推測(cè)出它的結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列，再通過(guò)化學(xué)方法，以單核苷酸為原料合成目的基因。蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列推測(cè)推測(cè)目的基因化學(xué)合成上述三種目的基因提取的方法有何優(yōu)缺點(diǎn)？操作簡(jiǎn)便廣泛使用工作量大，盲目，分離出來(lái)的有時(shí)并非一個(gè)基因?qū)Ｒ恍詮?qiáng)操作過(guò)程麻煩，mRNA很不穩(wěn)定，要求的技術(shù)條件較高專一性最強(qiáng)僅限于合成核苷酸對(duì)較少的簡(jiǎn)單基因思考:為什么要構(gòu)建基因文庫(kù)?直接從含有目的基因的生物體內(nèi)提取不行嗎?哪些新技術(shù)能大大簡(jiǎn)化基因工程的操作技術(shù)？1）DNA序列自動(dòng)測(cè)序儀：2）PCR技術(shù)：

對(duì)提取出來(lái)的基因進(jìn)行核苷酸序列分析。

使目的基因的片段在短時(shí)間內(nèi)成百萬(wàn)倍地?cái)U(kuò)增。①

概念：PCR全稱為_______________，是一項(xiàng)在生物____復(fù)制___________的核酸合成技術(shù)

③條件：_____________________（模板）__、

_______________、___________(做啟動(dòng)子)、___________.前提條件：②原理：__________④方式：以_____方式擴(kuò)增，即____（n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）⑤結(jié)果：選修P83聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外特定DNA片段DNA復(fù)制已知基因的核苷酸序列四種脫氧核苷酸一對(duì)引物DNA聚合酶指數(shù)2n使目的基因的片段在短時(shí)間內(nèi)成百萬(wàn)倍地?cái)U(kuò)增(二)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因⑥過(guò)程：a、變性（94℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_____斷裂，形成___________b、退火（復(fù)性55℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部________。c、延伸（72℃）：在TaqDNA酶的作用下，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補(bǔ)的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈(二)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因1.用一定的_________切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)切口，露出____________。2.用_____________切斷目的基因，使其產(chǎn)生_________________。(二)基因表達(dá)載體的構(gòu)建——核心3.將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的______處，再加入適量___________，形成了一個(gè)重組

DNA分子（重組質(zhì)粒）限制酶黏性末端同一種限制酶的黏性末端切口DNA連接酶相同質(zhì)粒DNA分子限制酶處理兩個(gè)黏性末端獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）——核心同一種(二)基因表達(dá)載體的構(gòu)建4.過(guò)程:5.基因表達(dá)載體的組成：復(fù)制原點(diǎn)+目的基因+啟動(dòng)子+終止子+標(biāo)記基因它們有什么作用？常用的受體細(xì)胞：

有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動(dòng)植物細(xì)胞等。將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的原理借鑒細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞的途徑。步驟三：目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（一）轉(zhuǎn)化：目的基因進(jìn)入_________內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持_____和_____的過(guò)程受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)（二）方法將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法——顯微注射法——感受態(tài)細(xì)胞將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法：1、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法

（適用于雙子葉植物和裸子植物）（1）農(nóng)桿菌介紹（2）原理及適用范圍(三)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法①特點(diǎn)：

Ti質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上。易感染雙子葉植物和裸子植物，對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒(méi)有感染能力。②轉(zhuǎn)化過(guò)程:Ti質(zhì)粒目的基因構(gòu)建表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞插入植物細(xì)胞染色DNA表達(dá)新性狀轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產(chǎn)生的動(dòng)力，將包裹在金屬顆粒（鎢粉粒子和金粉粒子）表面的表達(dá)載體DNA打入受體細(xì)胞中，使目的基因與其整合并表達(dá)的方法。（2）基因槍法常用于單子葉植物（3）花粉通道法植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過(guò)花柱直通胚囊?；ǚ酃芡ǖ婪ň褪窃谥参锸芊酆?，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入受體細(xì)胞。我國(guó)科學(xué)家獨(dú)創(chuàng)將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞（1）方法：顯微注射法（將基因表達(dá)載體提純，用顯微儀注射到受精卵中）思考：為什么要用受精卵而不用體細(xì)胞？（2）操作程序:提純含目的基因表達(dá)載體取受精卵顯微注射移植到輸卵管或子宮受精卵發(fā)育新性狀動(dòng)物常用法：常用菌：原核生物作受體細(xì)胞原因：過(guò)程：Ca2+處理大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA3.將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞Ca2+處理大腸桿菌繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)少受精卵體細(xì)胞受精卵細(xì)胞/個(gè)體農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法顯微注射技術(shù)用Ca2+處理成感受態(tài)細(xì)胞四、目的基因的檢測(cè)與鑒定檢測(cè):是否插入目的基因是否轉(zhuǎn)錄是否翻譯鑒定:分子水平鑒定個(gè)體生物學(xué)水平鑒定DNA分子雜交示意圖

采用一定的技術(shù)手段，將兩種生物的DNA分子的單鏈放在一起，如果這兩個(gè)單鏈具有互補(bǔ)的堿基序列，那么，互補(bǔ)的堿基序列就會(huì)結(jié)合在一起，形成雜合雙鏈區(qū)；在沒(méi)有互補(bǔ)堿基序列的部位，仍然是兩條游離的單鏈。1、檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物的DNA上是否插入了目的基因①首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA；（1）方法:DNA分子雜交（2）過(guò)程:②

將含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作標(biāo)記,以此做探針；③

使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交,若顯示出雜交帶,表明染色體已插入染色體DNA中。（一）檢測(cè)2、檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA①方法:分子雜交②過(guò)程:用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交,若出現(xiàn)雜交帶,表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNA。提取方法——抗原-抗體雜交蘇云金桿菌Bt毒素蛋白將Bt毒蛋白注射小鼠體內(nèi)從小鼠血管抽出血液分離出抗Bt毒素的抗體抗體蛋白質(zhì)

出現(xiàn)雜交帶脫分化組織培養(yǎng)3、檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)（二）鑒定（個(gè)體生物學(xué)水平）抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等目的基因的表達(dá)和檢測(cè)4、目的基因的檢測(cè)和鑒定大量的受體細(xì)胞接受不多的目的基因。處理的受體細(xì)胞中真正攝入了目的基因的很少，必須將它從中檢測(cè)出來(lái)。將每個(gè)受體細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)形成