杜仲成分的提取與分離

一杜仲是我國特有的一種傳統(tǒng)的名貴中藥材，具有降血壓、降血脂、降血糖、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、抗炎、抗菌、增強機體免疫力、治療心血管疾病等生物活性，其藥用價值歷來受到人們的關(guān)注［1］。在早期的報道中主要是針對杜仲皮的研究，但是杜仲皮取材困難、成本高。大量現(xiàn)代醫(yī)學研究證實了杜仲葉與皮的化學成分基本一致，具有同等功效，特別是綠原酸和黃酮的含量遠高于皮中的含量，因此，對產(chǎn)量高、價格便宜的杜仲葉中有效成分進行研究具有一定的實用價值。筆者研究NKA-II樹脂對杜仲葉中綠原酸和黃酮類化合物吸附和分離的效果，并對其分離工藝進行優(yōu)化，以期為杜仲葉相關(guān)產(chǎn)品的深開發(fā)與生產(chǎn)提供參考。4二，Heidolph旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，UNICOUV-2102PC型分光光度計；蘆丁標準品、綠原酸標準品（中國藥品生物制品檢定所），其它試劑均為分析純。1.2樣品預處理及測定方法1.2.1樣品預處理用70%乙醇水溶液作為提取劑，按照料液比1:12,pH值為4,每次提取25min,提取3次，合并濾液并濃縮至無醇味后，冷凍干燥，得到杜仲葉粗提物，在干燥避光條件下保存。1.2.2綠原酸及總黃酮的測定紫外可見分光光度法測定綠原酸的含量［3］和總黃酮的含量［2］。1.2.3高效液相色譜法（HPLC）檢測杜仲葉分離產(chǎn)物色譜條件色譜柱：ACQUITYUPLCBEHC18（100mmX2.1mm,1.7|im）（美國WATERS公司）；柱溫25°C;流速0.35mL/min；檢測波長365nm；進樣量5UL；流動相采用梯度洗脫。1.3樹脂的選擇采用9種大孔吸附樹脂對杜仲葉中綠原酸、總黃酮的吸附-解吸分離性能進行研究，可為規(guī)?；蛛x綠原酸、總黃酮提供理論依據(jù)。1.4大孔樹脂預處理先將各種樹脂分別用蒸餾水溶脹12h后浮選，然后用95%乙醇浸泡24h后，用蒸餾水洗至無渾濁現(xiàn)象，無醇味為止。再用1mol/LNaOH溶液浸泡24h,用蒸餾水洗至中性。然后用1mol/LHCl浸泡24h,用蒸餾水洗至中性。最后用20%乙醇浸泡儲備。1.5靜態(tài)吸附-解吸試驗首先對9種大孔樹脂的吸附量、吸附率和解吸率進行測定［5］,其次分別考察吸附液pH值和不同乙醇濃度對NKA-11樹脂靜態(tài)吸附的影響［6］。1.6動態(tài)吸附-洗脫試驗在室溫下，根據(jù)靜態(tài)吸附-解吸試驗的條件,考察上柱液流速、上柱液濃度、洗脫劑流速對NKA-II樹脂動態(tài)吸附-洗脫性能的影響，作動態(tài)吸附曲線和洗脫曲線，確定最佳動態(tài)吸附-洗脫工藝條件。1.7擴大試驗及高效液相色譜檢測稱取5kg杜仲葉，先用NKA-II大孔樹脂進行分離，將30%、50%、70%的乙醇洗脫液分別濃縮，再用聚酰胺樹脂和SephadexLH-20樹脂進行純化，最后將分離純化的產(chǎn)物進行高效液相色譜檢測，操作條件見1.2.3。2結(jié)果與分析2.1大孔樹脂的靜態(tài)吸附-解吸試驗2.1.1大孔吸附樹脂對綠原酸、總黃酮的靜態(tài)吸附效果比較試驗所用樹脂有極性、弱極性、非極性三種類型，這9種大孔吸附樹脂對綠原酸、總黃酮的靜態(tài)吸附-解吸情況見表2。從表2可以看出，NKA-II在靜態(tài)飽和吸附時對綠原酸、總黃酮不僅具有較高的吸附量，而且解吸率也較高，所以確定NKA-II為最佳樹脂，并進行動態(tài)吸附-洗脫試驗。NKA-II樹脂對綠原酸、總黃酮的靜態(tài)吸附動力學曲線在給予充分時間吸附的情況下，由圖1可見，綠原酸和總黃酮在NKA-II樹脂上的動力第12期張玲等：杜仲葉綠原酸總黃酮的分離純化及檢測123表3上柱液濃度對NKA-II樹脂動態(tài)吸附性能的影響上樣液濃度1/20C0圖4不同乙醇濃度對NKA-II樹脂靜態(tài)解吸的影響學過程如下：在起始階段吸附速率較大；但4h之后，樹脂基本達到吸附平衡；隨著吸附時間的繼續(xù)延長，吸附量的增加速率減小。根據(jù)吸附動力學曲線，NKA-II樹脂對杜仲葉粗提物中綠原酸和總黃酮的吸附屬于快速平衡型樹脂。2.1.3吸附等溫線將濃度為CO的杜仲葉粗提物溶液（含綠原酸3.734mg/mL和總黃酮14.018mg/mL）分別稀釋成不同濃度的靜態(tài)吸附液，稱取5.000g（干基）的NKA-II樹脂，振蕩條件同文獻[4],計算吸附率，作吸附等溫線，結(jié)果見圖2。吸附等溫線的初始階段幾乎呈線性的，表明低濃度上樣液中的活性成分可以在樹脂中高度擴散。當樹脂表面形成分子層吸附飽和后，溶液中的黃酮化合物在外層再以氫鍵的方式與表面吸附的黃酮吸附，但由于孔容的限制，所以存在一個極限，這與李云志等［7］和李瑩等［8］研究顯示的現(xiàn)象一致。由圖可知，當總黃酮的平衡濃度為5.93mg/mL時達飽和吸附，總黃酮的飽和吸附量為91.75mg/g樹脂。2.1.4吸附液的pH值對NKA-II樹脂吸附的影響由圖3看出，在pH值為4時，NKA-II樹脂對綠原酸和黃酮類化合物的吸附率均達到最大，說明在此條件下，綠原酸和黃酮類化合物均以分子形式存在，較穩(wěn)定，故吸附效果最好。當酸性較強時，易形成“佯鹽”；在偏堿性時，分子中酚羥基H+易失去，形成離子結(jié)構(gòu)，不易被吸附。2.1.5不同乙醇濃度對NKA-II樹脂靜態(tài)解吸的影響圖4表明，靜態(tài)解吸效果隨著乙醇水溶液體積分數(shù)的提高而增強，當濃度達到70%時，解吸平衡。同時檢測發(fā)現(xiàn)，低濃度乙醇溶液有利于綠原酸類化合物的解吸，而高濃度乙醇溶液則有利于黃酮類化合物的解吸，說明采用梯度洗脫有利于綠原酸與黃酮類化合物的分離。NKA-II樹脂對綠原酸、總黃酮的動態(tài)吸附性能2.2.1NKA-II樹脂的動態(tài)吸附滲透曲線將含綠原酸和總黃酮濃度分別為0.901mg/mL和3.441mg/mL的上樣液以1.0mL/min流速上柱，直至樹脂吸附飽和為止。以一個柱體積為單位收集流出液，測定流出液中綠原酸、總黃酮的濃度C'，C為上樣液濃度，用C'/C表示滲透系數(shù)，繪制吸附滲透曲線，結(jié)果見圖5。流出液的濃度達到進樣液濃度的1/10時（即C'/C=0.1）時，認為已達到吸附的穿透點，停止進樣，表明此條件下，上樣量不應超過10倍的柱體積。2.2.2上柱液濃度對NKA-II樹脂動態(tài)吸附性能的影響將濃度為C0（含綠原酸9.012mg/mL,含總黃酮34.406mg/mL）的上樣液用水稀釋成不同濃度，分別取等體積的不同濃度的上柱液，在相同的流速下，進行動態(tài)吸附試驗，檢測上柱液濃度對大孔樹脂動態(tài)吸附性能的影響，結(jié)果見表3。大孔吸附樹脂的吸附量通常與上樣液濃度成反比，在相同流速和相同吸附時間下，若上柱液濃度過大，由于孔容的限制，存在一個吸附極限，所以會有更多的有效物質(zhì)未被充分吸附而流出?？紤]到124湖南農(nóng)業(yè)科學第12期張玲等：杜仲葉綠原酸總黃酮的分離純化及檢測表4吸附流速對NKA-II樹脂動態(tài)吸附性能的影響（％）流速圖6NKA-II樹脂對綠原酸、總黃酮的動態(tài)洗脫曲線一般泄漏率不應大于10%，因此上柱液濃度應小于2/10C0。2.2.3吸附流速對NKA-II樹脂動態(tài)吸附性能的影響吸附流速主要影響溶質(zhì)向樹脂表面擴散，從而決定了吸附效果。如果吸附流速過大，就會使樹脂的吸附量下降；如果流速過小，則生產(chǎn)周期延長，效率降低。由于泄漏點不應大于0.1，根據(jù)表4數(shù)據(jù)顯示，流速選擇0.8?1.5mL/min較好，故試驗選擇1.0mL/min,此時綠原酸的吸附量是13.18mg/g,總黃酮的吸附量是47.66mg/g。NKA-II樹脂對杜仲葉粗提物實際的動態(tài)吸附-洗脫試驗NKA-II樹脂的動態(tài)吸附滲透曲線見圖5。根據(jù)已確定的最佳吸附-洗脫條件,采用乙醇-水為洗脫體系,進行梯度洗脫,部分收集各段餾分,洗脫曲線見圖6。結(jié)果顯示：1?6管為水洗洗脫液,其中主要含有多糖、蛋白質(zhì)、鞣質(zhì)等大分子物質(zhì)；7?14管為30%乙醇洗脫液,主要含綠原酸類等強極性物質(zhì)；15?32管為50%乙醇洗脫液,主要含與蘆丁極性相似的黃酮類化合物；33?53管為70%乙醇洗脫液，含有大量極性較弱的黃酮類化合物，如槲皮素、槲皮苷等；54?70管為95%的高濃度乙醇洗脫液，將大孔樹脂中殘留的弱極性脂溶性物質(zhì)去除。2.4杜仲葉有效成分的純化根據(jù)最佳吸附-解吸條件，進行擴大試驗，分別將30%、50%、70%的乙醇洗脫液濃縮，冷凍干燥后，采用聚酰胺樹脂和SaphadexLH-20樹脂純化得到4種組分，經(jīng)過高效液相色譜檢測，各組分的峰面積比均超過95%。將杜仲葉分離產(chǎn)物的出峰時間與標準品出峰時間對照，經(jīng)薄層層析結(jié)果分析、紫外光譜檢測，參考張培成，田燕［7-8］的報道，可以判斷筆者研究所分離的4種組分可能為：綠原酸、金絲桃苷或陸地錦苷、槲