分離以尿素為氮源的微生物

分離以尿素為氮源的微生物實驗2實驗目的1.使用專一的培養(yǎng)基（含有尿素）分離專一的細菌。（如有脲酶的細菌）2.利用指示劑顏色的變化檢知酶（脲酶）所催化的反應。一、實驗原理尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥。尿素不能直接被農(nóng)作物吸收。土壤中的某類細菌能夠合成脲酶將尿素分解成氨，之后被植物利用。(NH2)2C=O

+H2O脲酶+CO2NH3思考：怎么從土壤中分離出以尿素為氮源的微生物呢？利用以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基進行篩選。一、實驗原理氮源為尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作為氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生長發(fā)育繁殖，而受到抑制，所以用此培養(yǎng)基就能夠選擇出分解尿素的微生物。利用以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基進行篩選。一、實驗原理(NH2)2C=O

+H2O脲酶+CO2NH3思考：如何檢驗細菌產(chǎn)生脲酶水解尿素？

尿素NH3

中性堿性

酚紅指示劑：

(酸性)黃色

紅色1.在100ml燒杯中裝入50ml70%酒精；2.配制25mLLB全營養(yǎng)固體培養(yǎng)基；3.配制25mL尿素固體培養(yǎng)基；4.將盛有4.5ml蒸餾水的5支有塞試管；5.在250ml三角瓶中裝入99ml蒸餾水；6.土樣1g。二、實驗器材三、實驗步驟1、制備無菌的LB固體培養(yǎng)基和尿素固體培養(yǎng)基LB固體培養(yǎng)基NaCl0.25g蛋白胨0.25g酵母提取液0.12g

水25mL

瓊脂糖

0.5g

全營養(yǎng)培養(yǎng)基尿素固體培養(yǎng)基NaCl0.12g

K2HPO4

0.12g葡萄糖0.025g

水15mL

瓊脂糖

0.5g

酚紅

0.25mg選擇培養(yǎng)基三角瓶中配制，加封口膜滅菌尿素

10mL三角瓶中配制，加封口膜滅菌G6玻璃砂漏斗三、實驗步驟2、倒平板：思考：倒平板的具體操作是什么？在60℃左右時，將三角瓶中已經(jīng)滅菌的LB全營養(yǎng)培養(yǎng)基和尿素培養(yǎng)基，在酒精燈火焰旁分別倒在兩個培養(yǎng)皿中，在水平的超凈臺上搖勻，平放至凝固。3、制備細菌懸液三、實驗步驟在無菌條件下，將1g土樣加到有99mL無菌水的三角瓶中，震蕩10min，即成10-2土壤稀釋液。依此法制備10-3、10-4和10-5土壤稀釋液。取樣時，盡量只取懸液。搖勻，放在試管架上。4、用涂布法分離細菌三、實驗步驟取10-5和10-4的土壤稀釋液各0.1mL，分別加到有LB培養(yǎng)基和尿素培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中。再將保存在70%酒精中的玻璃刮刀放在酒精燈火焰上，待刮刀上火焰熄滅，在酒精燈火焰旁打開培養(yǎng)皿，將菌液涂布到整個平面上。槍頭移液器（移液槍）玻璃刮刀（涂布器）5、培養(yǎng)三、實驗步驟將培養(yǎng)皿倒置，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24~48小時，觀察菌落數(shù)。6、觀察全營養(yǎng)培養(yǎng)基中有較多的菌落，而尿素為氮源的培養(yǎng)基中只有少量菌落。LB培養(yǎng)基稀釋度10-6LB培養(yǎng)基稀釋度10-7尿素培養(yǎng)基稀釋度10-4尿素培養(yǎng)基稀釋度10-5按濃度捆成一摞恒溫37℃培養(yǎng)10-5

、10-4,、

在同一稀釋度下，至少對3個平板進行重復計數(shù)，然后求出平均值，并根據(jù)平板所對應的稀釋度計算出樣品中細菌的數(shù)目。分析與討論：1.為什么要用瓊脂糖代替瓊脂配制固體培養(yǎng)基？2.有脲酶的細菌在生態(tài)穩(wěn)態(tài)上起什么作用？瓊脂是未被純化的混合物，內(nèi)含一定量的含氮化合物，如果用瓊脂固定培養(yǎng)基，會為細菌提供一定量的非尿素類氮源，這樣會在尿素固體培養(yǎng)上產(chǎn)生大量以非尿素為氮源的細菌，不利于以尿素為氮源的細菌的篩選。如土壤中有許多尿素，在自然界較高溫度下會被水解，水解后的氨使土壤變成堿性，與其他陰離子形成化合物會使土壤板結(jié)。有脲酶的細菌使植物廢棄物和動物尸體降解，并利用所形成的氨，有利于自然界的氮循環(huán)。3.有脲酶細菌菌落周圍為什么有紅色環(huán)帶？4.與全營養(yǎng)培養(yǎng)基上的菌落數(shù)比較，為什么尿素培養(yǎng)基上只有少數(shù)菌落？能利用尿素的細菌在土壤菌群中只占極少數(shù)量。分析與討論：紅色環(huán)狀區(qū)域的大小代表脲酶活性的強弱和含量的多少。紅色區(qū)域越大，表明菌株利用尿素的能力越強。

細菌分泌脲酶，使培養(yǎng)基中尿素水解，并產(chǎn)生氨NH3（堿性）。而酚紅在酸性環(huán)境里呈黃色，堿性里呈紅色。所以培養(yǎng)基中酸堿指示劑變紅，標志著存在尿素被水解成氨的現(xiàn)象，從而證明這一菌株以尿素為氮源。實踐訓練2016年10月選考題取適量含產(chǎn)脲酶細菌的10-4，10-5兩種土壤稀釋液，分別涂布接種到LB固體培養(yǎng)基和尿素固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)48小時，推測固體培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)最少的是

。A．10-5稀釋液+尿素固體培養(yǎng)基B．10-5稀釋液+LB固體培養(yǎng)基C．10-4稀釋液+尿素固體培養(yǎng)基D．10-4稀釋液+LB固體培養(yǎng)基在尿素固體培養(yǎng)基上產(chǎn)脲酶細菌菌落周圍出現(xiàn)

，其原因是細菌產(chǎn)生的脲酶催化尿素分解產(chǎn)生

所致。A紅色環(huán)帶1.使用選擇培養(yǎng)基的目的是（）

A.培養(yǎng)細菌

B.培養(yǎng)真菌

C.使需要的微生物大量繁殖

D.表現(xiàn)某微生物的特定性狀與其他微