分子病理學臨床應用

分子病理學的臨床應用長江大學附屬第一醫(yī)院荊州市第一人民醫(yī)院李軍川1概念——

來自于臨床

腫瘤個體化診治異質性全面了解整體解決2基層醫(yī)院-分子病理學面臨現(xiàn)狀主要滿足基本醫(yī)療需求注重疾病一般診治資金困境“分子學”，離得很“遠”？“高大上”，沒去了解、應用3概念——

來自于基礎遺傳染色體基因芯片分子分子學分子生物學分子病理學分子免疫學轉化醫(yī)學分子藥理學4生物大分子：核酸、蛋白質基因（gene)：核苷酸序列——貯存遺傳信息，貯存蛋白質多肽鏈或RNA序列信息分子生物學：分子水平研究生命現(xiàn)象、生命本質、生命活動及其規(guī)律醫(yī)學分子學：分子水平開展人類疾病的預防、診斷和治療研究的科學。交叉學科包括：分子免疫學、分子病毒學、分子病理學和分子藥理學等有關名詞5形態(tài)學

免疫分型免疫組化

基因定性、定量基因突變檢測基因芯片檢測……免疫學細胞遺傳學分子生物學

組織學細胞學特殊染色

核型分析熒光原位雜交MICMCM傳統(tǒng)病理學（MI）現(xiàn)代病理學（MICM）分子病理學（20世紀70年代初）6概念基因突變：點突變，缺失，插入，倒位，配子突變和體細胞突變，動態(tài)突變

基因芯片：人工合成的堿基序列基因檢測：血液、體液細胞DNA/RNA的技術基因診斷：DNA/RNA水平檢測基因，基本技術：核酸分子雜交和PCR擴增

基因診斷應用于腫瘤：1、染色體異位及融合基因。2、癌基因和抑癌基因。3、腫瘤相關病毒。4、腫瘤標志物基因或mRNA

7臨床應用目的：診斷清楚，治療有效標本多來源于病理科標本，包括組織學和細胞學，另外還有外周血等轉化醫(yī)學（20世紀90年代）：將基礎研究與解決患者實際問題結合起來，將基礎研究的成果“轉化”為實際患者的疾病預防、診斷和治療及預后評估。轉化醫(yī)學的中心環(huán)節(jié)是分子生物學的研究。關注分子學：不只是別人的事8熟悉：一些有關分子病理學的名詞分子診斷：滑膜肉瘤：SYT-SSX融合基因，淋巴瘤：

基因重排原位分子雜交——HPV

EBVFISH——Her-2基因測序——EGFR……9臨床常用分子學技術

免疫組織化學（IHC）技術－檢測蛋白分子原位雜交－DNA，RNA

熒光原位雜交（FISH）技術－DNA，RNA熒光定量PCR－DNA，RNADNA測序技術－DNA突變生物芯片技術－DNA，RNA，蛋白質等10精準醫(yī)療（精確醫(yī)療）指以個人基因組信息為基礎，結合蛋白質組、代謝組等相關內環(huán)境信息，為患者量身設計出最佳治療方案，以期達到治療效果最大化和副作用最小化的一門定制醫(yī)療模式。醫(yī)療的決策、實施等都是針對每一個病人個體特征而制定的，疾病的診斷和治療是在合理選擇病人自己的遺傳、分子或細胞學信息的基礎上進行的。在生物分子基礎上的、因人因病而異的、更加精確的個體化醫(yī)療。11腫瘤超早期篩查早期診斷及輔助診斷

預測藥物反應性，指導臨床用藥（放化療及靶向治療）預測預后

腫瘤分子分型分子病理學檢測的臨床應用——個體化醫(yī)療12風險預測我是否易得某種疾??？復發(fā)監(jiān)控療效判斷治療選擇預后判斷臨床分期鑒別診斷早期篩查我的疾病會如何進展？我現(xiàn)在是否可能有疾病？我的疾病是什么類型的？我的疾病進展了嗎？我的疾病回來了嗎？我的治療起作用了嗎？最適合我的治療是什么？個體化診療系統(tǒng)化解決方案13問題：我們是否易得某種疾病？腫瘤遺傳篩查

14腫瘤遺傳篩查

15腫瘤具有遺傳性：腫瘤分為散發(fā)性及家族性，家族性腫瘤大多由遺傳因素引起，少數(shù)由其他因素引起（如家族性肝癌與肝炎病毒在家族中傳染）遺傳性腫瘤的危害——患癌風險大幅提高遺傳性腫瘤的特性：

符合垂直傳遞規(guī)律，即腫瘤按常染色體顯性遺傳（AD）發(fā)病年齡較早（早于該腫瘤在普通人群中的平均發(fā)病年齡）多為雙側或多發(fā)性，散發(fā)性腫瘤多為單側或單發(fā)16遺傳性腫瘤綜合分子檢測項目79個基因、6萬個位點15種腫瘤17曾外祖母、外祖母:死于癌癥母親:BRCA1突變,56歲死于乳腺癌；阿姨：BRCA1突變,61歲死于乳腺癌；朱莉攜帶與母親相同的BRCA1突變；37歲時選擇進行乳腺切除術卵巢輸卵管切除

遺傳性乳腺癌-卵巢癌綜合征朱莉1819遺傳性乳腺癌/卵巢癌19遺傳性乳腺癌/卵巢癌檢測項目檢測基因遺傳性乳腺癌/卵巢癌檢測BRCA1、BRCA2、BRIP1、CDH1、PALB2、PTEN、TP53、ATM、CHEK2、NBN、STK11、MUTYH、EPCAM、LKB1、RAD51C、RAD51D、RAD50、BLM、FANCC、FANCM基因組合測序20檢測結果為陽性的患者患者遺傳性乳腺癌相關基因發(fā)現(xiàn)明確定義的有害突變，從遺傳學角度分析該突變有遺傳性。需要一、二、三級家屬送樣檢測。對于患者，可給予針對性的個體化治療。結果分析21對于陽性患者其目前未發(fā)病的親屬如果某位親屬經檢測具有此相同基因突變，則該親屬攜帶有遺傳性癌癥致病基因，建議采取臨床干預手段預防癌癥發(fā)生。針對乳腺癌檢測結果為陽性的干預手段：

1處方藥，如他莫昔芬（tamoxifen），以減少患乳腺癌的風險

2口服避孕藥降低卵巢癌的風險

3加強早期監(jiān)視（體檢和測試）

4預防手術：雙側乳腺切除術（PCM）和雙側卵巢切除術家屬檢測結果分析及干預手段22遺傳性腫瘤篩查檢測項目檢測項目檢測內容遺傳性腫瘤綜合檢測包含了遺傳性乳腺癌、結直腸癌等10余種常見腫瘤相關的79個基因的全外顯子檢測遺傳性乳腺癌/卵巢癌檢測BRCA1、BRCA2、PALB2等20個基因全外顯子檢測遺傳性結直腸癌MLH1、MSH2、MLH3等16個基因全外顯子檢測遺傳性胃癌檢測CDH1、MET、TP53等14個基因全外顯子檢測遺傳性甲狀腺癌檢測RET、BMPR1A等29個基因全外顯子檢測遺傳性前列腺癌檢測HOXB13、HPC1等8個基因全外顯子檢測遺傳性黑色素瘤檢測CDKN2A、CDK4、CDKN1C基因全外顯子檢測遺傳性垂體瘤檢測AIP基因多外顯子測序遺傳性腫瘤患者家屬基因驗證檢測先證者攜帶有害基因突變的驗證檢測23早期篩查問題：我現(xiàn)在是否可能有疾??？24腫瘤早期篩查-ctDNA循環(huán)腫瘤DNA(CirculatingTumorDNA，ctDNA)在腫瘤形成的超早期，就會出現(xiàn)腫瘤細胞的壞死和凋亡，這些凋亡或壞死的腫瘤細胞會釋放其DNA進入外周血形成游離的DNA，因此通過分析循環(huán)血液中是否含有腫瘤特異的游離DNA可以達到腫瘤早期篩查的目的。腫瘤游離DNA檢測是基于腫瘤共有的常見基因突變位點所設計的檢測方法，其陽性結果可以提示被檢者體內有腫瘤病灶正在啟動形成，但并不能準確的指示病灶形成的位置25微滴式數(shù)字PCR（ddPCR）真正意義上的痕量腫瘤突變DNA檢測！真正意義上的檢測高靈敏度！真正意義上的高端預知腫瘤分子檢測工具！26腫瘤早期篩查ddPCR檢測癌基因名稱檢測位點BRAFV600EEGFRL858R,L861Q等24種KRASG12D,G12A,G12V,G12C,G12R,G12S,G13D,G13C,A146THRASG12VIDHR132H,R132C,R132S,R132G,R132L，R172G,R172K,R172MPIK3CAE545K,E545A,H1047R,H1047LRETC634S,C634G,C634R,C634Y,C634P,C634S,C634W,M918TPTENR233*C-KITAla502_Tyr503dup，557/558delSMAD4R361C,R361S,R361HHER2L755S,L755P12個癌基因約60余個突變位點27檢測項目檢測位點肝癌超早期基因篩查PTEN、TP53基因肺癌超早期基因篩查BRAF、EGFR、KRAS、PIK3CA、RET、PTEN、TP53基因胃癌超早期基因篩查KRAS、HRAS、C-kit、TP53基因胰腺癌超早期基因篩查EGFR、KRAS、TP53、BRAF基因甲狀腺癌超早期基因篩查BRAF、RET、TP53基因結直腸癌超早期基因篩查BRAF、KRAS、PIK3CA、PTEN、SMAD4、TP53基因食管癌超早期基因篩查EGFR、KRAS、HRAS、PTEN、TP53基因乳腺癌超早期基因篩查PIK3CA、PTEN、HER2、TP53基因卵巢癌超早期基因篩查BRAF、KRAS、PIK3CA、PTEN、TP53基因前列腺癌超早期基因篩查PTEN、TP53基因腎癌超早期基因篩查NRAS、KRAS、TP53基因宮頸癌超早期基因篩查KRAS、HRAS、TP53基因膀胱癌超早期基因篩查KRAS、HRAS、TP53基因腦膠質瘤超早期基因篩查IDH、TP53基因惡性黑色素瘤超早期基因篩查BRAF、C-kit基因15種常見惡性腫瘤超早期基因綜合篩查BRAF、KRAS、PIK3CA、PTEN、SMAD4、TP53、EGFR、RET、NRAS、IDH、HER2基因15種常見腫瘤

12個癌基因28輔助診斷

29FISH或熒光定量PCR檢測在淋巴瘤的應用淋巴瘤FISH檢測基因臨床應用備注說明套細胞淋巴瘤IGH/CCND1融合基因輔助診斷濾泡性淋巴瘤BCL2/IGH融合基因輔助診斷、判斷預后BCL2/IGH重排發(fā)生在約80%-85%的FL患者中，檢測BCL2/IGH基因重排可以輔助診斷FL。BCL2/IGH陰性的FL患者3年生存率為100%，而陽性者只有54%；陰性者3年疾病無進展為87.5%，而陽性者只有13%。彌漫性大B細胞淋巴瘤BCL6基因斷裂重組輔助診斷、判斷預后目前研究確定至少40%的DLBCL涉及BCL6基因重排。BCL6陽性患者診斷治療36個月后，疾病停止發(fā)展的比率為82%，攜帶有BCL6重排的病例預后較好。伯基特淋巴瘤C-MYC基因斷裂重組輔助診斷約80%的伯基特淋巴瘤病例發(fā)生t(8；14)（q24;q32）；約15%的伯基特淋巴瘤病例發(fā)生t(2；8)(p11;q24)；約5%發(fā)生t(8；22)（q24;q11）。粘膜相關淋巴組織淋巴瘤MALTI基因斷裂輔助診斷胃MALT淋巴瘤與幽門螺旋桿菌（HP）感染導致的慢性胃炎有關，MALT1/API2融合基因陰性的患者抗HP治療有效，陽性患者抗HP治療無效。胃粘膜相關淋巴組織淋巴瘤API2-MALTI融合基因指導治療30用藥指導問題：最適合我的治療是什么？31NCCN指導目錄經驗用藥常規(guī)選擇化療藥物途徑低毒，低副作用毒性較強、副作用明顯惡性腫瘤的主要治療手段緩解誘導鞏固或維持治療輔助治療3233藥物敏感性檢測藥物代謝毒性檢測個體差異個體化用藥33個體化用藥的必要性遺傳變異是藥物個體差異的基礎

基因涉及：藥物代謝酶、膜轉運蛋白、靶向藥物治療靶點相關基因規(guī)范：結合分子檢測，進一步篩選適合該患者的化療方案預測藥物敏感性提示選用的藥物劑量防止病人服用會對該病人產生極大毒副作用的藥物腫瘤異質性34ERCC1表達量高低鉑類藥物XRRM1表達量高低鉑類藥物RRM1表達量高低紫杉醇類諾維本紫杉醇類吉西他濱紫杉醇類鉑類鉑類吉西他濱+++ERCC1

表達量高低RRM1表達量高低√RRM1表達量高低++正確的時間正確的病人正確的治療藥物遺傳學/藥物基因組學：化療藥物對腫瘤細胞的殺傷效應與特定的一種（一組）基因的表達和/或多態(tài)性顯著相關。相關基因的檢測，預測化療藥物的療效，選擇合適的藥物進行個體化化療，已經成為提高療效、減少無效治療的合理選擇。35鉑類相關靶點檢測檢測靶標檢測依據ERCC1NCCN指南表明：ERCC1低表達的NSCLC患者使用鉑類藥物效果明顯優(yōu)于ERCC1高表達患者。BRCA1臨床研究表明BRCA1mRNA低表達提示患者對藥物敏感，生存期明顯延長XRCC1(2項)臨床研究表明XRCC1基因與鉑類藥物療效相關GSTP1臨床研究表明GSTP1-Exon5突變的患者對鉑類藥物敏感MRP2臨床研究表明MRP2-Exon10（G1249A）突變增加腫瘤患者對鉑類藥物的敏感性NSCLC用藥指導一、二線藥物KawashimaA,TakayamaH,KawamuraN,eta1.OncolLett.2012Jul;4(1):15-21.AlshalalfaM,BismarTA,AlhajjR.AdvBioinformatics.2012;2012:373506.361.ERCC1，BRCA1；mRNA表達水平低的患者對鉑類藥物（如順鉑）敏感，對抗微管類藥物（如紫杉醇）耐藥。2.TSmRNA或者TS蛋白的表達與5-Fu化療的敏感性有關3.TUBB3mRNA表達水平與抗微管類藥物的療效密切相關。低表達的患者接受紫杉醇類或長春堿類藥物化療效果較好4.TOP2AmRNA表達水平，TOP2A酶活性的降低或表達水平降低都會造成依托泊苷耐藥5.RRM1高表達，吉西他濱藥物治療的療效較差，使用吉西他濱治療后生存期相對較短6.CYP2C9*3；基因多態(tài)性，與抗癌藥物環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、依托泊苷和他莫昔芬的代謝相關37化療藥敏:TaqMAN-ARMSARMS(amplificationrefractorymutationsystem):通過設計與突變DNA互補引物，唯有與突變DNA完互補的引物才可延伸并得到PCR擴增產物。技術特點：靈敏度高（靈敏度達0.1%，是傳統(tǒng)測序方法200倍）操作簡單可重復性強38化療前評估腫瘤藥物對癌細胞的殺傷作用--敏感或耐藥程度藥物開發(fā)過程中化合物的生物活性評價—體外細胞培養(yǎng)技術ATP腫瘤抗癌藥物敏感性檢測(ATP-TCA)原代腫瘤細胞+化療藥物共培養(yǎng)化療藥敏：ATP-TCA技術39腫瘤細胞化療藥物敏感試驗（CD-DST法）化療藥敏（CD-DST法）40乳腺癌結直腸癌胃腺癌肺SCC/Adeno/SCLC成神經細胞瘤黑色素瘤骨髓瘤卵巢癌胰腺癌甲狀腺癌食道癌肉瘤腫瘤類型(已驗證適用)適用樣品類型病理確認含有腫瘤細胞的離體標本：手術樣本胸水腹水良好的針刺活檢良好的針刺吸取物41靶向治療42沒有相關靶標的患者接受靶向治療---弊大于利一項覆蓋了9個國家和地區(qū)，1217例病人的泛亞洲科研顯示：沒有相關靶標的患者接受了靶向治療，死亡風險將增加185%——新英格蘭醫(yī)學雜志.2009.9.v361(10).432014年NCCN指南治療方案（肺癌）確定組織學亞型EGFR突變陽性非鱗狀細胞癌（腺癌，大細胞癌，未分類NSCLC）鱗狀細胞癌ALK陽性EGFR突變陰性和ALK陰性或未知EGFR突變檢測ALK檢測EGFR突變檢測ALK檢測NSCLC用藥指導442014年NCCN指南治療方案一線化療前發(fā)現(xiàn)EGFR突變一線化療期間發(fā)現(xiàn)EGFR突變厄洛替尼/阿法替尼有癥狀的進展一線治療EGFR突變陽性的非鱗狀細胞癌中斷或完成既定的化療方案，開始或增加厄洛替尼/阿法替尼無癥狀的進展繼續(xù)應用厄洛替尼/阿法替尼二線治療腦全身多發(fā)病變孤立病變局部治療并繼續(xù)應用厄洛替尼/阿法替尼全腦治療并繼續(xù)應用厄洛替尼/阿法替尼局部治療并繼續(xù)應用厄洛替尼/阿法替尼含鉑兩藥±貝伐珠單抗±厄洛替尼孤立病變多發(fā)病變NSCLC用藥指導452014年NCCN指南治療方案一線化療前發(fā)現(xiàn)ALK突變一線化療期間發(fā)現(xiàn)ALK突變克唑替尼有癥狀的進展一線治療ALK突變陽性的非鱗狀細胞癌中斷或完成既定的化療方案，開始克唑替尼無癥狀的進展繼續(xù)應用克唑替尼二線治療腦全身多發(fā)病變孤立病變局部治療并繼續(xù)應用克唑替尼全腦治療并繼續(xù)應用克唑替尼局部治療并繼續(xù)應用克唑替尼克唑替尼±貝伐珠單抗孤立病變多發(fā)病變NSCLC用藥指導46Kras突變的肺癌靶向治療方案阿法替尼EGFR/HER2酪氨酸激酶小分子不可逆抑制劑FDA認證適用于TKI抑制劑治療失敗的患者臨床數(shù)據：LUX-lung－EGFR突變患有效率90%克唑替尼crizotinibEML4-ALK融合基因具有致癌活性2011年FDA批準，抑制ALK激酶發(fā)揮作用帶ALK基因NSCLC患者有效率90%適用于局部晚期或轉移的NSCLC司美替尼SelumetinibKRAS信號傳導通路下游MEK1/2靶點的藥物晚期非小細胞肺癌有效，尤其是緩解率高達37%NSCLC用藥指導47KohnoT,etal.NatMed.2012;18(3):375-7.NSCLC少見的融合基因類型TakeuchiK,etal.NatMed.2012;18(3):378-81.1、ROS1融合基因5種類型占比1-2%索坦有效2、RET融合基因2種類型占比1%索坦有效3、MPRIP-NTRK1/CD74-NTRK1罕見48化療藥物順鉑ERCC1;BRCA1mRNA表達水平

XRCC1(2項);ERCC1;ERCC2;GSTP1;GSTM1;MRP2基因多態(tài)性卡鉑紫杉醇TUBB3;STMN1;TaumRNA表達水平

CYP2C8*3;GSTP1;GSTM1;GSTT1基因多態(tài)性

多西他賽長春瑞濱長春花堿培美曲塞TSmRNA表達水平；DPYD基因多態(tài)性吉西他濱RRM1mRNA表達水平；RRM1;CDA基因多態(tài)性依托泊苷（VP16）TOP2AmRNA表達水平；CYP3A4*4;MDR1基因多態(tài)性伊立替康UGT1A1*6;UGT1A1*28基因多態(tài)性

絲裂霉素NQO1基因多態(tài)性異環(huán)磷酰胺CYP2C9*3基因多態(tài)性靶向藥物貝伐珠單抗VEGFRmRNA表達水平厄洛替尼；吉非替尼EGFR(Exon18/19/20/21);K-ras(2項);B-raf基因突變西妥昔單抗尼妥珠單抗K-ras(2項);B-raf;PIK3CA(2項)基因突變；EGFRmRNA表達水平EGFRmRNA表達水平帕尼單抗；?？颂婺崾婺崽婺酼EGFR;PDGFRβmRNA表達水平；C-kit(4項);PDGFRα(2項)基因多態(tài)性索拉非尼PDGFRβ;VEGFRmRNA表達水平

克唑替尼c-METmRNA表達水平

ROS1;EML4-ALK融合基因非小細胞肺癌個體化診治檢測系統(tǒng)化方案49PinoMS,etal.Gastroenterology.2010Jun;138(6):2059-72.結直腸癌分子模型K-RAS突變在結直腸癌是早期的分子事件50K-ras突變：1、K-rasExon12、13密碼子突變用愛必妥無效2、原發(fā)灶和繼發(fā)灶的樣本都可以用作檢測3、B-raf突變(V600E)預后較差、愛必妥治療效果不好MSI1、50歲以下的結腸癌患者推薦做MMR錯配基因突變檢測2、MSI-HLynch綜合征風險增加3、指導腸癌的化療51Lynch的意義應更早給予更密集的結腸鏡檢查

對未發(fā)生結腸癌的基因突變攜帶者，應從20歲～25歲起（或在家族中最早確診結腸癌者診斷年齡前10年）進行結腸鏡檢查，每1～2年1次，35歲后每年1次，并切除檢查中發(fā)現(xiàn)的結腸腺瘤，可有效的預防結直腸癌。對于女性先證者或親屬，可能還要考慮進一步監(jiān)測子宮內膜癌危險

每年接受一次婦科檢查、經陰道超聲檢查和血清CA125水平檢查，以預防子宮內膜癌和卵巢癌

5253結直腸癌個體化診療檢測系統(tǒng)方案

藥物靶標指標適用樣本適用技術奧沙利鉑順鉑ERCC1XRCC1GSTP1

SNP全血（抗凝）/口腔粘膜細胞/各種組織Lunaprobe探針+qPCRERCC1

BRCA1mRNA表達

手術/穿刺樣本/全血（抗凝）熒光定量PCR氟尿嘧啶類（5-FU，

卡培他濱）TYMSMTHFRSNP全血（抗凝）/口腔粘膜細胞/各種組織Lunaprobe探針+qPCRDPD

西妥昔單抗

帕尼單抗EGFR

KRAS

體細胞突變手術/穿刺樣本

/胸水/血清或血漿qPCR+HRMEGFRmRNA表達手術/穿刺樣本/全血（抗凝）熒光定量PCR

伊立替康UGT1A1多態(tài)性（SNP）全血（抗凝）/口腔粘膜細胞/各種組織Lunaprobe探針+qPCR54胃癌個體化診療檢測系統(tǒng)方案

藥物靶標指標適用樣本適用技術

卡鉑ERCC1

BRCA1

mRNA表達水平

手術/穿刺樣本/全血（抗凝）熒光定量PCR

順鉑紫杉醇TUBB3

STMN多西紫杉醇

培美曲賽TYMS

吉西他濱RRM1

依托泊苷TOP2A

曲妥珠單抗（Herceptin）HER2基因擴增手術/穿刺組織FISHHER2蛋白表達IHC

伊立替康

UGT1A1多態(tài)性（SNP）全血/口腔粘膜細胞Lunaprobe探針+qPCR55肝癌個體化診療檢測系統(tǒng)方案

藥物靶標指標適用樣本適用技術順鉑ERCC1

BRCA1

mRNA表達水平

手術/穿刺樣本/全血（抗凝）熒光定量PCR奧沙利鉑5-FUTYMS

卡培他濱

索拉菲尼PDGFRAEGFR吉西他濱RRM156胰腺癌個體化診療檢測系統(tǒng)方案

藥物靶標指標適用樣本適用技術順鉑ERCC1

BRCA1

mRNA表達水平

手術/穿刺樣本/全血（抗凝）熒光定量PCR奧沙利鉑5-FUTYMS

卡培他濱

厄洛替尼EGFREGFRKRAS體細胞突變手術/穿刺樣本/血清或血漿qPCR+HRM吉西他濱RRM1mRNA表達水平手術/穿刺樣本/全血（抗凝）熒光定量PCR0FISH+–可接受赫賽汀治療可接受赫賽汀胃癌治療的歐盟標準1+2+3+IHC腫瘤標本HerceptinEUSmPC:.57CKIT+PDGFRA檢測與胃腸間質瘤GIST：由突變的C-kit或PDGFRa驅動；組織學上多由梭形細胞、上皮樣細胞、偶或多形性細胞，排列成束狀或彌漫狀圖像，免疫組化檢測通常為CD117或DOG-1表達陽性。58推薦存在以下情況時，應該進行基因學分析(1)對疑難病例應進行c-kit或PDGFRA突變分析，以明確GIST的診斷；(2)術前擬用分子靶向治療者；(3)所有初次診斷的復發(fā)和轉移性GIST，擬行分子靶向治療；(4)原發(fā)可切除GIST手術后，中-高度復發(fā)風險，擬行伊馬替尼輔助治療；(5)鑒別NF1型GIST、完全性或不完全性Carney’s三聯(lián)征、家族性GIST以及兒童GIST；(6)鑒別同時性和異時性多原發(fā)GIST；(7)繼發(fā)性耐藥需要重新檢測。中國胃腸間質瘤診斷治療共識(2013年版)59治療過程中是否受益？是否有轉移、復發(fā)？腫瘤療效、轉移復發(fā)監(jiān)控循環(huán)腫瘤細胞（CTC）601869年AustMedJ，Ashworth最早在轉移性癌癥患者血液中觀察到。2005年NEnglJMed，Cristofanilli證實治療前CTC數(shù)目是轉移性乳腺癌患者無進展生存期和總生存期的獨立預測因子。循環(huán)腫瘤細胞指從實體瘤中脫離出來并進入外周血液循環(huán)的腫瘤細胞。循環(huán)腫瘤細胞（CTC）原發(fā)腫瘤血管生成浸潤侵入血管內侵入血管外

(CTC)血管內增殖

(CTM)轉移轉移播散腫瘤細胞（DTC）微轉移休眠灶循環(huán)腫瘤細胞（CTC）循環(huán)腫瘤

微栓（CTM）凋亡的CTC浸潤腫瘤細胞

擴增血管生成上皮－間質轉化（EMT）間質－上皮轉化（MET）轉移到骨髓和其他器官61化療前后CTC的數(shù)量變化反映臨床療效：化療后CTC數(shù)量減少患者的臨床療效好于CTC數(shù)量增加的患者

CTC在區(qū)分良惡性腫瘤中作用：在30.6%的原發(fā)性肺癌患者能檢測到CTC。CTC在肺癌患者中的計數(shù)顯著高于非惡性疾病患者

CTC在判斷是否存在轉移中有重要參考價值：對于原發(fā)性肺癌患者，CTC計數(shù)在有遠處轉移的肺癌患者中有顯著升高

62CTC檢測方案舉例手術效果評估手術前CTC，術后三天CTC，術后三周CTC放/化療效果實時監(jiān)測放/化療前CTC，一個月CTC，三個月CTC術后復查（年檢），CTC檢測6364強生CellSearch系統(tǒng)FDA和CFDA認證的循環(huán)腫瘤細胞監(jiān)測儀64結合FISH技術，大大提高檢出率獲取活細胞，后續(xù)研究CellSearch系統(tǒng)iFISH-CTC技術血源細胞腫瘤細胞免疫磁珠

CK+CD45--DAPI+免疫染色免疫染色+FISH

FISH

CK+CD45--DAPI+富集非血源性腫瘤細胞的目的個性化添加新的腫瘤標志物陰性富集CTC結合FISH檢測技術優(yōu)勢65外周血循環(huán)腫瘤細胞檢測循環(huán)腫瘤細胞CTC陰性富集：廣泛適用性不依賴腫瘤細胞標示物通用于所有實體腫瘤適用于所有非血源性循環(huán)稀有細胞的富集適用于多標本來源：血液、胸腹水等富集后的細胞處于自然狀態(tài)，便于進行一系列后續(xù)檢測1針對不同癌種，特異性探針組合、探針-蛋白組合，提高靈敏性引入CD45染色，排除血源性異常細胞干擾，提高特異性以FISH技術為平臺，基因、蛋白水平多重檢測：細胞鑒別、計數(shù)和分子分型及細胞表型分析蛋白聯(lián)合核酸，細胞形態(tài)與遺傳信息改變明了66分子病理學檢測標本的要求合格的標本是分子病理檢測的首要條件組織形態(tài)保持完整，細胞結構清晰滿足檢測方法所需的細胞質量和數(shù)量所含生物分子結構和數(shù)量達到檢測要求67標本類型新鮮組織：手術切除組織，穿刺組織，內窺鏡活檢組織。石蠟包埋標本是分子病理檢測主要標本：手術切除組織，穿刺組織，內窺鏡活檢組織細胞學標本：胸腹水、沖洗液和痰液等血液標本：血清、血漿、循環(huán)全血。68標本處理----固定對病理分析有很大的影響，特別是免疫組化和分子病理檢測。需要病理醫(yī)生，臨床醫(yī)生和手術室護士的密切配合。固定液：10%中性福爾馬林液固定液容量：固定組織的3-5倍，至少浸沒整個標本固定組織：大標本需要切開固定固定開始時間：組織離體0.5h之內。固定時長：小組織一般固定6～12h，較大的標本需固定6～48h。69標本固定對DNA影響70基因芯片熒光原位雜交（FISH）基因測序PCR檢測熒光定量PCR分子病理檢測平臺71Real-TimePCR即實時熒光定量PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應中每一個循環(huán)擴增產物量的變化，通過Ct值和標準曲線的分析對起始模板進行定量分析。72高通量測序平臺IlluminaHiseq新一代測序系統(tǒng)

IonPGM

新一代測序系統(tǒng)IonProton

新一代測序系統(tǒng)73第一代測序技術：雙脫氧鏈終止法，即Sanger測序，利用DNA聚合酶及雙脫氧鏈終止物測定DNA核苷酸序列的方法。通量低，不能滿足大規(guī)模檢測基因的要求第二代測序技術（新一代測序，NGS）：在芯片上擴增形成簇，從系列圖像中讀取每一點的堿基序列。高通量，速度快，，直接通過聚合酶或連接酶進行體外測序合成，測序儀能檢測稀有基因突變領域。包含全基因組測序、外顯子組測序及目標測序74人乳頭瘤病毒（HPV）基因分型檢測

——子宮頸癌早期篩查采用基因芯片檢測技術，利用微量點樣，將26種HPV型特異性探針點樣于基因芯片基質上，制成基因芯片；經過對樣本中的DNA進行PCR擴增、雜交和顯色，最后通過HPV分型基因芯片檢測閱讀系統(tǒng)自動采集圖像并分析和報告檢測結果，可一次性檢測26種HPV亞型。具體檢測流程：宮頸刷取樣—DNA提取—PCR擴增—雜交—顯色—掃描分析，整個流程操作約需5.5小時。75序號FISH

項目名稱項目內涵1HER-2基因熒光原位雜交（FISH）檢測為乳腺癌、胃癌等腫瘤患者使用靶向治療藥物（赫賽?。┨峁┯盟巺⒖?TOPO2A基因熒光原位雜交（FISH）檢測評估乳腺癌預后；乳腺癌蒽環(huán)類藥物化療方案用藥指導3EGFR擴增基因熒光原位雜交（FISH）檢測非小細胞肺癌TKI靶向藥物用藥指導4ALK基因熒光原位雜交（FISH）檢測輔助診斷漸變性大細胞淋巴瘤；非小細胞肺癌靶向藥物用藥指導5C-MET擴增基因熒光原位雜交（FISH）檢測非小細胞肺癌TKI靶向藥物用藥指導6PTEN基因熒光原位雜交（FISH）檢測評估肺癌的惡性程度與預后7N-myc基因熒光原位雜交（FISH）檢測神經母細胞瘤預后判斷81p、19q缺失基因熒光原位雜交（FISH）檢測少突膠質細胞瘤臨床治療指導和預后判斷9SYT基因熒光原位雜交（FISH）檢測輔助診斷滑膜肉瘤10EWSR1基因熒光原位雜交（FISH）檢測輔助診斷尤文氏肉瘤11PAX3-FKHR基因熒光原位雜交（FISH）檢測輔助診斷腺泡狀橫紋肌肉瘤12TMPRSS2-ETS基因熒光原位雜交（FISH）檢測輔助臨床早期診斷前列腺癌76序號項目名稱項目內涵13IGH/BCL2基因熒光原位雜交（FISH）檢測輔助診斷濾泡性淋巴細胞瘤14IGH/c-myc基因熒光原位雜交（FISH）檢測輔助診斷伯基特淋巴瘤15IGH/CCND1基因熒光原位雜交（FISH）檢測輔助診斷套細胞淋巴瘤16AP12/MALT1基因熒光原位雜交（FISH）檢測指導針對胃MALT淋巴瘤患者的抗幽門螺旋桿菌治療17IGH/MALT1基因熒光原位雜交（FISH）檢測輔助診斷粘膜相關淋巴組織淋巴瘤18BCL6基因熒光原位雜交（FISH）檢測輔助診斷彌漫性大B細胞淋巴瘤193、7、16p、17染色體基因熒光原位雜交（FISH）檢測無創(chuàng)的泌尿系統(tǒng)移行上皮癌早期診斷；泌尿系統(tǒng)腫瘤術后復發(fā)監(jiān)測20hTERC擴增基因熒光原位雜交（FISH）檢測區(qū)分ASC-US/CINⅠ和CINⅡ/CINⅢ,明確病理分級，指導治療方案選擇；TERC基因擴增者，向宮頸癌發(fā)展風險高于50%，宜采取積極治療方式。21EGFR基因突變檢測非小細胞肺癌TKI靶向藥物用藥指導22KRAS&BRAF基因突變檢測非小細胞肺癌、結直腸癌TKI靶向藥物用藥指導23KRAS基因突變檢測非小細胞肺癌、結直腸癌TKI靶向藥物用藥指導24BRAF基因突變檢測甲狀腺癌、黑色素瘤等靶向藥物的用藥指導77序號項目名稱項目內涵25C-KIT&PDGFRA基因突變檢測胃腸間質瘤靶向藥物用藥指導26PIK3CA非小細胞肺癌靶向藥物用藥指導27BRCA1&BRCA2評估患者患遺傳性乳腺癌或卵巢癌的風險28結直腸癌MSI評估結直腸癌患者預后，并預測5-FU類化療藥物的療效29淋巴瘤基因重排輔助診斷淋巴瘤30UGT1A1基因多態(tài)性指導化療藥物伊立替康的臨床使用31XRCC1基因多態(tài)性指導鉑類化療藥物的臨床使用32TYMS基因多態(tài)性指導氟類化療藥物的臨床使用33TMPT基因多態(tài)性指導巰嘌呤類藥物的臨床使用34CYP2D6基因多態(tài)性指導他莫昔芬在乳腺癌治療中的臨床使用35腫瘤細胞化療藥物敏感試驗評估化療藥物敏感性與耐藥性78膀胱癌的臨床分期可分為表淺性膀胱癌和肌層浸潤性膀胱癌兩大類。膀胱癌分期肌層浸潤性膀胱癌(占15%-25%)表淺性膀胱癌（占75%-85%）T2-T4Tis（約占10%）Ta（約占70%）T1（約占20%）FISH檢測膀胱癌79膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的腫瘤，是世界十大惡性腫瘤之一，我國男性膀胱癌發(fā)病率位居泌尿生殖系惡性腫瘤發(fā)病率第一位，居全身腫瘤的第八位，女性排在第十二位以后。膀胱癌中大約90%為尿路上皮細胞癌（TCC），10%的為鱗狀上皮細胞癌或者腺癌。75%的膀胱癌是“淺表性的”（也就是pTa、pT1或是pTIS），其中的50%-80%的患者可能會一次或者多次復發(fā)，15-25%的患者將發(fā)展成為侵襲性腫瘤。

“淺表性”膀胱癌的患者應該經常接受膀胱鏡以及脫落細胞學檢查來監(jiān)測腫瘤復發(fā)和進展。概要80膀胱鏡檢查和脫落細胞學檢查也是對40歲以上并出現(xiàn)血尿的患者的常規(guī)檢查項目。然而大量的研究證明，脫落細胞學對于膀胱癌檢測的靈敏度非常低，膀胱癌檢驗方法亟待提高。最新研究表明，能夠特定檢測染色體數(shù)目變化及基因位點缺失情況的熒光原位雜交（FISH）技術很好地填補了常規(guī)方法的不足，與常規(guī)方法相結合大大提高了膀胱癌的診斷水平。概要8182

膀胱癌中幾乎所有的染色體都可能發(fā)生數(shù)目和結構的畸變，只是某些染色體的變化較其它染色體更為常見，如1、3、4、7、8、9、10、11、12、13、17、18和20號染色體，其中又以9號染色體的改變最為多見9號染色體或其部分區(qū)域的缺失是最常見的遺傳變異。9p21(P16)缺失是尿路上皮癌早期最常見的改變之一Veeramachaneni等對121例膀胱癌進行了研究，3號染色體多倍體高達76%。7號染色體多倍體發(fā)生率大約為13.0%-76.2%。7號染色體多倍體與膀胱癌的分級、分期正相關。17號染色體多倍體發(fā)生率大約為12%-47%，其多倍體與分期、分級顯著相關。分子基礎82尿路上皮癌的早期診斷

細胞遺傳學改變通常早于細胞形態(tài)學變化。甚至有報導部分初次膀胱鏡活檢未發(fā)現(xiàn)病變而FISH檢測結果為陽性的病例，在12個月內再次活檢時發(fā)現(xiàn)了膀胱尿路上皮癌。尿路上皮癌的復發(fā)檢測

文獻報道FISH結果陽性的膀胱癌患者在兩年內復發(fā)的比例明顯高于FISH結果陰性的膀胱癌患者（P＜0.05）。輔助鑒別診斷腎盂尿路上皮癌和腎細胞癌

腎盂被覆尿路上皮，其癌變也會發(fā)生相應四個指標的異常，因此對于腎盂癌和腎癌難以鑒別情況下，應用FISH技術可以簡便的進行鑒別診斷以及確認腫瘤來源。臨床價值83膀胱癌患者-FISH陽性

（雜I區(qū)：3,7,17號染色體非整倍體；雜II區(qū)：p16基因缺失）雜I區(qū)雜II區(qū)3（綠）；7（青）；17（紅）

3（綠）；p16（紅）84正常人尿脫落細胞-FISH陰性

（3,7,17號染色體整倍體、p16基因正常）雜I區(qū)雜II區(qū)853，7，17號染色體著絲粒探針和9p21區(qū)帶探針包含了膀胱癌中出現(xiàn)頻率最高的染色體變異。用于血尿病人中膀胱癌早期診斷以及膀胱癌術后復發(fā)的一項輔助檢測手段。研究表明，9號染色體部分或全部丟失在50%膀胱癌患者中有發(fā)生，與復發(fā)相關。3號染色體多倍體發(fā)生率約76%，與復發(fā)有關。7號染色體多倍體發(fā)生率約13%～76%，與分期分級相關，可預測腫瘤的浸潤性。17號染色體多倍體發(fā)生率12%～47%，與分期分級顯著相關。檢驗結果的解釋

晨尿200ML（夜起尿分開收集），要求在2個小時內處理86檢測出了XX癌癥化療放療靶向藥物CTC循環(huán)腫瘤細胞化療藥物的敏感性檢測化療藥物的毒副作用檢測放療的敏感性檢測放療的毒副作用檢測對藥物敏感：建議使用該藥物對藥物不敏感：建議換用其他藥物對藥物毒副作用耐受高：建議使用該藥物對藥物毒副作用耐受低：建議換其他藥物對放療敏感：建議使用放療對放療不敏感：建議不使用放療對放療毒副作用耐受高：建議使用放療放療毒副作用耐受低：建議不使用放療手術、放療或化療后進行循環(huán)腫瘤細胞的監(jiān)測建議使用靶向藥建議不使用靶向藥腫瘤治療過程分子學應用87腫瘤分子分型88腫瘤分子分型（Molecularclassification）89定義：通過綜合的分子遺傳學分析，為疾病分類提供更多的生物學信息，從而使疾病分類的基礎從宏觀形態(tài)學轉向以分子病理特征為主要依據的新分類體系（molecularpathologycharacteristics-basedclassification）1999年由美國國立癌癥研究所率先提出

最早于2000年在乳腺癌中得到很好應用腫瘤分子分型的意義90腫瘤異質性的分子表現(xiàn)

從分子水平解釋了腫瘤臨床生物學行為、預后及療效的差異性

更好地預測腫瘤復發(fā)、轉移及預后

為腫瘤個體化治療提供直接依據2013年StGallen國際乳腺大會乳腺癌分子分型與全身輔助治療專家共識分子分型臨床病理學替代指標定義治療原則腔面A型同時滿足：ER和PR+，HER2–,Ki67低表達，多基因表達檢測結果為低復發(fā)風險（如果多基因表達檢測可行）內分泌治療效果最佳，通常僅需內分泌治療腔面B型腔面B型（HER2–）：ER+,HER2–,且至少滿足以下一條：Ki67高表達、PR-或低表達、多基因表達檢測結果為高復發(fā)風險（如果多基因表達檢測可行）全部患者均需內分泌治療，大部分患者需要加用化療腔面B型（HER2+）：ER+,HER2過表達或基因擴增,任何狀態(tài)Ki67、任何狀態(tài)PR化療+抗HER2治療+內分泌治療HER2過表達型HER2+(非腔面型）：HER2過表達或基因擴增,

ER和PR-化療+抗HER2治療基底細胞樣型三陰性（導管癌）:ER和PR-,HER2–化療，三陰性還包括某些特殊組織學類型：內分泌反應型（篩狀癌、小管癌和黏液癌），推薦內分泌治療。內分泌無反應型（大汗腺癌、髓樣癌、腺樣囊性癌和化生性癌），推薦化療91乳腺癌21基因檢測內容及結果

21基因檢測的基因分為6組：1.增殖組：BIRC5（Survivin)、MKI67、MYBL2、CCNB1(CyclinB1)、STK152、侵襲組：CTSL2(CathepsinL2)、MMP11(Stromelysin3)3、HER2組：GRB7、HER24、雌激素組(ER組）：ESR1、PGR、BCL2、SCUBE25、其他基因組：CD68、GSTM1、BAG16、參照基因組：ACTB（Beta-actin)、GAPDH、RPLPO、GUSB、TFRC

得到結果：ER評分，PR評分，HER2評分得到陰陽性結果。復發(fā)風險評分（RS），10年復發(fā)風險檢測結果為“復發(fā)風險評分”，分值為0-100分。<18分為復發(fā)低危；18-30為復發(fā)中危；>31為復發(fā)高危。復發(fā)高危的患者采用輔助性化療更有效。判讀標