正向遺傳學(xué)技術(shù)

正向遺傳學(xué)技術(shù)正向遺傳學(xué)傳統(tǒng)的遺傳學(xué)手段大致可以分為“正向遺傳學(xué)”（forwardgenetics）和“反向遺傳學(xué)”（reversegenetics）兩類兩者之間正如字面上所說是相反的，正向遺傳學(xué)是從表型變化研究基因變化，反向遺傳學(xué)則是從基因變化研究表型變化。正向遺傳學(xué)是指，通過生物個體或細胞的基因組的自發(fā)突變或人工誘變，尋找相關(guān)的表型或性狀改變，然后從這些特定性狀變化的個體或細胞中找到對應(yīng)的突變基因，并揭示其功能簡單的說，正向遺傳學(xué)是從表型變化研究基因變化優(yōu)點：可以通過突變現(xiàn)象來揭示基因功能缺點：在操作過程中需要進行誘變篩選，并且要有很多的實驗個體才能具有可信度，故技術(shù)周期長；突變還存在有不定向性和低頻性，故得到預(yù)想中的實驗個體很難；同時得到突變基因也很難。正向遺傳學(xué)技術(shù)流程第一步；誘變篩選，包括兩種一是大規(guī)模誘變篩選，二是插入誘變篩選。在果蠅的大規(guī)模誘變篩選中，常染色體隱性突變篩選引入平衡染色體大大簡化了該過程，平衡染色體有三個特點；一是含有大規(guī)模的染色體易位，具有正常功能但不會與相應(yīng)染色體間進行同源重組，從而保證了突變的遺傳穩(wěn)定性。二是該染色體上含有一個顯性標記基因，以便鑒別含有該染色體的個體。三是在純合狀態(tài)下是致死的。用于進行化學(xué)誘變的果蠅品系相應(yīng)染色體中帶有一個隱性標記基因

其中平衡染色體上帶有一顯性標記基因只是沒標出來，并純合致死。它會抑制染色體間的重組。圖中T是代表溫度敏感致死基因，在29℃中培養(yǎng)胚胎會死。a代表隱性標記基因，＊代表新的突變基因插入誘變篩選：利用轉(zhuǎn)座子或病毒載體做誘變劑。還是以果蠅為例，轉(zhuǎn)座子p因子存在于某些果蠅類群中，它可以隨機插入基因組中，并且可以在基因組中移動，完整的p因子包括轉(zhuǎn)座所需的特殊序列和一個轉(zhuǎn)座酶編碼基因。在插入誘變中采用的p因子是缺陷型的，缺乏有功能的轉(zhuǎn)座酶基因，這是為了避免p因子在突變體中隨機移動以保證突變體的穩(wěn)定。p因子介導(dǎo)的誘變篩選是通過不同品系果蠅的雜交來實現(xiàn)的具體步驟如下一品系有缺陷型p因子，另一品系有轉(zhuǎn)座酶雜交后F1代生殖細胞中，轉(zhuǎn)座酶會誘導(dǎo)p因子在基因組中隨機轉(zhuǎn)座引起突變。F1與野生型雜交，F(xiàn)2就會含有雜合突變個體，同時p因子與轉(zhuǎn)座酶基因分離，從而保證后代突變穩(wěn)定性，之后近交獲得純合突變個體進行研究，這一方法的缺點在于p因子的插入位點并不是完全隨機的，不具有普遍性。第二步；突變基因的克隆。得到所需的突變體后就需要對引起突變的目的基因進行克隆，同時還要確定所得的基因就是要找的目的基因，當它滿足以下三點才可以確定；一是在該突變體中要檢測到相應(yīng)的基因突變，并且該突變足以引起改基因的失活或功能異常。二是改基因的野生型能夠使突變體表型恢復(fù)。三是在野生型個體中，通過技術(shù)手段阻斷該基因的功能，該個體應(yīng)表現(xiàn)出與突變體一致的表型基因的克隆有兩種方式。一是；對與p因子或病毒載體引起的插入突變。這種克隆比較簡單，可以用p因子序列作為探針，從該突變體的基因組文庫中篩選出含有p因子的克隆，從而確定p因子插入位點和被阻斷的基因，也可用pcr技術(shù)確定插入位點。二是；對于化學(xué)誘變劑或射線照射引起的突變這種就困難的多，多數(shù)情況下要采用定位克隆。它是根據(jù)目的基因在染色體上的位置進行基因分離，通過分析突變位點與已知分子標記的連鎖關(guān)系來確定突變基因的染色體位置，定位的精確程度是定位克隆成功的關(guān)鍵，它取決于已知染色體分子標記的精確程度并需要足夠大的突變體類群。定位克?、僖郧笆峭ㄟ^家系連鎖分析資料或染色體微小缺失(雜合性丟失)等數(shù)據(jù)，確定基因在染色體上的位置；現(xiàn)在是分子標記檢測手段（簡單序列長度多態(tài)性SSLPs，限制片段長多多態(tài)性RFLPs，單核苷酸多態(tài)性SNPs)的分析，可以將突變基因定位到幾百kb范圍內(nèi)，更加的精確。②過去通過染色體步移(chromosome

walking)、染色體區(qū)帶顯微切割等技術(shù)，獲得突變基因所在區(qū)段的DNA片段，現(xiàn)在隨著許多模式生物基因組測序的完成，相應(yīng)序列只需要進行數(shù)據(jù)庫搜索就可以獲得。這種方法非常的簡單快捷。。③首先通過生物信息學(xué)等手段確定該片段可能含有的基因，并根據(jù)這些基因的可能功能及該突變體的表型初步判斷候選基因。④從這些片段中進一步篩選目的基因，并作突變檢測驗證和功能分析正向遺傳學(xué)技術(shù)的應(yīng)用在對斑馬魚造血系統(tǒng)進行研究時,其發(fā)育早期身體透明,有利于在體視鏡下直接觀察血液系統(tǒng)的發(fā)生發(fā)展：如血液的循環(huán)、心臟的跳動、血細胞的數(shù)量等；并且血細胞的譜系及調(diào)節(jié)血細胞的基因與哺乳動物高度保守；并且斑馬魚心血管系統(tǒng)早期發(fā)育與人類極為相似,而血液和心血管系統(tǒng)有缺陷的突變體仍然可以存活數(shù)天,為該領(lǐng)域研究提供了極為有利的條件。鑒于這些優(yōu)點,斑馬魚成為了造血系統(tǒng)研究的最佳模式生物,尤其特別適宜于N—乙基—N—亞硝基脲(N-e