植物遺傳轉(zhuǎn)化

植物遺傳轉(zhuǎn)化的策略與方法楊清植物轉(zhuǎn)基因研究概況遺傳轉(zhuǎn)化的策略遺傳轉(zhuǎn)化的主要方法植物轉(zhuǎn)基因現(xiàn)狀1983年比利時(shí)根特大學(xué)Montagu實(shí)驗(yàn)室、孟山都公司Fraley領(lǐng)導(dǎo)的研究小組、華盛頓大學(xué)Chilton的研究室首次將外源基因轉(zhuǎn)入煙草、胡蘿卜。到1993年，世界上轉(zhuǎn)基因成功的植物就已突破60種，至今已有35科120多種植物轉(zhuǎn)基因獲得成功。從1986年首批轉(zhuǎn)基因植物被批準(zhǔn)進(jìn)入田間試驗(yàn)，至今國際上已有30個(gè)國家批準(zhǔn)數(shù)千例轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)入田間試驗(yàn)，涉及的植物種類有40多種。主要包括延熟番茄,抗除草劑的玉米、棉花、大豆和油菜,抗蟲的馬鈴薯、棉花和玉米,抗病毒的西葫蘆、南瓜和番木瓜,雄性不育的玉米和萵苣,以及改變油脂特性的油菜和大豆等。1987年我國首次獲得轉(zhuǎn)Ｂt基因的煙草和番茄以來，相繼獲得了轉(zhuǎn)Ｂt基因的棉花、水稻、玉米等。我國目前正在研究的轉(zhuǎn)基因植物有47個(gè)種，涉及的各類基因103個(gè)。遺傳轉(zhuǎn)化的策略按目的基因數(shù)量單基因轉(zhuǎn)化雙基因轉(zhuǎn)化多基因轉(zhuǎn)化(同源重組構(gòu)建多基因雙元載體)Multiple-roundinvivosite-specificassemblyMultiRoundGateway多聚蛋白酶解法依賴歸巢酶的pRCS/pAUX和

pSAT載體系統(tǒng)Cre/loxP位點(diǎn)特異重組系統(tǒng)MultiSiteGateway(常規(guī)的)酶連重組法BiBAC/TAC大分子量DNA轉(zhuǎn)化法多基因轉(zhuǎn)化方法連續(xù)再轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)基因植物雜交聚合法多載體共轉(zhuǎn)化法多基因載體轉(zhuǎn)化法

多重同源重組法:一種基于同源重組構(gòu)建多基因雙元載體的方法(張興國)按目的基因?qū)胛恢眉?xì)胞核葉綠體按啟動(dòng)子的類型組成型啟動(dòng)子特異性啟動(dòng)子遺傳轉(zhuǎn)化的主要方法農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化基因槍法電擊法注射法化學(xué)藥劑誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化花粉管通道法根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化系統(tǒng)外植體+農(nóng)桿菌共培養(yǎng)芽誘導(dǎo)抗生素篩選生根培養(yǎng),植株再生分子檢測,轉(zhuǎn)基因植株獲得技術(shù)特點(diǎn)：轉(zhuǎn)化拷貝數(shù)低攜帶目的基因片段大整合后外源基因結(jié)構(gòu)變異小操作簡便等優(yōu)點(diǎn)該技術(shù)已成為轉(zhuǎn)化成功最多的一種轉(zhuǎn)化方法基因槍法(particlegun)又稱微彈轟擊法(microprojectilebombardment或particlebombardment)。該法借助高速運(yùn)動(dòng)的金屬粒子將附著于其表面的核酸分子引入受體細(xì)胞，外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞核后整合到染色體組，然后通過組織培養(yǎng)再生出完整個(gè)體(植株)。優(yōu)點(diǎn)：受體材料來源廣泛靶受體類型廣泛縮短了轉(zhuǎn)基因周期、轉(zhuǎn)基因植株變異率低及通常具有正常的育性缺點(diǎn)：轉(zhuǎn)化效率不高多拷貝插入費(fèi)用較高電擊法又稱電穿孔法(electroporation)。在高壓電脈沖作用下，使新鮮分離的原生質(zhì)體質(zhì)膜形成可逆性瞬間通道，外源DNA穿過通道進(jìn)入細(xì)胞，并整合到染色體組。

優(yōu)點(diǎn)：不受宿主限制操作簡便對(duì)植物細(xì)胞不產(chǎn)生毒性轉(zhuǎn)化效率較高，特別適于瞬間表達(dá)缺點(diǎn)：易造成原生質(zhì)體的損傷存在原生質(zhì)體再生困難注射法開始用于動(dòng)物卵細(xì)胞，后來被用于植物。用顯微注射儀把外源DNA溶液注入到子房或胚囊中，由于子房或胚囊中產(chǎn)生高的壓力及卵細(xì)胞的吸收，使外源DNA進(jìn)入受精的卵細(xì)胞中，從而獲得轉(zhuǎn)基因植株。對(duì)于子房大、多胚珠的作物，可以說是一種簡便可行的轉(zhuǎn)化途徑。化學(xué)藥劑誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化

常用的化學(xué)誘導(dǎo)劑：聚乙二醇(PEG)多聚鳥氨酸(PLO)聚乙烯醇(PVA)PEG是一種細(xì)胞融合劑。PEG法是最常用的化學(xué)基因轉(zhuǎn)化方法,它是將Ti質(zhì)粒與原生質(zhì)體共同培養(yǎng)在含有PEG和Ca2+的溶液中，在高pH值條件下,原生質(zhì)體攝取外源DNA分子,然后經(jīng)再生獲得轉(zhuǎn)基因植株。優(yōu)點(diǎn)：不受宿主范圍的限制操作簡便成本底缺點(diǎn)：一般只適用于原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化，而原生質(zhì)體再生植株并不容易，轉(zhuǎn)化效率低;再生植株常不可育或形態(tài)異常、多拷貝插入等現(xiàn)象。花粉管通道法利用開花植物授粉后形成的花粉管通道，直接將外源目的基因?qū)肷胁痪邆湔＜?xì)胞壁的卵、合子或早期胚胎細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)目的基因的轉(zhuǎn)化。步驟：１）去除花冠;２）用微量注射器從斷面沿花柱中軸插入子房長度的約１／４處，再退回２毫米左右;３）注入含外源目的基因的緩沖液;４）正常管理，收獲種子,經(jīng)篩選獲得轉(zhuǎn)基因植株。技術(shù)特點(diǎn)：直接、簡便易行;不需要組織培養(yǎng)的繼代，從而排除了植株再生的障礙；但轉(zhuǎn)化效率較低；適合于花器官較大的植物。小結(jié)

雖然有不同轉(zhuǎn)基因方法，但使用最為廣泛的方法仍是農(nóng)桿菌法和基因槍法兩種方法。轉(zhuǎn)化方法的選擇，取決于植物種類和實(shí)驗(yàn)室自身具備的條件。遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)例類黃酮3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶

3GT基因馬鈴薯塊莖中的特異表達(dá)受體材料:

馬鈴薯品種Desiree目標(biāo)基因