非那西丁體外溫孵實驗

非那西丁體外溫孵實驗成員：

實驗目的1.肝微粒體溫孵液中對乙酰氨基酚濃度測定方法的建立。2.熟練操作HPLC。3.了解肝微粒體。實驗內容1.建立非那西丁體外溫孵實驗測定其代謝速率的實驗方案。2.開發(fā)大鼠肝微粒體溫孵液中對乙酰氨基酚測定的方法，制備對乙酰氨基酚的標準曲線，并采用HPLC法建立標準曲線用于肝微粒體溫孵液中對乙酰氨基酚濃度測定。肝微粒體簡介肝細胞內還含有肝微粒體，是藥物代謝及生物轉化的重要場所。肝微粒體實質上由內質網(wǎng)碎片和核糖核酸顆粒組成。內含多種與過氧化氫有關的酶系，又稱過氧小體，內含膽固醇合成酶系，類固醇，膽紅素和藥物結合酶系，以及與藥物代謝有關的酶系，可使脂溶性藥物代謝成水溶性藥物，經(jīng)腎臟排泄。肝微粒體受到損害時，藥物代謝發(fā)生障礙，藥物作用時間延長。制備肝微粒體的方法有超速離心法、鈣沉淀法、聚乙二醇法等。

實驗過程一、肝微粒體溫孵液的制備。

肝微粒體的制備方法:1.取大鼠禁食24h,斷頭處死放盡血液，迅速剖開腹腔取出肝臟，剪碎肝組織，用預冷的Tris緩沖液洗凈血污，再用濾紙吸干表面水分后稱重，按1:3加入PBS后，加水至1000ml，冰浴，用玻璃勻漿器制成肝勻漿，于4°C，12500r離心20min，取上清液，與88mmol/LCaCl2混勻，4°C27000離心20min，取沉淀，再用0.1mmol/LTris緩沖液沖洗，4°C27000離心緩沖20min，取沉淀。實驗過程2.重懸沉淀

將沉淀物懸浮于含20%甘油的磷酸鉀緩沖液中（1g組織加入1ml含20%甘油的磷酸鉀緩沖液），反復在冰水浴中吹打均勻，凍存管分裝后置-80℃冰箱內保存待用。3.蛋白定量

采用BCA法測定肝微粒體蛋白濃度。二、溫孵實驗。肝微粒體（0.2mg/mL,80μL），非那西丁溶液（5，7.5，10，15，20，25，30，40，60，80，100μmol/L）,100mmol/L磷酸鉀緩沖（pH7.4）37℃水浴預溫孵5min。加入NADPH體系溶液（10mmol/L葡糖－6－磷酸、1U·m/L葡糖－6－磷酸脫氫酶，4mmol/L氯化鎂，啟動劑，40μL），在37℃水浴溫孵30min后，

加入冰甲醇（終止試劑，100μL），終止溫孵。實驗過程實驗過程（為了考察大鼠微粒體反應中合適的終止試劑，對冰甲醇和冰乙腈的終止效果進行比較分析。發(fā)現(xiàn)選用冰乙腈作為終止試劑時，對乙酰氨基酚出峰位置存在干擾，而選用冰甲醇時，無內源性干擾，因此選用冰甲醇作為終止試劑。）4℃下12000r/min離心15min，取上清液40μL進行HPLC分析。

實驗過程三、HPLC測定肝微粒體溫孵液中對乙酰氨基酚濃度。色譜條件：ShimadzuShim－PackVP－ODS柱(150mm×4.6mm，5μm)流速：1.0mL/min柱溫：室溫檢測波長：245nm采用梯度洗脫：流動相A為100mmol/L磷酸二氫鈉緩沖液（pH4.3），B為乙腈。0～12min，A—B(90∶10)，12～17min，A—B(75∶25)，17～29min，A－B(75∶25)，29～35min，A－B(90∶10)，35～40min，A－B(90∶10)HPLC四、建立標準曲線與測定非那西丁體外溫孵液代謝速率。建立對乙酰氨基酚標準曲線取對乙酰氨基酚儲備液，已含有失活微粒體的甲醇水溶液(1∶1)稀釋成0.2，1，2，5，10，20μmol/L的系列標準微粒體樣品，分別加入等體積的內標(10μmol/L間乙酰氨基酚)，取20μL按照色譜條件進行HPLC分析，測定對乙酰氨基酚含量。以對乙酰氨基酚與內標峰面積比值(Y)為縱坐標，對乙酰氨基酚濃度(X，μmol/L)為橫坐標，繪制標準曲線。數(shù)據(jù)處理記錄HPLC中對乙酰氨基酚和間乙酰氨基酚的峰面積，通過標準曲線計算出產(chǎn)物中對乙酰氨基酚濃度，以非那西丁濃