蛋白質與酶工程第四章酶分子修飾

Chapter4ModificationofEnzymeMolecule酶的分子修飾與化學催化劑相比，酶缺點醫(yī)用酶缺點：穩(wěn)定性差、分子量大、成本高、來源有限、有異體反應工業(yè)酶缺點：熱穩(wěn)定性差、活力低、耐受pH范圍窄酶的分子工程分子生物學水平，即用基因工程方法對DNA進行分子改造，以獲得化學結構更為合理的酶蛋白對天然酶分子進行改造，包括酶一級結構中氨基酸置換、肽鏈切割、氨基酸側鏈修飾等Contentsofchapter41、什么是酶分子修飾2、酶分子修飾的基本要求和條件3、酶分子的修飾方法4、酶修飾后的性質變化GoGoGoGo5、酶的定向進化Go4.1什么是酶分子修飾？通過各種方法使酶分子的結構發(fā)生某些改變，從而改變酶的某些特性和功能的技術過程稱為酶分子修飾。酶分子修飾蛋白酶化學修飾物理修飾金屬離子置換修飾側鏈基團修飾主鏈修飾核酶核苷酸鏈剪切修飾核苷酸置換修飾酶的化學修飾定義從廣義講，凡涉及共價或部分共價鍵的形成或破壞的轉變都可看作是酶的修飾從狹義講，酶的化學修飾則是指在較溫和的條件下，以可以控制的方式使一種蛋白質同某些化學試劑起特異反應，從而引起單個氨基酸殘基或其功能基團發(fā)生共價的化學改變酶分子修飾的意義提高酶的活力activity增強酶的穩(wěn)定性stability降低或消除酶的抗原性immunologicalproperty研究和了解酶分子中主鏈、側鏈、組成單位、金屬離子和各種物理因素對酶分子空間構象的影響structure

回本章目錄4.2酶分子修飾的基本要求和條件

對酶分子進行修飾必須在修飾原理、修飾劑和反應條件的選擇以及酶學性質等方面都要有足夠的了解。（1）酶的穩(wěn)定性熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、作用溫度、pH、抑制劑等。（2）酶活性中心的狀況

活性中心基團、輔因子等。其他如分子大小、性狀、亞基數(shù)等。酶分子修飾的條件修飾反應盡可能在酶穩(wěn)定條件下進行，并盡量不破壞酶活性功能的必需基團，使修飾率高，同時酶的活力回收高。（1）pH與離子強度

pH決定了酶蛋白分子中反應基團的解離狀態(tài)。由于它們的解離狀態(tài)不同，反應性能也不同。（2）修飾反應的溫度與時間

嚴格控制溫度和時間可以減少以至消除一些非專一性的修飾反應。（3）反應體系中酶與修飾劑的比例

回本章目錄修飾反應專一性的控制試劑的選擇反應條件的選擇反應的專一性修飾反應專一性的控制試劑的選擇：選擇試劑在很大程度上要依據(jù)修飾的目的。選擇蛋白修飾應注意問題包括：

1）修飾反應要完成到什么程度；

2）對個別氨基酸是否專一；

3）在反應條件下，修飾反應有沒有限度；

4）修飾后蛋白的構象是否基本保持不變；

5）是否需要分離修飾后的衍生物；

6）反應是否需可逆；

7）是否適合于建立快速、方便的分析方法。反應條件的選擇不造成蛋白質的不可逆變性有利于專一性修飾蛋白4.3酶分子的修飾方法金屬離子置換修飾,大分子結合修飾(共價/非共價)側鏈基團修飾肽鏈有限水解修飾氨基酸置換修飾酶分子的物理修飾

(1)酶的金屬離子置換修飾把酶分子中的金屬離子換成另一種金屬離子，使酶的特性和功能發(fā)生改變的修飾方法稱為金屬離子置換修飾。α-淀粉酶中的鈣離子（Ca2+），谷氨酸脫氫酶中的鋅離子(Zn2+)，過氧化氫酶分子中的鐵離子(Fe2+)，?；被崦阜肿又械匿\離子（Zn2+）,超氧化物歧化酶分子中的銅、鋅離子(Cu2+,Zn2+)若從酶分子中除去其所含的金屬離子，酶往往會喪失其催化活性。如果重新加入原有的金屬離子，酶的催化活性可以恢復或者部分恢復。若用另一種金屬離子進行置換，則可使酶呈現(xiàn)出不同的特性。有的可以使酶的活性降低甚至喪失，有的卻可以使酶的活力提高或者增加酶的穩(wěn)定性。金屬離子置換修飾的過程a.酶的分離純化：首先將欲進行修飾的酶經(jīng)過分離純化，除去雜質，獲得具有一定純度的酶液。

b.除去原有的金屬離子：在經(jīng)過純化的酶液中加入一定量的金屬螯合劑，如乙二胺四乙酸（EDTA）等，使酶分子中的金屬離子與EDTA等形成螯合物。通過透析、超濾、分子篩層析等方法，將EDTA-金屬螯合物從酶液中除去。此時，酶往往成為無活性狀態(tài)。

c.加入置換離子：于去離子的酶液中加入一定量的另一種金屬離子，酶蛋白與新加入的金屬離子結合，除去多余的置換離子，就可以得到經(jīng)過金屬離子置換后的酶。金屬離子置換修飾只適用于那些在分子結構中本來含有金屬離子的酶。用于金屬離子置換修飾的金屬離子，一般都是二價金屬離子。

金屬離子置換修飾的作用

闡明金屬離子對酶催化作用的影響提高酶的催化效率增強酶的穩(wěn)定性改變酶的動力學特性(2)酶的大分子修飾使用一些能與酶非共價地相互作用而又能有效地保護酶的一些添加物，如聚乙二醇、右旋糖苷等，它們既能通過氫鍵固定在酶分子表面，也能通過氫鍵有效地與外部水相連，從而保護酶的活力。一些添加物，如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通過調(diào)節(jié)酶的微環(huán)境來保護酶的活力。另一類添加物就是蛋白質。蛋白質分子之間相互作用時，其表面區(qū)域內(nèi)排除了水分子，因而增加了相互作用力，其穩(wěn)定性也就增加了。非共價修飾采用水溶性大分子與酶蛋白的側鏈基團(共價)結合使酶分子的空間構象發(fā)生改變，從而改變酶的特性與功能的方法用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通過共價鍵連接于酶分子的表面，形成一層覆蓋層。例如：用聚乙二醇修飾超氧物歧化酶，不僅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延長了酶在體內(nèi)的半衰期從而提高了酶藥效。每分子核糖核酸酶與6.5分子的右旋糖酐結合，可以使酶活力提高到原有酶活力的2.25倍；每分子胰凝乳蛋白酶與11分子右旋糖酐結合，酶活力達到原有酶活力的5.1倍共價修飾大分子修飾(共價)的過程修飾劑的選擇：大分子結合修飾采用的修飾劑是水溶性大分子。例如，聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐、蔗糖聚合物（Ficoll）、葡聚糖、環(huán)狀糊精、肝素、羧甲基纖維素、聚氨基酸等。要根據(jù)酶分子的結構和修飾劑的特性選擇適宜的水溶性大分子。修飾劑的活化：作為修飾劑中含有的基團往往不能直接與酶分子的基團進行反應而結合在一起。在使用之前一般需要經(jīng)過活化，然后才可以與酶分子的某側鏈基團進行反應。修飾：將帶有活化基團的大分子修飾劑與經(jīng)過分離純化的酶液，以一定的比例混合，在一定的溫度、pH值等條件下反應一段時間，使修飾劑的活化基團與酶分子的某側鏈基團以共價鍵結合，對酶分子進行修飾。分離：需要通過凝膠層析等方法進行分離，將具有不同修飾度的酶分子分開，從中獲得具有較好修飾效果的修飾酶。大分子修飾的作用

通過修飾提高酶的催化效率增強酶的穩(wěn)定性降低或消除酶蛋白的抗原性聚乙二醇是線性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在體內(nèi)無毒性、無殘留、無免疫原性，并可消除酶的抗原性，使其末端活化后可以與酶產(chǎn)生交聯(lián)，因而，它被廣泛用于酶的修飾。酶

半衰期相對穩(wěn)定性

天然SOD6min1

右旋糖酐-SOD7h70Ficoll(低分子量)–SOD14h140Ficoll(高分子量)–SOD24h240

聚乙二醇-SOD

35h

350可用多種不同試劑活化，修飾不同基團聚乙二醇均三嗪、聚乙二醇琥珀酰亞胺聚乙二醇馬來酸酐、聚乙二醇胺(3)酶分子的側鏈基團修飾采用一定的方法（一般為化學法）使酶蛋白的側鏈基團發(fā)生改變，從而改變酶分子的特性和功能的修飾方法?？梢杂糜谘芯扛鞣N基團在酶分子中的作用及其對酶的結構、特性和功能的影響。在研究酶的活性中心中的必需基團時經(jīng)常采用。酶蛋白的側鏈基團是指組成蛋白質的氨基酸殘基上的功能團。主要包括氨基、羧基、巰基、胍基、酚基等。這些基團可以形成各種副鍵，對酶蛋白空間結構的形成和穩(wěn)定有重要作用。側鏈基團一旦改變將引起酶蛋白空間構象的改變，從而改變酶的特性和功能。催化活性/非催化活性基團的修飾對非催化基團修飾可改變酶的動力學性質，改變酶對特殊底物的束縛能力。

經(jīng)常被修飾的殘基是： 親核的Ser、Cys、Met、Thr、Lys、His 親電的Tyr、Trp對催化活性基團可以通過選擇性修飾側鏈成分來實現(xiàn)氨基酸的取代。氨基修飾采用某些化合物使酶蛋白側鏈上的氨基發(fā)生改變，從而改變酶蛋白的空間構象的方法稱為氨基修飾。凡能夠使蛋白質側鏈上的氨基發(fā)生改變的化合物，稱為氨基修飾劑，主要有：亞硝酸、二硝基氟苯、醋酸酐、琥珀酸酐、二硫化碳、乙亞胺甲酯、O-甲基異脲、順丁烯二酸酐等。這些氨基修飾劑作用于蛋白質側鏈上的氨基，可以產(chǎn)生脫氨基作用或與氨基共價結合將氨基屏蔽起來。例如，用亞硝酸修飾天冬酰胺酶，使其氨基末端的亮氨酸和肽鏈中的賴氨酸殘基上的氨基產(chǎn)生脫氨基作用，變成羥基。經(jīng)過修飾后，酶的穩(wěn)定性大大提高，使其在體內(nèi)的半衰期延長2倍；用O-甲基異脲修飾溶菌酶，使酶分子中的賴氨酸殘基上的氨基與它結合，將氨基屏蔽起來，修飾后，酶活力基本不變，但穩(wěn)定性顯著提高，而且很容易形成結晶。常見基團的化學修飾反應：氨基羧基修飾采用各種羧基修飾劑與酶蛋白側鏈的羧基進行酯化、酰基化等反應，使蛋白質的空間構象發(fā)生改變的方法稱為羧基修飾?？膳c蛋白質側鏈上的羧基反應的化合物稱為羧基修飾劑，如乙醇-鹽酸試劑、碳化二亞胺、異惡唑鹽等。常見基團的化學修飾反應：羧基胍基修飾蛋白質分子中精氨酸殘基的側鏈含有胍基。采用二羰基化合物與胍基反應生成穩(wěn)定的雜環(huán)，從而改變酶分子的空間構象的方法稱為胍基修飾。用作胍基修飾劑的二羰基化合物主要有環(huán)己二酮、丙二醛、苯乙二醛等。常見基團的化學修飾反應：胍基巰基修飾蛋白質分子中半胱氨酸殘基的側鏈含有巰基。巰基在許多酶中是活性中心的催化基團，巰基還可以與另一巰基形成二硫鍵，所以巰基對穩(wěn)定酶的結構和發(fā)揮催化功能有重要作用。使酶蛋白側鏈上的巰基發(fā)生改變，從而改變酶的空間構象、特性和功能的修飾方法稱為巰基修飾。常用的巰基修飾劑有：二硫蘇糖醇、巰基乙醇、硫代硫酸鹽、硼氫化鈉等還原劑以及各種?；瘎?、烷基化劑等。常見基團的化學修飾反應：巰基酚基修飾蛋白質分子的酪氨酸殘基上含有酚基。使酚基發(fā)生改變，從而改變酶蛋白的空間構象的修飾方法稱為酚基修飾。酚基修飾的方法主要有碘化法、硝化法、琥珀?；ǖ?。例如，枯草桿菌蛋白酶的第104位酪氨酸殘基上的酚基經(jīng)四硝基甲烷（TNM）硝化修飾后，生成硝基酚殘基，由于負電荷的引入，使酶對帶正電荷的底物的結合力顯著增加；葡萄糖異構酶經(jīng)過琥珀酰化修飾后，其最適pH值下降0.5單位，并增加酶的穩(wěn)定性。常見基團的化學修飾反應：酚基咪唑基修飾組氨酸含有咪唑基，咪唑基多為酶活性中心的必須基團修飾劑：碘乙酸、焦炭酸二乙酯常見基團的化學修飾反應：咪唑基吲哚基修飾色氨酸含有吲哚基，色氨酸殘基疏水性強，通常位于分子內(nèi)部，難于修飾修飾劑：N－溴代琥珀酰亞胺2－羥基－5－硝基芐溴4－硝基苯硫氯常見基團的化學修飾反應：色氨酸吲哚基分子內(nèi)交聯(lián)修飾含有雙功能基團的化合物（雙功能試劑）如戊二醛、己二胺、葡聚糖、二乙醛等，可以在酶蛋白分子中相距較近的兩個基團之間形成共價交聯(lián)，從而提高酶的穩(wěn)定性的修飾方法(4)酶蛋白主鏈修飾(肽鏈有限水解修飾)利用酶分子主鏈的切斷和連接，使酶分子的化學結構及其空間結構發(fā)生某些改變，從而改變酶的特性和功能的方法。主鏈切斷的三種情況：活性中心破壞——失活活性中心完整——保持活性，改變抗原性有利于活性中心的形成——顯示活性或活力提高主鏈連接將兩種或兩種以上的酶通過主鏈連接在一起，形成一個酶分子具有兩種或多種催化活性。酶蛋白主鏈修飾主要是靠酶切/酶原激活法。a、胃蛋白酶原的激活b、胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活c、胰凝乳蛋白酶原（chymotrypsinogen）的激活核苷酸鏈剪切修飾某些酶經(jīng)核苷酸剪切修飾后，由無活性變成有活性的酶。(5)氨基酸置換修飾一、定義：將肽鏈上的某一個氨基酸換成另一個氨基酸，引起酶蛋白空間構象的改變，從而改變酶的某些特性和功能的方法。aa是酶的化學結構和空間結構的基礎。二、aa置換修飾酶的作用

2、增強酶的穩(wěn)定性

1、提高酶活力3、使酶的專一性發(fā)生改變：酪氨酰-tRNA合成酶：催化Tyr和所對應的tRNA合成酪氨酰-tRNA。該酶的Thr51若被pro置換，酶對ATP的親和性提高近100倍，酶活力提高25倍。T4-溶菌酶：Ile3被Cys置換后，Cys-3可與Cys-97形成二硫鍵，置換后的T4-溶菌酶，其活力保持不變，但該酶的穩(wěn)定性卻大大提高。枯草桿菌蛋白酶:活性中心上的Ser置換成Ile后，酶對蛋白質和多肽的水解活性消失，而出現(xiàn)催化硝基苯酯進行水解反應的活性。

氨基酸置換修飾方法氨基酸或核苷酸的置換修飾可以采用化學修飾方法，例如，Bender等成功地利用化學修飾法將枯草桿菌蛋白酶活性中心的絲氨酸轉換為半胱氨酸，修飾后，該酶失去對蛋白質和多肽的水解能力，卻出現(xiàn)了催化硝基苯酯等底物水解的活性。但是化學修飾法難度大，成本高，專一性差，而且要對酶分子逐個進行修飾，操作復雜，難以工業(yè)化生產(chǎn)。

現(xiàn)在常用的氨基酸置換修飾的方法是定點突變技術。定點突變（sitedirectedmutagenesis）是20世紀80年代發(fā)展起來的一種基因操作技術。是指在DNA序列中的某一特定位點上進行堿基的改變從而獲得突變基因的操作技術。是蛋白質工程（ProteinEngineering）和酶分子組成單位置換修飾中常用的技術。定點突變技術，為氨基酸或核苷酸的置換修飾提供了先進、可靠、行之有效的手段。酶分子的定點突變1、酶分子結構設計（根據(jù)已知的酶結構和其存在的問題）2、突變基因序列的確定（考慮物種差異）3、突變基因的獲得（DNA合成儀＋PCR）4、新酶的獲得（重組、轉入宿主、表達）核苷酸置換修飾

將酶分子核苷酸上的一個核苷酸換成另一個核苷酸的修飾方法，稱為核苷酸置換修飾。核苷酸置換修飾通常采用定點突變技術(6)酶分子的物理修飾通過物理修飾，可以了解不同物理條件下，特別是在極端條件下（高溫、高壓、高鹽、極端pH值等）由于酶分子空間構象的改變而引起酶的特性和功能的變化情況。特點在于不改變酶的組成單位及其基團，酶分子中的共價鍵不發(fā)生改變，只是在物理因素的作用下，副鍵發(fā)生某些變化和重排?；乇菊履夸?.4酶修飾后的性質變化熱穩(wěn)定性：一般來說，熱穩(wěn)定性有較大的提高。抗原性：比較公認的是PEG和人血清白蛋白在消除酶的抗原性上效果比較明顯。各類失活因子的抵抗力：修飾酶對蛋白酶、抑制劑均有一定的抵抗能力，從而提高其穩(wěn)定性。半衰期：一般在體內(nèi)的半衰期得到有效延長。由于酶分子經(jīng)修飾后，增強對熱、蛋白酶、抑制劑等的穩(wěn)定性，從而延長了在體內(nèi)的半衰期。最適pH：大部分酶經(jīng)化學修飾后，酶的最適pH發(fā)生了變化，這種變化在應用研究上有時具有重要意義。修飾酶最適pH更接近于生理環(huán)境，在臨床應用上有較大意義。Km的變化：大多數(shù)酶經(jīng)修飾后，Vm沒有明顯變化，但有些酶經(jīng)修飾后，Km值變大。回本章目錄4.5酶的定向進化一、概念分子定向進化：是在試管中模擬達爾文進化的過程，對蛋白質（酶）的編碼基因利用隨機突變和隨機雜交的方法加以改造，通過大規(guī)模篩選技術，從而得到性能上改良的優(yōu)異變種。使蛋白質（酶）在自然界需要幾百萬年才能完成的進化過程縮短至幾個月，為蛋白質（酶）的工程應用提供了一個強有力的技術手段。屬于蛋白質的非合理設計，它不需要事先了解酶的空間結構和催化機制，人為地創(chuàng)造特殊的進化條件，模擬自然進化機制（隨機突變，基因重組和自然選擇），在體外改造沒，并定向選擇（篩選）出所需要性質的突變酶?？梢源偈谷后w生物大分子向任意功能目標計劃，從而獲得或改良功能大分子。二、基本原理合理設計與非合理設計：在比較充分了解酶的結構和功能的基礎上對酶分子進行改造，稱為合理設計；不需要準確的酶分子結構信息，通過隨機突變，基因重組，定向篩選等方法對其進行改造，稱為酶分子的非合理設計?；炯夹g手段：易錯PCR，DNA重組，高突變菌株等技術。酶的合理設計實驗室定向進化示意圖隨機突變+定向選擇＝目標突變體細菌誘發(fā)突變的因素50

0C培養(yǎng)突變體庫選擇壓力（溫度）溫度耐受型突變體最適生長溫度為370C最適生長溫度提高了！體外定向進化的意義理論上，蛋白質分子蘊藏著很大的進化潛力，很多功能有待于開發(fā)，這是酶的體外定向進化的基本先決條件。

天然酶在生物體內(nèi)存在的環(huán)境與商業(yè)用酶的實際應用環(huán)境不同。人們需要某些酶的進化性質與生物體內(nèi)的生化反應無關，而只是與人們的商業(yè)需求有關，這種性質只能通過體外進化來實現(xiàn)。實際應用中，總是期待酶活性和穩(wěn)定性越高越好，但在生物體內(nèi)更重要的是各種生物分子之間的協(xié)同作用，作為一個整體來適應環(huán)境。對于酶分子來說，其活性和穩(wěn)定性已經(jīng)超過了滿足整個體系在環(huán)境中生存的需要時，它們的提高就顯得沒有必要了，也就是失去了進化的篩選壓力，因此進化的機會很有限，這就為體外定向進化留下了很大的進化空間。酶定向進化的基本過程基因的隨機突變+定向選擇酶基因隨機突變構建突變基因文庫篩選負突變基因正突變基因進化酶反復進行易錯PCRDNA重排基因家族重排平板篩選法熒光篩選法噬菌體表面展示法細胞表面展示法核糖體表面展示法高通量篩選技術三、酶分子定向進化的方法1、易錯PCR：易錯PCR是在采用Taq酶進行PCR擴增目的基因時，通過調(diào)整反應條件，使得擴增產(chǎn)物具有適當?shù)腻e配，也就是產(chǎn)生適當?shù)耐蛔冾l率。將擴增產(chǎn)物制做成表達型突變基因文庫，再從中篩選出所需的突變基因。適當?shù)耐蛔冾l率突變頻率不能太高，也不能太低，理論上每個靶基因導入的取代殘基在1.5～5個為宜。通常經(jīng)一次突變的基因很難獲得滿意的結果，常需要進行連續(xù)易錯PCR。

連續(xù)易錯PCR：即將一次PCR擴增得到的有用突變基因作為下一次PCR擴增的模版，連續(xù)反復地進行隨機誘變，使每一次獲得的小突變積累而產(chǎn)生重要的有益突變。易錯PCR法連續(xù)易錯RCR易錯PCR效果舉例Chen和Arnold用此策略定向進化枯草桿菌蛋白酶E的活性獲得成功，所得突變體PC3催化效率kcat/Km分別是野生型酶的157倍；將PC3再進行兩個循環(huán)的定向進化，產(chǎn)生的突變體13M的kcat/Km又比PC3提高了3倍，達到天然酶催化效率的471倍。2、DNA改組技術DNA改組（DNAshuffling）技術又稱DNA重排技術，是從兩種以上的同源正突變基因出發(fā)，用酶切成隨機片段，經(jīng)過不加引物的多次PCR循環(huán)，使DNA的堿基序列重新排布而引起基因突變的技術過程。

此方法又稱為有性PCR(SexualPCR),通過將親本基因群中的突變盡可能組合在一起,以導致更大的變異,最終獲得具有最佳突變組合DNA改組DNA改組效果舉例1994年由Stemmer等人首次提出，使用該技術使β-內(nèi)酰胺酶定向進化，催化效率提高32000倍。

人們運用類似的方法對水母的綠色熒光蛋白進行定向進化，3輪DNA改組循環(huán)后，得到的突變綠色熒光蛋白的熒光信號比起始蛋白高45倍。Osamu

Shimomura

Martin

Chalfie

Roger

Y.

Tsien

（錢永?。?/p>

2008年10月8日，美Woods

Hole海洋生物學實驗室的下村修、哥倫比亞大學的馬丁-沙爾菲和加州大學圣地亞哥分校的錢永健三位美國科學家，因為在水母中發(fā)現(xiàn)和研究綠色熒光蛋白而獲得2008年諾貝爾化學獎。維多利亞多管水母（Aequorea

victoria）改進GFP的應用前景

藍色熒光蛋白、青色熒光蛋白，綠色熒光蛋白，黃色熒光蛋白，褐色。。。。。。1.提高了GFP的光譜性質，2.提高熒光強度3.提高光穩(wěn)定性4.顏色突變5.pH敏感的突變體

應用GFP研究成果美新奧爾良科學家培育出世界首只能在“黑暗處發(fā)光”的貓

杰夫·利希曼利用熒光蛋白展現(xiàn)了大腦內(nèi)的連接，圖片中美麗的“彩虹”就是神經(jīng)系統(tǒng)網(wǎng)絡

1997年在大阪大學降生的第一種發(fā)光哺乳動物小老鼠兩只熒光豬誕生于中國黑龍江省哈爾濱東北農(nóng)業(yè)大學的實驗室

約克鎮(zhèn)科技公司生產(chǎn)的熒光魚引入市場，熒光蛋白便迅速在商業(yè)上得到應用用不同的“熒光蛋白”讓未知世界顯影

3、交錯延伸法交錯延伸PCR

(StaggerextensionprocessPCR，StEP)是在PCR反應中,將含不同點突變的模板（兩個或多個DNA片段）混合,將常規(guī)的退火和延伸合并為一步,并大大縮短其反應時間（55℃，5s）,從而只能合成出非常短的新生鏈,經(jīng)變性的新生鏈再作為引物隨機地雜交到含不同突變的模板上繼續(xù)延伸,此過程反復進行直至獲得全長基因。結果會產(chǎn)生間隔的含不同模板序列的新生DNA分子。StEP過程1個引物2個模板退火結合延伸產(chǎn)生短片段短片段為引物與模板退火結合繼續(xù)延伸片段至全長的基因長度分離全長基因，加入外源引物擴增全長基因。4、體外隨機重組法隨機引物體外重組技術（random-priminginvitrorecombination，RPR）采用單鏈DNA為模板，配合若干條隨機序列引物進行PCR反應，產(chǎn)生大量互補于模板不同位點的DNA小片段，然后除去模板，這些DNA小片段互為模板和引物進行擴增，通過堿基序列的重新排布而獲得全長突變基因。5、基因家族重排技術基因家族重排技術（genefamilyshuffling）又稱基因家族改組技術，是從基因家族的若干同源基因出發(fā)，用酶（DNaseI）切割成隨機片段，經(jīng)過不加引物的多次PCR擴增，使DNA堿基序列重新排布而引起基因突變的技術過程。82/13883/138DNAshuffling與Familyshuffling：基本過程大致相同出發(fā)基因不同

基因家族同源重組效果舉例Stemmer等從4種微生物中選擇編碼頭孢菌素酶的4個同源基因，對它們進行單獨進化或同源重組進化，來對兩種進化模式進行比較。在對單基因進化得到的進化酶中，對頭孢羥羧氧胺的抗性最高的增加了8倍，而用家族同源重組進化的方法得到的進化酶比兩種天然酶提高了270倍，比另兩種天然酶提高了540倍。四、酶突變基因的定向選擇突變基因的定向選擇基本過程突變基因基因載體突變基因文庫基因重組篩選目的基因（一）

酶突變基因文庫的構建1、構建基因文庫的質量要求文庫的包容性:指構建的文庫必須盡可能地包含基因的任何一種可能的突變信息。文庫的完整性：指文庫中包含的DNA片斷必須盡可能完整地反應基因的結構和功能信息，以便通過篩選得到的突變基因能夠通過表達獲得完整的具有催化功能的進化酶。2構建突變基因文庫的主要過程載體的選擇1）質粒載體：微生物細胞染色體外，閉合環(huán)狀雙鏈DNA分子。2）噬菌體DNA載體：由噬菌體DNA改造而成的具有自我復制能力的載體。3）黏粒載體：是一類人工構建的含有λDNA黏性末端和質粒復制子的質粒載體，又稱為柯斯質粒。4）噬菌粒載體：是一類人工構建的由M13噬菌體單鏈DNA的基因間隔區(qū)與質粒載體結合而成的基因載體?；蛑亟M在體外通過DNA連接酶的作用，將基因與載體連接在一起形成重組DNA的技術過程。黏性末端連接平頭末端連接修飾末端連接形成基因文庫突變文庫的組裝是將重組DNA轉入受體細胞或包裝成有感染活性的重組噬菌體的過程。大腸桿菌轉化技術（二）突變基因的篩選1定向選擇環(huán)境條件的設定根據(jù)定向進化的設定選擇環(huán)境在每一次“突變——篩選”的循環(huán)中加以調(diào)整選擇環(huán)境（1）提高酶的熱穩(wěn)定性：較高溫度下培養(yǎng)重組細胞，每次循環(huán)提高溫度。（2）提高β-內(nèi)酰胺酶的催化效率：一定濃度的β-內(nèi)酰胺類抗生素中培養(yǎng)，每次提高濃度2高通量篩選技術平板篩選法熒光篩選法噬菌體表面展示法細胞表面展示法核糖體表面展示法平板篩選法平板篩選方法是將含有隨機突變基因的重組細胞，涂布在平板培養(yǎng)基上，在一定條件下培養(yǎng)，依據(jù)重組菌細胞的表型鑒定出有效突變基因的篩選方法。特點：簡便、快速、直觀、容易控制和調(diào)整環(huán)境條件依據(jù)：重組細胞的表型細胞生長情況顏色變化情況透明圈情況（1）依據(jù)細胞生長情況篩選突變基因熱穩(wěn)定性：溫度梯度和高溫環(huán)境抗生素耐受性：抗生素濃度梯度pH穩(wěn)定性：pH梯度極端環(huán)境：高鹽、低溫、高濃毒物質（2）依據(jù)顏色變化篩選突變基因反應產(chǎn)物顯色藍白斑篩選（Bluewhitescreening）：誘導物：IPTG底物：X-gal96/138磷酸酯酶水解硝基酚磷酸生成黃色硝基酚；97/138Homogenizedactivatedsludgesamp