微生物的生長

第四章微生物的生長一、微生物的生長二、微生物生長的測定方法第一節(jié)微生物生長的測定

單細(xì)胞微生物也有個體生長和細(xì)胞分裂繁殖這兩個過程。多細(xì)胞微生物的個體生長則反映在個體的細(xì)胞數(shù)目和每個細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)含量的增加。

在實際工作中，單個微生物細(xì)胞太小，研究單個微生物細(xì)胞的生長比較困難，并且也無意義。

微生物的生長是指微生物個體或群體細(xì)胞各組成成分按比例、有規(guī)律地不可逆增加的過程。微生物的生長表現(xiàn)在微生物個體的生長和群體生長2個水平。一、微生物的生長個體生長

個體繁殖

群體生長群體生長=

個體生長

+

個體繁殖

所以，微生物的生長通常是指微生物的群體生長??！也就是說：微生物的生長過程包含了微生物的繁殖過程。

在實際工作中，測定微生物細(xì)胞生長的方法可以分為兩類。生長的

測定方法

細(xì)胞計數(shù)法細(xì)胞生物量的測定

直接計數(shù)法計數(shù)器測定法平板菌落計數(shù)法

比濁法最大概率數(shù)法

間接計數(shù)法涂片計數(shù)法細(xì)胞的自動計數(shù)法干重法含氮量測定法（一）、細(xì)胞計數(shù)法

鏡檢計數(shù)法適用于單細(xì)胞微生物數(shù)量的測定。測定時需借助計數(shù)板和顯微鏡。

細(xì)胞較小的細(xì)菌可采用比得羅夫—霍瑟細(xì)菌計數(shù)板，細(xì)胞較大的酵母菌、真菌孢子和血細(xì)胞則采用血球計數(shù)板。1、直接計數(shù)法（1）計數(shù)器測定法快速簡便，但不能區(qū)別死活菌體，測得的是總菌數(shù)。利用直接計數(shù)法測定微生物細(xì)胞數(shù)量時，菌懸液濃度不宜太低或太高（常大于106個/ml）。（2）涂片計數(shù)法將已知體積的待測樣品，均勻的涂布在載玻片的已知面積內(nèi)，經(jīng)固定染色后，在顯微鏡下選擇若干個視野計算細(xì)胞數(shù)量。

每個視野可用鏡臺測微尺測量直徑并計算面積，從而推算出單位體積樣品中所含的細(xì)胞數(shù)量。（3）細(xì)胞的自動計數(shù)法用電子細(xì)胞計數(shù)器來計數(shù)。電子計數(shù)是通過測定一個小孔中液體的電阻來進(jìn)行。小孔僅能通過一個細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞通過這個小孔時，電阻明顯增加，并作為一個脈沖記錄在一個電子標(biāo)尺上。使一份已知體積含有待測細(xì)胞的液體通過這個小孔，當(dāng)每個細(xì)胞通過時就被計數(shù)了。2、間接計數(shù)法（1）平板菌落計數(shù)法

將待測液按10倍遞增做一系列稀釋，然后選擇其中某連續(xù)三個稀釋度的菌液作涂布平板或傾注平板，在一定的條件下培養(yǎng)，那么分散的每一個細(xì)胞都將發(fā)育成一個菌落，再對平皿中菌落計數(shù)就可以推算出原始樣液中的活菌數(shù)。測得的是活菌數(shù)，手續(xù)繁雜，容易受影響

該方法主要是依據(jù)在適當(dāng)?shù)南♂尪认拢恳粋€微生物細(xì)胞可以繁殖成一個菌落，通過測定菌落的數(shù)量即可來推算菌懸液中的活菌數(shù)。優(yōu)點：測定的是活菌數(shù)。缺點：操作煩瑣，時間長N=每套平板的平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)÷取樣體積數(shù)（2）最大概率數(shù)法

將一定量的稀釋液接種到新鮮合適的培養(yǎng)基上以后不出現(xiàn)繁殖為止。再選擇三個連續(xù)稀釋度作試管培養(yǎng)，根據(jù)出現(xiàn)生長的管數(shù)，查找已編好的MPN（最大概率表），就可以計算出單位體積樣品中細(xì)胞的近似數(shù)。（1）比濁法

是一種快速測定菌懸液中微生物細(xì)胞數(shù)量的方法。當(dāng)光線通過菌懸液時，由于菌體細(xì)胞不能透光，會造成透光率下降。在一定的濃度范圍內(nèi)，微生物細(xì)胞濃度與菌懸液的光密度（OD值）成正比，與透光度成反比。因此，可預(yù)先測定菌液濃度與OD值之間的關(guān)系曲線，然后可據(jù)此查得未知樣品中菌的相對數(shù)量。（二）測定細(xì)胞或原生質(zhì)總量的方法此法簡單快速，但顏色不能太深，不能含有顆粒性雜質(zhì)。2、干重法

取一定量的菌液，用離心或過濾的方法將菌體分離出來，清洗后置于80~100℃烘箱中烘干至恒重或在60℃真空干燥至恒重后稱其重量。一般細(xì)菌干重約為濕重的20%~25%。

適用于含菌量高但不含其他溶性雜質(zhì)的樣品。蛋白質(zhì)是細(xì)胞的主要組分，氮又是蛋白質(zhì)的重要組分，且氮的含量是相對穩(wěn)定的，因此，可以借菌體含氮量來間接表示菌體的含量。

3、總氮量測定法

適用于菌體濃度較高的樣品，一般只適合研究工作。第二節(jié)細(xì)菌的生長曲線一、單細(xì)胞微生物的生長曲線二、掌握微生物生長規(guī)律對工業(yè)生產(chǎn)的指導(dǎo)意義一、單細(xì)胞微生物的生長曲線

細(xì)菌細(xì)胞雖小，但與其他生物細(xì)胞或個體一樣，也有從小到大的生長過程。

將少量的細(xì)菌純培養(yǎng)物接種到恒定體積的液體培養(yǎng)基后，定時取樣測定培養(yǎng)基中的細(xì)胞數(shù)量，可以發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的群體生長具有一定的規(guī)律。

若以時間作橫坐標(biāo)，以活菌數(shù)的對數(shù)值作縱坐標(biāo)，可以繪制出一條類似于S型的曲線，稱為細(xì)菌的生長曲線。

緩慢期對數(shù)期穩(wěn)定期衰亡期t0lgN1、緩慢期（延遲期）

當(dāng)細(xì)菌接種到新鮮的培養(yǎng)基后，細(xì)菌往往不會立即繁殖，需要經(jīng)過一定時間來調(diào)節(jié)自身的生理機能，以適應(yīng)新環(huán)境。因此，在曲線開始的一段時間，細(xì)胞數(shù)量幾乎不增加，生長速率趨近于零，曲線平緩。特點：這個時期的長短與菌種的遺傳性、菌齡、接種菌量、培養(yǎng)條件等因素有關(guān)。緩慢期對數(shù)期穩(wěn)定期衰亡期t0lgN2、對數(shù)期（指數(shù)期）

細(xì)菌在完全適應(yīng)新環(huán)境后，細(xì)胞開始轉(zhuǎn)入旺盛生長，生長速率達(dá)到最大值，細(xì)胞呈幾何級數(shù)（2n）增加，進(jìn)入對數(shù)期。特點：對數(shù)期，培養(yǎng)條件相同時，不同菌種的代時（即繁殖一代所需要的時間）是不相同的，相同菌種的代時則是穩(wěn)定的；培養(yǎng)條件不同時，同一菌種的代時也是不同的。此外，對數(shù)期的菌體整齊、代謝活躍、生長快、染色均勻，群體中的細(xì)胞化學(xué)組成、形態(tài)、生理特征比較一致。緩慢期對數(shù)期穩(wěn)定期衰亡期t0lgN3、穩(wěn)定期（平衡期）

在對數(shù)期以后，由于營養(yǎng)物質(zhì)逐漸消耗，有害代謝產(chǎn)物積累，pH值變化等，使細(xì)胞生活力下降，細(xì)胞的繁殖速率開始下降，而死亡率上升，當(dāng)二者趨于平衡時，群體的活菌數(shù)達(dá)到最高并保持一段時間的相對穩(wěn)定。特點：處于穩(wěn)定器的菌體形態(tài)大小典型，生理生化反應(yīng)相對穩(wěn)定，細(xì)胞開始積累貯存物質(zhì)，如肝糖、異染顆粒、脂肪粒等，大多數(shù)芽孢菌在這個生長階段形成芽孢?？股睾湍承┟割愐苍趯?shù)期和穩(wěn)定期轉(zhuǎn)換階段產(chǎn)生。

緩慢期對數(shù)期穩(wěn)定期衰亡期t0lgN4、衰亡期穩(wěn)定期后如果繼續(xù)培養(yǎng)，菌體就會出現(xiàn)變形、自溶等現(xiàn)象，死亡率逐漸增加，活菌數(shù)迅速減少，這一階段稱為衰亡期。二、掌握微生物生長規(guī)律對工業(yè)生產(chǎn)的指導(dǎo)意義（一）縮短緩慢期（二）延長對數(shù)期（三）控制穩(wěn)定期（四）推遲衰亡期

微生物生長是微生物自身的遺傳特性和外界環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。在一定限度內(nèi)，環(huán)境因子的變化，可導(dǎo)致微生物的形態(tài)、生理或遺傳特性的變化，但如果環(huán)境因子的改變超過了一定限度，則會造成微生物細(xì)胞的死亡。當(dāng)然，微生物也可在一定程度上通過自身的代謝活動來改變環(huán)境條件，使之更適應(yīng)其生存和發(fā)展。

影響微生物生長的環(huán)境因素較多，概括起來有三大類，包括物理、化學(xué)和生物因素。第三節(jié)微生物生存環(huán)境條件環(huán)境因素溫度

水分和滲透壓

pH值

氧氣和Eh

輻射線

超聲波

化學(xué)藥劑

物理因素化學(xué)因素生物因素一、溫度

溫度是微生物生長的重要環(huán)境條件之一，不同微生物的生長繁殖都需要一定的溫度范圍，表現(xiàn)為最低、最適和最高生長溫度（即溫度三基點）。

1、微生物的生長溫度范圍

根據(jù)微生物對溫度的要求和適應(yīng)能力，可將其分為嗜冷、嗜溫和嗜熱微生物三種類型：微生物類型最低(℃)最適(℃)最高(℃)生活環(huán)境嗜冷

微生物

專性

-12

5—15

15—20生活于兩極地區(qū)

兼性

-5—0

10—20

25—30

海水及冷藏食品

嗜溫

微生物

室溫

10—20

25—3040—45

土壤中、植物體內(nèi)等環(huán)境體溫

10—20

37—40

40—45

人及溫血動物體內(nèi)等環(huán)境嗜熱

微生物

專性25—45

50—5570—90生活于堆肥、溫泉、土壤表層等高溫環(huán)境中

2、溫度對微生物的作用

（1）最低生長溫度對微生物的影響

最低生長溫度是微生物生長的溫度下限，低于此溫度，微生物的生長就會受到抑制，但一般不會死亡。因此，可以利用低溫來保藏微生物或者保藏食物，常用的保藏溫度為4-8℃。

從最低生長溫度到最適生長溫度，隨著溫度的上升，細(xì)胞的代謝活性增強，生長速率加快。

（2）最適生長溫度對微生物的影響

最適生長溫度是微生物生長速度最快的溫度，但并非微生物代謝的最適溫度。

如：乳鏈球菌最適生長溫度是34℃，細(xì)胞總量最高的溫度是25-30℃，而發(fā)酵速度最快溫度則為40℃，乳酸產(chǎn)量的最高溫度是30℃。

（3）最高生長溫度對微生物的影響

微生物在最高溫度下僅有微弱生長，而當(dāng)環(huán)境溫度超過微生物生長的最高溫度后，將導(dǎo)致微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)的不可逆破壞，蛋白質(zhì)、酶、核酸變性，最終將殺死微生物。

通常將能在10分鐘內(nèi)殺死微生物的溫度稱為致死溫度。

高溫可以導(dǎo)致微生物細(xì)胞死亡，因此，可以利用高溫來滅菌。

多數(shù)細(xì)菌、酵母菌、真菌和病毒的致死溫度為55-60℃；放線菌和真菌的孢子抗熱性比其營養(yǎng)細(xì)胞強，在75-80℃時，10分鐘才會被殺死；細(xì)菌的芽孢具有高度的耐熱性，可以耐受100℃的高溫；極少數(shù)細(xì)菌，如嗜熱脂肪芽孢桿菌在70℃下可以生長，芽孢在121℃加熱12分鐘才會死亡。致死溫度：3、高溫滅菌的方法

干熱滅菌

濕熱滅菌

焚燒

恒溫干燥法

（耐熱的金屬和玻璃器皿、可燃燒的物品）

（常用，140-160℃，2h；耐熱的物品）

煮沸

巴斯德消毒法間歇滅菌

高壓蒸汽滅菌

超高溫滅菌（100℃，15min以上；不耐熱的物品）

（常用，0.2Mpa，121℃，20min；一般培養(yǎng)基、水、纖維制品）

（0.05MPa，110℃，20min；含糖培養(yǎng)基）

（60-70℃，15-20min；食品、飲料等）（100℃，每次2-3h，2-3次；不耐高溫的藥品，特殊培養(yǎng)基）

（130—140℃，0.5—1s，液體的飲料等）

二、水分和滲透壓

微生物細(xì)胞的含水量一般為70-90%，孢子或芽孢的含水量較低，只有60-70%。水分是微生物細(xì)胞代謝活動必不可少的條件，如果外界環(huán)境過于干燥，將影響微生物的正常代謝，甚至?xí)斐杉?xì)胞死亡。

當(dāng)環(huán)境中缺水或大氣相對濕度低于70%時，微生物細(xì)胞的生長會受到抑制。因此，可以借用干燥的方法來保存食品和物品。

除缺水會直接影響微生物的生長外，當(dāng)環(huán)境中滲透壓發(fā)生改變時，也可能導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生生理性缺水，使細(xì)胞不能進(jìn)行正常的生長代謝。因此，可用蜜餞或鹽漬的方法保存食品。

超聲波是指振動頻率超過2萬Hz的聲波。通過劇烈的振動，使細(xì)胞破裂，引起細(xì)胞內(nèi)含物外泄死亡。

超聲波的破碎效果與處理功率、頻率、處理時間、微生物類型和生理狀態(tài)等因素有關(guān)。

在研究工作中，常用超聲波來破碎細(xì)胞。但超聲波處理時會釋放大量的熱能，所以，必須在冰浴中進(jìn)行，并作短時間的多次處理。三、超聲波(一)pH值

環(huán)境的pH值對微生物的生長有較大的影響。微生物可在pH1-11的范圍內(nèi)生活，但不同的微生物對pH值的適應(yīng)性有較大的差異。大多數(shù)細(xì)菌、放線菌的最適pH值為7.0-8.0，適應(yīng)范圍5.0-10.0，真菌的最適pH值多為3.0-6.0。

pH值的改變常造成微生物代謝途徑的改變，并形成不同的代謝產(chǎn)物。

微生物也可以通過自身的代謝活動改變環(huán)境的pH值，因此控制發(fā)酵液的pH是控制生產(chǎn)的指標(biāo)之一。常用方法：加入緩沖物質(zhì)、適時加無機酸堿或生理活性物質(zhì)等。應(yīng)用pH的殺菌：強酸、強堿具有很強的殺菌力，但無機酸堿對人和器皿的腐蝕性強，故很少采用。乳酸、醋酸等有機酸對環(huán)境危害小，可用作防腐劑。石灰常用于環(huán)境衛(wèi)生的消毒。

（二）氧氣

氧氣對微生物生長的影響也較大。

不同的微生物對氧氣的需求不同，根據(jù)微生物對氧氣的要求，可以將微生物分為五大類：好氧微生物

厭氧微生物

兼性厭氧微生物

微好氧微生物

耐/忌氧微生物

微生物極少單獨存在，總是較多種群聚集在一起，當(dāng)微生物的不同種類或微生物與其他生物出現(xiàn)在一個限定的空間內(nèi)，他們見互為環(huán)境，表現(xiàn)出復(fù)雜的關(guān)系：（一）寄生（二）互生（三）共生（四）拮抗三、生物因素對微生物生長的影響二、化學(xué)消毒劑

不同的化學(xué)藥劑對微生物生長的影響是不同的。大多數(shù)化學(xué)藥劑只有在高濃度時才起殺菌作用，低濃度僅為抑菌作用，而極低濃度則沒有作用或?qū)ξ⑸锏纳L有促進(jìn)作用。

化學(xué)藥劑對微生物的作用取決于藥劑濃度、作用時間和微生物對藥物的敏感性等。研究表明化學(xué)藥劑對微生物的作用主要表現(xiàn)為三方面：（1）破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，如苯酚、乙醇。（2）干擾細(xì)胞能量代謝，如重金屬、CO和氰化物。（3）干擾物質(zhì)合成，如磺胺、氨基酸結(jié)構(gòu)類似物。

根據(jù)化學(xué)藥劑的性質(zhì)和使用目的，可分為五種類型：

有機化學(xué)藥劑無機化學(xué)藥劑染色劑表面活性劑

化學(xué)治療劑三、紫外線和射線

在環(huán)境中存在著各種能量的輻射線，不同能量的輻射線對微生物生長的影響不相同的?？梢姽獠ㄩL397-800nm，是光能自養(yǎng)型和光能異養(yǎng)型微生物唯一的或主要的能量來源。1、紫外線（UV）

紫外線是波長為100-397nm的非電離輻射線，具有較強的殺菌和誘變作用，其最強的作用波長是265-266nm，這也是微生物細(xì)胞核酸的最大吸收波長。

紫外線主要作用于細(xì)胞DNA，使相鄰的胸腺嘧啶形成二聚體、使DNA斷裂或發(fā)生交聯(lián)，最終使微生物細(xì)胞變異或死亡。另外還可促使氧形成臭氧。

通常低劑量的UV可用于誘變育種，而高劑量的UV可殺菌，但其穿透力較弱，一般僅用作空氣、無色的水和器皿表面的滅菌。1.SPF值：一般類型皮膚的人8～12為宜；對光敏感的人12－20為宜；敏感性皮膚應(yīng)挑選植物配方的防曬品或是含有二氧化鈦的物理性防曬霜；只在上下班的路上接觸陽光的上班族，15以下即可，以臉部防曬為主；在野外游玩、海濱游泳時30以上。游泳時最好選用防水的防曬護膚品。2.PA值：PA+有效防護時間大約4小時。PA++有效防護時間大約8小時。PA+++超強防護。2、電離輻射

電離輻射是高能電磁波，包括X-射線、α-射線、β-射線和γ-射線。這些射線的特點是波長短，能量大，穿透力強，殺傷力大。對微生物有致死作用。常用的高能射線是利用60Co源產(chǎn)生的γ-射線?？捎糜诓荒蜔崾称?、塑料制品和草炭吸附劑的滅菌。激光有強烈殺菌能力的波長是在250~800nm間，特別是265nm波長最有效。微波是頻率在3×102~3×105MHz的電磁波。3、激光與微波四、接種室的空氣滅菌五、過濾除菌六、防霉劑1、有機化學(xué)藥劑（1）酚及其衍生物

酚類化合物是醫(yī)學(xué)上常用的消毒劑，其作用主要是損傷微生物的細(xì)胞膜，鈍化酶和使蛋白質(zhì)變性。苯酚的有效殺菌濃度為2-5%，但因具有難聞的氣味和對皮膚的強烈刺激性，很少在臨床上使用。甲酚、間苯二酚等苯酚衍生物的刺激性小，殺菌作用較強，常用于醫(yī)院對痰液、糞便及手術(shù)前的消毒。煤皂酚（來蘇爾）是乳化的甲酚溶液，常用3-5%的煤皂酚來消毒桌面、用具等。

（2）醇類

可通過細(xì)胞膜中的類脂而破壞膜結(jié)構(gòu)，并使蛋白質(zhì)變性，但對芽孢和無囊膜病毒的作用效果較差。70%的乙醇?xì)⒕ψ顝?，常用于皮膚的消毒。加入1%的碘可使其殺菌力大大的增強。異丙醇的殺菌力較乙醇強，揮發(fā)性低，常用于皮膚和用具的消毒。

（3）醛類

醛可與蛋白質(zhì)的多種基團發(fā)生共價結(jié)合而使之變性。37-40%的甲醛溶液俗稱福爾馬林，常用于保存生物標(biāo)本。實驗室用0.5-10%的甲醛溶液，加熱熏蒸進(jìn)行空氣消毒。其缺點是對眼睛和粘膜具有刺激性，穿透力較差，作用慢，氣味難聞。戊二醛的刺激性和異味均較小，殺菌力強，在3-10h內(nèi)可殺死細(xì)菌芽孢，常用2%戊二醛消毒醫(yī)療器械和用具。

（4）酸類

有機酸能抑制微生物酶和代謝活性，對人毒性小，常加入食品、飲料和化妝品中，以防止霉菌生長。山梨酸鉀，苯甲酸鈉等常用于食品防腐。

可用5~10ml/m2的醋酸來熏蒸滅菌，所以釀醋的工人很少感冒。（5）新型有機化學(xué)殺菌劑

環(huán)氧乙烷是目前廣泛應(yīng)用的一種新型空氣和器械表面消毒劑，可使蛋白質(zhì)變性，能在4~18小時內(nèi)殺死微生物細(xì)胞和芽孢，常用于不耐熱物品的消毒，但缺點是毒性大、純品易爆，使用時需與CO2和N2混合使用。

2、無機化學(xué)藥劑

主要包括鹵化物、重金屬、氧化劑、無機酸和堿等。

常用碘和氯。（1）鹵化物碘可與酶或蛋白中的酪氨酸結(jié)合，對各類都有較好的殺菌作用。碘酒可用于皮膚、傷口和粘膜表面的消毒。氯包括氯氣和氯化物，可用作飲水、游泳池、垃圾場器具的消毒。氯氣和氯化物的殺菌作用在于產(chǎn)生次氯酸和原子氧，初生態(tài)的原子氧是強氧化劑，能破壞細(xì)胞膜，殺死微生物。

（2）重金屬及其化合物

重金屬離子具有很強的殺菌效力，以Hg+、Ag+和Cu2+的作用最強。重金屬離子進(jìn)入細(xì)胞后可與酶和蛋白質(zhì)上的巰基（-SH）結(jié)合，使之失活或變性。汞的化合物中常用的是0.1%的升汞（氯化汞）和有機汞，如紅汞、硫柳汞等。由于無機汞毒性較大，并具有殘留毒性，因此無機汞化物只用于種子表皮和器皿表面的消毒。有機汞毒性較小，可用于傷口和皮膚表面的消毒。銀的化合物以硝酸銀應(yīng)用較多，0.1~1%的濃度可用作滴眼劑和皮膚消毒劑。銅的化合物使用最多的是硫酸銅，一般用1ppm的硫酸銅防止藻類在清潔水體中生長。波爾多液是硫酸銅與生石灰（CaO）的混合液，可用于防治農(nóng)作物的真菌病害。

（3）氧化劑

氧化劑主要通過對細(xì)胞成分的氧化作用來達(dá)到殺菌的目的。常用的有0.1%的高錳酸鉀和3%的過氧化氫。臭氧的氧化性非常強，可用于飲水的消毒，但目前的成本比較高。

3、染色劑

許多生物染色劑在低濃度下具有明顯的抑菌效果和一定的特異性。堿性染料的陽離子基團可與蛋白質(zhì)氨基酸上的羧基或核酸上的磷酸基團結(jié)合，從而阻斷正常細(xì)胞的代謝過程。

常用的有結(jié)晶紫、吖啶黃等堿性染料。G+細(xì)菌對堿性染料十分敏感，結(jié)晶紫在3~10ppm即可抑制G+細(xì)菌的生長，而對G-細(xì)菌的抑制濃度達(dá)到100ppm。

4、表面活性劑

表面活性劑是指可降低液體分子表面張力的化學(xué)物質(zhì)，如肥皂、洗衣粉等。表面活性劑能夠影響細(xì)胞膜的穩(wěn)定性和透性，使細(xì)胞的某些必要成分（如K+）流失而引起微生物生長停滯并死亡。肥皂和洗衣粉等陰離子表面活性劑的殺菌力不強，主要通過洗滌來減少微生物的數(shù)量。季胺類陽離子表面活性劑具有