細菌內(nèi)毒素定量分析

細菌內(nèi)毒素光度測定法試驗講義講解董光宴

1、光度測定法概述

2、試劑和儀器3、標準曲線

4、干擾試驗5、檢查法

湛江博康海洋生物有限公司2/1/20231博康一、光度測定法概述1、定量法的概念2、定量法的分類3、定量法的原理2/1/20232博康1定量法的概念

光度測定法分為濁度法和顯色基質法：濁度法系利用檢測鱟試劑與內(nèi)毒素反應過程中的濁度變化而測定內(nèi)毒素含量的方法。根據(jù)檢測原理，可分為終點濁度法和動態(tài)濁度法。動態(tài)濁度法是檢測反應混合物的濁度到達某一預先設定的吸光度所需要的反應時間，或是檢測濁度增加速度的方法。

2/1/20233博康2定量法分類2/1/20234博康3定量法的原理（1）動力學曲線：細菌內(nèi)毒素與鱟試劑反應過程中，隨著反應的進行，混合物會逐漸變混濁，內(nèi)毒素濃度越高濁度變化越快，濁度變化符合反應動力學曲線。2/1/20235博康（2）細菌內(nèi)毒素含量與時間的關系：細菌內(nèi)毒素濃度與反應時間分別取對數(shù)后，將兩組數(shù)據(jù)用最小二乘法統(tǒng)計，可以得到直線：LgT=a+bLgC

我們將這條直線稱為標準曲線。2/1/20236博康（3）、數(shù)學原理原理：OD=-Lg（It/Io）

0.02=-Lg（It/Io）

It=95%Io2/1/20237博康二試劑和儀器光度測定法鱟試劑（生產(chǎn)單位：湛江博康海洋生物有限公司，批號：0907104，檢測限：0.015EU/ml；規(guī)格為1.25ml/支）細菌內(nèi)毒素檢查用水（生產(chǎn)單位：湛江博康海洋生物有限公司，批號：0908030，規(guī)格：2ml/支）2/1/20238博康細菌內(nèi)毒素工作標準品（200966，120EU/支，中國藥品生物制品檢定所提供）氯化鉀注射液（規(guī)格：1g/10ml批號：0911211，生產(chǎn)廠家：河北某制藥廠）細菌內(nèi)毒素定量檢測儀（生產(chǎn)單位：天大天發(fā)科技有限，型號：BET-72）2/1/20239博康三標準曲線1、制作標準曲線的條件2、標準曲線的選擇3、標準曲線的制作4、標準曲線有效的條件5、結果分析2/1/202310博康1制作標準曲線的條件當使用新批號的鱟試劑或試驗條件發(fā)生了任何可能會影響檢驗結果的改變時，需進行標準曲線的可靠性試驗。用標準內(nèi)毒素配成溶液，并制成至少3個濃度的稀釋液（相鄰濃度間稀釋倍數(shù)不得大于10），最低濃度不得低于所用鱟試劑的標示檢測限。2/1/202311博康2標準曲線的選擇

制做標準曲線的內(nèi)毒素濃度可選擇10倍、5倍、4倍和2倍稀釋的等比系列點，也可選擇非等比系列點。一般情況下，我們不推薦10倍和2倍等比系列點，10倍等比系列點（如10EU/ml、1EU/ml、0.1EU/ml和0.01EU/ml）跨度大，其相關系數(shù)R和準確性都受到一定限制；2/1/202312博康2倍等比系列點（如0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml和0.06EU/ml）跨度太小，其相關系數(shù)R和準確性都較好，但很不實用。我們推薦選用4倍等比系列點（如2EU/ml、0.5EU/ml、0.125EU/ml和0.03EU/ml）跨度適中，其相關系數(shù)R和準確性都較好，而且非常實用。2/1/202313博康3標準曲線的制作3.1內(nèi)毒素標準品的溶解稀釋首先將細菌內(nèi)毒素工作標準品用細菌內(nèi)毒素檢查用水1ml溶解，在旋渦混合器上混勻15分鐘，然后制備成2EU/ml、1EU/ml、0.5EU/ml、0.125EU/ml和0.03EU/ml備用。2/1/202314博康200EU/ml20EU/ml2.0EU/ml1.0EU/ml0.5EU/ml0.03EU/ml0.125EU/ml0.3ml0.3ml2.7ml2.7ml1.5ml1.5ml1.5ml1.5ml1.5ml1.5ml0.5ml0.5ml圖示2/1/202315博康3.2定量法鱟試劑的溶解分裝

將復溶好的光度測定法鱟試劑分裝到14支定量分析專用試管中，每管分裝0.1ml。定量法鱟試劑定量試管每管0.1ml2/1/202316博康3.3加樣

將內(nèi)毒素加入定量分析專用試管中，每個濃度做3支平行管，剩下兩管加入BET水作為陰性對照，每管加樣量均為0.2ml。2EU/ml0.5EU/ml0.125EU/ml0.03EU/mlBET水2/1/202317博康注：產(chǎn)品名稱：有機玻璃試管架用

途：細菌內(nèi)毒素檢查定量法中用于擺放小試管。特

點：有機玻璃材料可保護定量法小試管，避免定量法小試管被磨花而影響試驗結果。2/1/202318博康3.4檢測

加樣完畢后用封口膜密封試管，將每支試管在旋渦混合器上點1-3秒，然后將試管對應插入已恒溫的定量檢測儀（37℃），儀器開始自動采集數(shù)據(jù)。注：封口膜的優(yōu)點規(guī)

格：4IN×35FT（4英寸×35英尺）特

點：進口代銷，比較適合用于定量法專用試管的封口，清洗時不留任何殘留物。

2/1/202319博康4標準曲線有效的條件當陰性對照的反應時間大于標準曲線最低濃度的反應時間，將全部數(shù)據(jù)進行線性回歸分析。根據(jù)線性回歸分析，標準曲線的相關系數(shù)（r）的絕對值應該大于或等于0.980，試驗方為有效。平行管的變異系數(shù)＜10%。2/1/202320博康5結果分析

內(nèi)毒素反應時間變異系數(shù)實測內(nèi)毒素0>720000>72002.07900.36%2.01182.07940.511591.01%0.50220.511400.12516200.34%0.12170.12516340.0323980.04%0.03180.032381

標準曲線：LogT=2.9783-0.2621LogC，相關系數(shù)：=-0.9999,標準曲線符合規(guī)定。2/1/202321博康四干擾試驗1、限值的確定2、干擾試驗濃度的計算3、檢測濃度的選擇4、干擾試驗溶液的制備5、供試品溶液的稀釋6、干擾試驗的制備方法7、干擾試驗加樣8、判斷的標準9、試驗結果分析10、結論2/1/202322博康1限值的確定

2010版《中國藥典》二部正文1014頁【氯化鉀注射液】。L=0.12EU/mg2/1/202323博康2干擾試驗濃度的計算

按照中國藥典2010年版提供的公式計算最大有效稀釋倍數(shù)（注：其中標準曲線的最低點λ為0.015EU/ml）。最大有效稀釋倍數(shù)：

MVD=CL/λ=100Х0.12/0.015=800倍2/1/202324博康3檢測濃度的選擇

樣品限值表達方式為EU/ml，直接選用其無干擾濃度并填寫相應稀釋倍數(shù)即可；樣品限值表達方式為EU/mg，無論其干擾情況如何，我們推薦以1mg/ml為初始濃度，選用其以下的無干擾濃度并填寫從1mg/ml開始的相應稀釋倍數(shù)，這樣檢測結果即為樣品每ml或mg中內(nèi)毒素的量。我們將檢測結果直接與限值比較即可。2/1/202325博康4干擾試驗溶液的制備編號內(nèi)毒素濃度被加入內(nèi)毒素的溶液平行管數(shù)A無1.0mg/ml或0.5mg/ml至少2B標準曲線的中點（或附近點）的0.5EU/ml（設為λm）1.0mg/ml或0.5mg/ml至少2C2.0EU/ml、0.5EU/ml、0.125EU/ml、0.03EU/ml四個濃度檢查用水每一濃度至少2D無檢查用水至少22/1/202326博康5供試品溶液的稀釋

用細菌內(nèi)毒素檢查用水將氯化鉀注射液稀釋到2.0mg/ml、1.0mg/ml和0.5mg/ml備用。操作過程必須嚴格遵守無菌操作規(guī)程，保證無外源物質的干擾。

2/1/202327博康

10.0mg/ml

2.0mg/ml1.0mg/ml0.5mg/ml0.3ml2.7ml1.0ml1.0ml0.3ml4.0ml1.0ml0.3ml100mg/ml圖示2/1/202328博康6干擾試驗的制備方法

取氯化鉀注射液的2.0mg/ml、1.0mg/ml稀釋液分別加入四支試管中，每管加0.3ml，然后分別吸取0.3ml的內(nèi)毒素標準溶液，濃度為1.0EU/ml按下圖加入其中兩支試管中，另外吸取0.3ml的檢查用水加入其中另外兩支試管中。將這四支管混合均勻即可得到氯化鉀注射液的1.0mg/ml、0.5mg/ml稀釋液干擾試驗所需樣品溶液。2/1/202329博康氯化鉀注射液內(nèi)毒素標準溶液1.0EU/ml0.3ml0.3ml0.3ml(2.0mg/ml)0.3ml(2.0mg/ml)0.3ml(1.0mg/ml)0.3ml(1.0mg/ml)BET水0.3ml0.3ml圖示2/1/202330博康7干擾試驗加樣

取分裝了0.1ml定量法鱟試劑的定量專用試管10支，每個濃度做2支平行管，氯化鉀注射液的1.0mg/ml、0.5mg/ml稀釋液干擾試驗各4支；另做2支陰性對照，每管加樣量均為0.2ml。加樣完畢后密封試管，將每支試管在旋渦混合器上點1-3秒，然后對應插入定量檢測儀，儀器開始采集數(shù)據(jù)。

2/1/202331博康0.1ml鱟試劑0.1ml鱟試劑0.1ml鱟試劑1mg/ml的加樣0.2ml0.2ml0.5mg/ml的加樣0.2ml陰性對照圖示2/1/202332博康8判斷的標準

按所得線性回歸方程分別計算供試品溶液和含標準內(nèi)毒素的供試品溶液的內(nèi)毒素含量Ct和Cs，再按下式計算該試驗條件下的回收率（R）。R=(CS-Ct)/λm×100%當內(nèi)毒素的回收率在50%-200%之間，則認為在此該試驗條件下供試品溶液不存在干擾作用。2/1/202333博康圖示回收率：

R=(CS-Ct)/λm×100%=×100%2/1/202334博康9試驗結果分析樣品氯化鉀注射液干擾試驗結果2/1/202335博康回收率R：以樣品濃度C=1.0mg/ml（即稀釋倍數(shù)為1)以9、10、11和12管為例，計算該濃度下的回收率（R）。R=(CS-Ct)/λm×100%=（0.4654-0.0122）/0.5×100%=90%注：如果檢測結果小于檢測限，計算回收率時以0計。

2/1/202336博康10結論結論：依據(jù)<中國藥典>2010版附錄“細菌內(nèi)毒素檢查法”，氯化鉀注射液細菌內(nèi)毒素檢查干擾試驗1.0mg/ml和0.5mg/ml的稀釋液符合試驗要求，對鱟試驗沒有干擾。常規(guī)檢查選用其中任一濃度即可。

2/1/202337博康五檢查法1檢測濃度的選擇如樣品有干擾作用，選擇符合干擾試驗要求的第二個濃度作為日常檢查的濃度。2/1/202338博康2試驗有效條件試驗必須符合以下三個條件方為有效：標準曲線要符合“可靠性試驗”中的要求；計算出的內(nèi)毒素的回收率要在50%-200%的范圍內(nèi)；陰性對照的反應時間應大于標準曲線最低濃度的反應時間。

2/1/202339博康

3結果判斷

若供試品溶液所有平行管的平均內(nèi)毒素濃度乘以稀釋倍數(shù)后，小于規(guī)定的內(nèi)毒素限值，判供試品符合規(guī)定。若大于或等于規(guī)定的內(nèi)毒素限值，判供試品不符合規(guī)定。

2/1/202340博康六、光度測的特點1、定量儀器取值方法2、定量法的特點3、動態(tài)濁度法和凝膠法的比較2/1/202341博康1定量儀器取值方法2/1/202342博康1.1透光率反應時間取值法T0.95

在鱟試驗中，細菌內(nèi)毒素濃度與反應達到某一狀態(tài)的時刻有關，只要測出這一時間就可算出內(nèi)毒素的實際濃度，這一過程叫反應時間取值方法。透光率反應時間取值法使用透光率描述鱟試劑的濁度變化。日本的ET-201型儀器采用該方法，即t0.95法。但該法所描述的透光率反應曲線與反應產(chǎn)物的量呈非線性關系。2/1/202343博康1.2光密度反應時間取值法T0.02

光密度限值法預設一個光密度OD值，當反應曲線從開始上升到預設值時經(jīng)理的時間作為反應時間，此方法的優(yōu)點是時刻變化的OD值與反應產(chǎn)物的數(shù)量成正比，也就是吸光度變化曲線與凝膠產(chǎn)物的產(chǎn)生關系呈線性，取OD值上升0.02作為預設點，該點在反應曲線上的位置為濁度開始快速變化的時期，該取值能夠快速、穩(wěn)定的獲得反應時間。2/1/202344博康1.3濁度反應時間取值法T50

濁度-時間曲線法每一管的濁度總是從0-1，這就是所謂“歸一法”，這種動態(tài)濁度法必須求出濁度達到0.5的時間t50，t50與拐點極為接近，用該點代替拐點。T50法很有優(yōu)勢，但要求每次鱟試驗必須達到反應終點，否則無法獲得終末透光強度，無法測得完整的濁度曲線，