第三章 透射電子顯微鏡

現(xiàn)代電子顯微分析技術(shù)傅茂森2015

第三章透射電子顯微鏡

2011年2月18日美國總統(tǒng)奧巴馬在訪問某公司透射電鏡實(shí)驗(yàn)室，在系統(tǒng)的顯示器上檢查圖片時(shí)，“我看到了一些原子，”他說，“請別碰我的原子?！辈牧戏治鲅芯恐行腇EITECNAI-F302.1透射電子顯微鏡發(fā)展簡史

1897年J.J.Thompson發(fā)現(xiàn)了電子。1924年L.De

Broglie發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)電子具有波粒二象性。

1926年Busch發(fā)現(xiàn)在軸對稱的電磁場中運(yùn)動(dòng)的電子有會(huì)聚現(xiàn)象。1931年，在德國柏林第一臺(tái)電鏡誕生（MaxKnollandErnstRuska）。1934年電鏡的分辨率可達(dá)50nm。1939年德國西門子公司第一臺(tái)電鏡投放市場，分辨率優(yōu)于10nm。（Ruska,vonBorries）1940電子光學(xué)和電子透鏡的基本理論研究(W.Glaser,O.Scherzer)1951X射線譜(R.Castaing)1956第一張晶格像產(chǎn)生(J.Menter)1957多層法的提出(J.Cowley,A.Moodie)1970分辨率小于4?的高分辨電子顯微鏡誕生。1986E.Ruska獲得了諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)(togetherwithG.BinningandH.Rohrer,whodevelopedtheScanningTunnelingMicroscope)LouisdeBroglie1892-1987ErnstRuska1906-1988

電子顯微鏡之父

E.Ruska,1986年諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)第一張電子圖像(1931年)德國學(xué)者Knoll和Ruska首次獲得放大12倍銅網(wǎng)的電子圖像,證明可用電子束和磁透鏡進(jìn)行成像。近代TEM發(fā)展史上三個(gè)重要階段像衍理論(50－60年代)：英國牛津大學(xué)材料系P.B.Hirsch,M.J.Whelan；英國劍橋大學(xué)物理系A(chǔ).Howie（建立了直接觀察薄晶體缺陷和結(jié)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)及電子衍射襯度理論）高分辨像理論(70年代初)：美國阿利桑那州立大學(xué)物理系J.M.Cowley，70年代發(fā)展了高分辨電子顯微像的理論與技術(shù)。高空間分辨分析電子顯微學(xué)(70年代末，80年代初)

采用高分辨分析電子顯微鏡（HREM，NED，EELS,EDS）對很小范圍（～5?）的區(qū)域進(jìn)行電子顯微研究(像，晶體結(jié)構(gòu)，電子結(jié)構(gòu)，化學(xué)成分)IBMandNion200KV超高真空，最高分辨率保持者0.075nm日本，日本電子JEOL200KV日本日立Hitachi200KV德國蔡司Zeiss200KV球差矯正+能量過濾系統(tǒng)日本，日本電子JEOL1250KV美國FEITitan200KV球差矯正+能量過濾系統(tǒng)2.1959年9月長春光機(jī)所自行設(shè)計(jì)研制成功我國第一臺(tái)大型電子顯微鏡，分辨本領(lǐng)優(yōu)于2.5nm，放大倍數(shù)10萬倍。在天安門前舉行國慶十周年中科院游行隊(duì)伍前就是這臺(tái)電子顯微鏡的巨大模型。此成果作為我國四十年重大科學(xué)技術(shù)成果，并列入了記載古今中外自然科學(xué)大事的《自然科學(xué)大事年表》。中國電子顯微鏡的發(fā)展史1.1958年8月中科院長春光學(xué)精密機(jī)械研究所研制成我國第一臺(tái)電子顯微鏡，50KV，分辨率為10nm。1958年國慶節(jié)前夕在北京中關(guān)村中國科學(xué)院舉辦的展覽會(huì)上展出。毛主席參觀了展覽會(huì)。4.上海精密醫(yī)療器械廠，在長春光學(xué)精密機(jī)械研究所第一臺(tái)大型電子顯微鏡的基礎(chǔ)上經(jīng)歷了DXA1-10(100kV，5nm)，DXA2-8(80kV，2nm)，至1965年7月制成DXA3-8型一級電子顯微鏡，分辨本領(lǐng)提高到0.7nm，放大倍數(shù)為20萬倍。通過了國家鑒定。

3.1959年南京教學(xué)儀器廠(1965年改為江南光學(xué)儀器廠，1993年起為江南光電(集團(tuán))股份有限公司，電鏡部分成立江南電子光學(xué)儀器研究所)研制成中型電鏡樣機(jī)，在國慶十周年第一屆全國工業(yè)交通展覽會(huì)上展出。1962年生產(chǎn)了第一批XD-301電子顯微鏡，分辨本領(lǐng)為10nm，加速電壓為50kV。5.1960年云南大學(xué)物理系制成YDX-1型透射電鏡，分辨本領(lǐng)(30kV，8nm)。6.1964年南京教學(xué)儀器廠制成XD-302型電鏡，分辨本領(lǐng)4nm，批量生產(chǎn)至1967年。7.1965年底中國科學(xué)院北京科學(xué)儀器廠研制成功DX-2型電鏡，分辨本領(lǐng)0.4/0.5nm。電子光學(xué)放大可達(dá)25萬倍以上。生產(chǎn)了8臺(tái)。8.1965年云南大學(xué)物理系完成

YDX-3電鏡（30kV，3nm）。9.1967年江南光學(xué)儀器廠制成DX-201電鏡，分辨本領(lǐng)為2nm，放大倍數(shù)2,000～50,000X，加速電壓為50、80kV。批量生產(chǎn)到1984年。10.1970年上海電子光學(xué)技術(shù)研究所設(shè)計(jì)制造DXB1-12型40萬倍透射電鏡，點(diǎn)分辨本領(lǐng)達(dá)0.5nm。11.1975年云南大學(xué)物理系完成YDX-4透射電鏡，采用長壽命陰極Y2O3-Ir等。分辨本領(lǐng)為1.5nm，加速電壓50kV。獲1978年全國科學(xué)大會(huì)獎(jiǎng)。12.1976年江南光學(xué)儀器廠制成DXT-10電鏡，分辨本領(lǐng)1nm，放大倍數(shù)最高10萬倍，加速電壓40、60、80、100kV。儀器性能已達(dá)到同類電鏡的先進(jìn)水平，投入批量生產(chǎn)。獲1978年全國科學(xué)大會(huì)獎(jiǎng)。1984年研制成功DXT-10C透射電鏡測角臺(tái)，具有±60°的大角度傾斜功能和四個(gè)運(yùn)動(dòng)自由度。13.1977年上海電子光學(xué)技術(shù)研究所完成多功能DXB2-12型80萬倍透射電鏡，分辨本領(lǐng)保證0.2nm，可達(dá)0.14nm(晶格)。配有側(cè)插式大角度旋轉(zhuǎn)傾斜臺(tái)，X射線能譜裝置EDS，可對試樣進(jìn)行微區(qū)成分分析。獲1978年全國科學(xué)大會(huì)獎(jiǎng)并列為我國四十年重大科學(xué)技術(shù)成果。進(jìn)行了小批量生產(chǎn)。14.

1980年中國科學(xué)院科學(xué)儀器廠完成DX-4型透射電子顯微鏡。分辨本領(lǐng)為3.4nm，達(dá)到0.204nm(晶格)，最高放大倍數(shù)為80萬倍，最高加速電壓為100kV。獲1982年中國科學(xué)院重大科技成果一等獎(jiǎng)。1984年研制成透射電鏡的計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)。15.

1986年上海電子光學(xué)技術(shù)研究所完成永磁式透射電鏡DXT-75(75kV，0.7nm)。16.

1987年上海電子光學(xué)技術(shù)研究所完成DXT-5教學(xué)用透射電鏡

(50kV，5nm);17.1987年上海電子光學(xué)技術(shù)研究所組裝完成日本JEOL公司的200CX等透射電鏡。18.1989年江南光學(xué)儀器廠引進(jìn)日本日立公司技術(shù)生產(chǎn)H-600A分析電鏡。分辨本領(lǐng)TEM時(shí)達(dá)0.2nm，SEM時(shí)達(dá)3nm。已生產(chǎn)12臺(tái)。19.1989年上海電子光學(xué)技術(shù)研究所研制成功加速電壓為200kV的DXT-200型電子顯微鏡，分辨本領(lǐng)(晶格)0.2nm，最高放大倍數(shù)為50萬倍。側(cè)插入傾斜臺(tái)

(±25°)。1990年獲機(jī)械電子工業(yè)部科技成果二等獎(jiǎng)。列為我國四十年重大成果。20.

1991年上海電子光學(xué)技術(shù)研究所制成DXT-100A普及型透射電鏡

(100kV，0.45nm)，獲1995年上?？萍疾┯[會(huì)金獎(jiǎng)。21.

1992年上海電子光學(xué)技術(shù)研究所完成DXT-50A教學(xué)用透射電鏡

(50kV，2nm)。22.

1993年江南光學(xué)儀器廠完成DXT-100G普及型透射電鏡

(100kV，1nm)，具有適應(yīng)性、方便性好和價(jià)格低等特點(diǎn)。獲南京市科技進(jìn)步獎(jiǎng)二等獎(jiǎng)。23.1993年江南光學(xué)儀器廠完成日本H-600A電鏡國產(chǎn)化。分辨本領(lǐng)TEM時(shí)達(dá)0.2nm，SEM時(shí)達(dá)3nm。投入生產(chǎn)。獲南京市科技進(jìn)步一等獎(jiǎng)。24.1996年，我國有各種電子顯微分析儀器約2021臺(tái)(包括在用和不用的)，其中TEM約756臺(tái)(國產(chǎn)316臺(tái)，占41.7%)，SEM約1165臺(tái)(國產(chǎn)690臺(tái)，占59.2%)1958我國第一臺(tái)透射電子顯微鏡1977DXB2-12型透射電子顯微鏡王大珩（1915年-2011年），中國工程院院士，光學(xué)專家，我國光學(xué)奠基人、開拓者和組織領(lǐng)導(dǎo)者，國家科技進(jìn)步特等獎(jiǎng)獲獎(jiǎng)?wù)?，中國工程技術(shù)界泰斗級人物，兩彈一星功勛獎(jiǎng)?wù)芦@獎(jiǎng)?wù)摺Ｒ︱E恩(1932-),中國工程院院士,我國掃描隧道顯微鏡(STM)研制和生產(chǎn)的主要開創(chuàng)者，也是我國電子顯微鏡研制和發(fā)展的主要負(fù)責(zé)人之一。Now…2.2TEM的結(jié)構(gòu)與成象原理TEM的結(jié)構(gòu)主要由三大部分組成：電子光學(xué)部分；真空部分；電氣部分。透射電子顯微鏡和光學(xué)顯微鏡的光路系統(tǒng)，從成像原理來看，兩者是相同的。就電子光學(xué)部分而言，也可分為三個(gè)主要部分組成，分別是照明系統(tǒng)、成像系統(tǒng)和觀察記錄系統(tǒng)。照明系統(tǒng)

成像系統(tǒng)

真空系統(tǒng)

觀察記錄系統(tǒng)

電源系統(tǒng)

2.2.1照明系統(tǒng)場發(fā)射電子槍早期材料為單晶鎢，現(xiàn)多采用LaB6，下一

代場發(fā)射電子槍的材料極有可能是碳納米管。能發(fā)射電子，并使其加速的靜電裝置，提供電子源電子槍可分為熱陰極電子槍和場發(fā)射電子槍。場發(fā)射電子槍又可以分為熱場發(fā)射、冷場發(fā)射。熱陰極電子槍的材料主要有鎢絲(W)和六硼化鑭(LaB6)。一、電子槍加速電場的極間電壓稱為加速電壓，是電鏡的重要性能指標(biāo)熱電子發(fā)射(ThermionicEmission)當(dāng)材料被加熱到足夠高的溫度時(shí)，其中的電子會(huì)獲得足夠的能量，從而大量電子克服逸出功而溢出表面。WfilamentLaB6crystal熔點(diǎn)高且逸出功小的材料做陰極：WandLaB6。熱電子槍(Thermionicgun)陰極：發(fā)射電子?xùn)艠O：電子束形狀和發(fā)射強(qiáng)度陽極：加速電子自偏壓：穩(wěn)定電子束電流，減小

電壓波動(dòng)有效光源：電子槍最小交叉截面，

直徑為d0，約幾十微米發(fā)散角：，電子束與主軸夾角自偏壓與燈絲電流與電子槍亮度關(guān)系場發(fā)射(FieldEmission)金屬表面強(qiáng)電場勢壘變淺隧道效應(yīng)內(nèi)部電子溢出尖端的電場強(qiáng)度顯著增加鎢絲是能產(chǎn)生尖端的材料之一表面無污染和氧化，需超高真空，<10-11Torr亮度比熱電子發(fā)射槍高約100倍，光源尺寸小AnFEGtip(fineWneedle)場發(fā)射電子槍(FieldEmissionGun，F(xiàn)EG)一個(gè)陰極，兩個(gè)陽極靜電透鏡，形成了細(xì)小的交

叉點(diǎn)第一陽極主要使電子發(fā)射無柵極第二陽極使電子加速和會(huì)聚熱陰極場發(fā)射電子槍ZrO/W（100）或W（100）面作為發(fā)射極低于加熱電子發(fā)射的溫度，1600~1800K能量發(fā)散僅為0.6~0.8eV無離子吸附，發(fā)射噪聲降低不需閃光處理，可得穩(wěn)定的發(fā)射電流肖特基效應(yīng)冷陰極場發(fā)射電子槍鎢的（310）面作為發(fā)射極不加熱，室溫使用能量發(fā)散僅為0.3~0.5eV，分辨率有望很好殘留氣體的離子吸附，發(fā)射噪聲離子吸附，電流降低，需閃光處理各種電子槍在200kV的特性比較性能特性熱電子發(fā)射場發(fā)射WLaB6熱陰極FEG冷陰極FEGW（310）ZrO/W（100）W（100）亮度/A·cm-2·sr-1約5×105約5×106約5×108約5×108約5×108光源尺寸50μm10μm0.1~1μm10~100nm10~100nm能量發(fā)散度/eV2.31.50.6~0.80.6~0.80.3~0.5使用條件真空度/Pa10-310-510-710-710-8溫度/K2800180018001600300發(fā)射電流/μA約100約20約10020~10020~100短時(shí)間穩(wěn)定度1%1%1%7%5%長時(shí)間穩(wěn)定度1%/1h3%/1h1%/1h6%/1h5%/15min使用壽命（h）20020020002000相干性差適中良優(yōu)秀維修無需無需安裝稍費(fèi)時(shí)間更換時(shí)裝幾次閃光處理價(jià)格/操作性便宜/簡單便宜/簡單貴/容易貴/容易貴/復(fù)雜理想的電子光源高亮度(高的電流密度)較好的相干性(較小的能量發(fā)散)色差小更好的為現(xiàn)代TEM工作良好的穩(wěn)定性壽命長高壓發(fā)生器和加速管產(chǎn)生高壓的裝置叫高壓發(fā)生器利用高電壓加速電子的部分叫加速管放置高壓發(fā)生器的容器叫高壓缸高壓發(fā)生器與透射電鏡主體之間

用高壓電纜連接輸出電壓的變化，將引起色差第一聚光鏡：強(qiáng)激磁透鏡，縮小率為10～50倍左右，將電子槍第一交叉點(diǎn)像縮小為1～5μm第二聚光鏡：弱聚光鏡，適焦時(shí)放大倍數(shù)為2倍，可獲得2～10μm的照明電子束。二、聚光鏡進(jìn)一步使電子束會(huì)聚，提高電子束流的密度，調(diào)節(jié)束流的強(qiáng)度、孔徑角和束斑直徑。雙聚光鏡：可較大范圍調(diào)節(jié)電子束斑大小、強(qiáng)度，以限制樣品上被照射的面積。

放大倍數(shù)愈大，要求照射區(qū)域愈小。CL1保持一般不變，將電子束斑縮小近一個(gè)數(shù)量級；

通過調(diào)整CL2激磁電流和光闌孔徑來實(shí)現(xiàn)。可減少電子束發(fā)散度，獲得小孔徑角、相干性好、盡可能平行的電子束，以獲得高質(zhì)量電子衍射花樣。

雙聚光鏡優(yōu)點(diǎn)通過CL1

、CL2可獲得束斑為幾個(gè)nm、近似平行電子束。聚光鏡光闌：調(diào)節(jié)通過聚光鏡電子束強(qiáng)度，改變會(huì)聚角2.2.2成像系統(tǒng)透鏡的數(shù)目由TEM所需的電子光學(xué)放大倍數(shù)決定，也取決于TEM的分辨率。照明系統(tǒng)成像系統(tǒng)觀察記錄系統(tǒng)包括物鏡、中間鏡、投影鏡、物鏡光闌以及選區(qū)衍射光闌物鏡最重要，決定分辨率將來自樣品的、反映樣品內(nèi)部特征的、強(qiáng)度不同的透射電子聚焦放大成像，并投影到熒光屏或照相底片上，轉(zhuǎn)變?yōu)榭梢姽鈭D像或電子衍射花樣。阿貝（Abbe，1840－1905）研究如何提高顯微鏡的分辨本領(lǐng)問題—1873年對相干光照明的物體提出了兩步衍射成像原理。

阿貝成像原理通過衍射屏的光發(fā)生夫瑯禾費(fèi)衍射，在透鏡后焦平面上得到傅里葉頻譜(S+1,S0,S-1)1第一步是信息分解

第二步是信息合成頻譜圖上各發(fā)光點(diǎn)發(fā)出的球面波在象平面上相干疊加而形成象A’，B’，C’。2阿貝成象原理ABCC’OFI’LS+1S0S-1B’A’12虛物一、物鏡強(qiáng)激磁透鏡短焦距（f＝1.5～3mm）單級放大100～300倍物鏡的分辨率主要取決于極靴的形狀和加工精度。高分辨電鏡的可傾轉(zhuǎn)角度較?。簶O靴內(nèi)孔和上下極靴距離小一次放大像及衍射譜，要求高分辨率分為上物鏡和下物鏡，試樣在上下物鏡間，上物鏡強(qiáng)聚光，下物鏡成象放大。二、物鏡光闌減小物鏡的球差和提高像的襯度在物鏡的后焦面上，最小可5μm進(jìn)行暗場及衍襯成像操作置于后焦面，減小色差和球差，在提高襯度的同時(shí)，

還可獲得更多的信息提高像襯度減小球差，調(diào)整景深與焦長明暗場成像當(dāng)M>1時(shí)，放大物鏡像；當(dāng)M<1時(shí)，縮小物鏡像

三、中間鏡弱激磁透鏡，長焦距變倍透鏡，可在0～20倍調(diào)節(jié)中間鏡可用來調(diào)整電鏡的總的放大倍數(shù)?？梢园惭b多個(gè)中間鏡。成像操作：中間鏡物平面和物鏡像平面重合，熒光屏上得放大像衍射操作：中間鏡物平面和物鏡背焦面重臺(tái)，熒光屏上得電子衍射花樣物鏡像平面上有一選區(qū)光闌，通過它可以進(jìn)行選區(qū)電子衍射操作。四、投影鏡把經(jīng)中間鏡放大的像(或衍射花樣)進(jìn)一步放大，投影到熒光屏短焦距，強(qiáng)磁透鏡景深和焦長都非常大即使電鏡總放大倍數(shù)有很大變化，不會(huì)影響圖像清晰度采用5級透鏡放大，即中間鏡和投影鏡各兩級。2.2.3觀察記錄系統(tǒng)熒光屏：觀察、記錄照相底片：記錄慢掃描CCD相機(jī)：觀察、記錄視頻攝像機(jī)：觀察、記錄2.2.4真空系統(tǒng)機(jī)械泵，油擴(kuò)散泵，分子泵，離子泵電子與氣體分子碰撞，降低襯度，污染樣品。產(chǎn)生氣體電離和放電現(xiàn)象電子槍燈絲被氧化而燒斷為什么需要真空？場發(fā)射槍部分，要求真空在10-9Pa旋片式機(jī)械泵使用真空：10-2Pa油擴(kuò)散泵使用真空：10-1~10-8Pa渦輪分子泵利用高速旋轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)子把動(dòng)量傳輸給氣體分子，使之獲得定向速度，從而被壓縮、被驅(qū)向排氣口后為前級抽走使用真空：10-2~10-8Pa吸氣劑離子泵吸氣劑離子泵是將被抽氣體分子電離，并在電磁場或電場的作用下將其輸送到泵的吸附表面而被吸氣劑捕集。蒸發(fā)離子泵濺射離子泵使用真空：10-2~10-9Pa離子泵原理TEM真空系統(tǒng)樣品臺(tái)的作用是承載樣品，并使樣品能在物鏡極靴孔內(nèi)平移、傾斜、旋轉(zhuǎn)，以選擇感興趣的樣品區(qū)或位向進(jìn)行觀察分析。樣品架必須使樣品牢固地夾持在樣品座中并保持良好的熱、電接觸，減少因電子照射引起的熱或電荷堆積而產(chǎn)生樣品的損傷或圖像漂移。2.2.5樣品臺(tái)與樣品桿樣品臺(tái)的要求：1.夾持牢固：使樣品銅網(wǎng)牢固夾持在樣品座中，并保持良好的熱、電接觸，減小因電子照射引起熱或電荷堆積而產(chǎn)生樣品損傷或圖像漂移。2.平移：在兩垂直方向平移最大值為±1mm，以確保樣品大部分區(qū)域都能觀察，且移動(dòng)機(jī)構(gòu)要有足夠精度。3.傾斜：分析薄晶樣品組織、結(jié)構(gòu)時(shí)，要進(jìn)行三維立體觀察，須使之對電子束照射方向作有目傾斜，以便從不同方位獲得各種形貌和晶體學(xué)衍射的信息。

側(cè)插式樣品傾斜裝置新式透射電鏡配備高精度樣品傾斜裝置。側(cè)插式樣品傾斜裝置：在晶體結(jié)構(gòu)分析中，最普遍使用?！皞?cè)插”：樣品桿從側(cè)面進(jìn)入物鏡極靴。側(cè)插式樣品傾斜裝置傾斜裝置結(jié)構(gòu)：由圓柱分度盤、樣品桿兩部分組成。側(cè)插式樣品臺(tái)旋轉(zhuǎn)樣品桿加熱樣品桿低溫樣品桿雙傾樣品桿單傾樣品桿多樣品樣品桿拉伸樣品桿綜合樣品系統(tǒng)入射電子束（強(qiáng)）

透射電子束（弱）

樣品太厚

(1)樣品厚度須合適樣品橫向尺寸一般不超過1mm，厚度須足夠薄，通常100-200nm為宜，高分辨晶格分析需達(dá)20-40nm。過厚的樣品將導(dǎo)致電子束無法穿透樣品。682.3TEM的樣品制備2.3.1TEM的樣品要求(2)避免含揮發(fā)性物質(zhì)樣品內(nèi)部必須充分去除揮發(fā)性物質(zhì)如溶劑，否則在高真空環(huán)境下由于快速揮發(fā)將導(dǎo)致樣品開裂，對圖像結(jié)果造成干擾。揮發(fā)性物質(zhì)69(3)具有足夠強(qiáng)度樣品須具備必要的抗電子損傷能力，由于電子束能量很強(qiáng)，軟質(zhì)樣品如有機(jī)物等易于造成局部區(qū)域損傷，導(dǎo)致微區(qū)結(jié)構(gòu)破壞。入射電子束（強(qiáng)）

70(4)樣品應(yīng)保持清潔避免含有污染成分，否則在高放大倍率下，微小的污染物也會(huì)對圖像結(jié)果造成嚴(yán)重干擾。入射電子束（強(qiáng)）

污染區(qū)域712.3.2透射電鏡樣品制備方法材料研究中TEM試樣大致有四種類型：經(jīng)懸浮分散的超細(xì)粉末顆粒。

用一定方法減薄的材料薄膜。

用復(fù)型方法將材料表面或斷口形貌復(fù)制下來的復(fù)型膜

聚焦離子束（FIB）2.3.2.1直接樣品的制備1.納米粉體樣品的制備步驟一、超聲波分散避免顆粒團(tuán)聚，造成厚度增加步驟二、將分散懸浮液滴于銅網(wǎng)或微姍網(wǎng)步驟三、烘干分散液烘烤時(shí)間約20分鐘塊狀材料是通過減薄的方法（需要先進(jìn)行機(jī)械或化學(xué)方法的預(yù)減?。┲苽涑蓪﹄娮邮该鞯谋∧悠贰p薄的方法有超薄切片、電解雙噴和離子減薄等。生物試樣金屬材料無機(jī)非金屬材料大多數(shù)為多相、多組分的的非導(dǎo)電材料，上述方法均不適用。60年代初產(chǎn)生了離子轟擊減薄裝置后，才使無機(jī)非金屬材料的薄膜制備成為可能。2．塊狀樣品的制備生物樣品超薄切片超薄切片：是指厚度小于100(50~70)納米的切片。要求：厚薄均勻、厚度符合標(biāo)準(zhǔn)；無皺褶刀痕、震顫和沉淀；細(xì)胞結(jié)構(gòu)保存良好，具有良好的電子反差；具有一定程度的機(jī)械強(qiáng)度。制作流程：六大步，40余次操作取材→固定→脫水→包埋→切片→染色→電鏡觀察超薄切片制作流程圖0~4℃室溫23237~60℃染色觀察聚合修塊切片撈片取材固定漂洗50%70%80%包埋90%95%100%過渡浸透一、取材從動(dòng)、植物機(jī)體上或細(xì)胞及微生物培養(yǎng)物中獲取所需要的研究材料的操作過程。1.取材的原則要求：準(zhǔn)、快、小、冷、輕五字原則。準(zhǔn)確：根據(jù)研究目的確定取材部位，取到典型部位。快速：材料離體后應(yīng)在1分鐘內(nèi)投入固定液。體積小：固定液滲透力所限，樣品體積為1mm3

或1×3mm長條。低溫：固定液及器材需預(yù)冷(0~4℃)，以降低自溶酶的活性。防損傷：器械要鋒利，切割輕巧，防擠壓、牽拉損傷組織細(xì)胞

的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。取材

↓固定↓脫水↓包埋↓切片↓染色↓鏡檢取材方法：

動(dòng)物材料的獲?。杭毙蕴幩阑蚵樽砗螅?～2分鐘解剖出所需材料，切成標(biāo)準(zhǔn)塊立即投入固定液，低溫(0～4℃)保存；特殊難取的材料必須原位固定或灌流固定，再取材投入固定液。

植物材料的獲取：注意部位和方向性。葉片切取1×3㎜長條；根、莖切取標(biāo)準(zhǔn)塊；表面有毛刺的材料先用酶處理使之軟化，表面有蠟質(zhì)的葉片先脫蠟，蒸餾水洗凈后再取材固定。懸浮樣品的獲?。杭尤脒m量固定液懸浮固定后，低速離心收集成團(tuán)塊再固定。需抽氣使樣品沉底保低溫

野外取材：攜帶冰壺保存固定液和材料，確保動(dòng)物材料的現(xiàn)場固定；植物材料可保濕帶回實(shí)驗(yàn)室再取材固定。取材

↓固定↓脫水↓包埋↓切片↓染色↓鏡檢二、固定用化學(xué)或物理的方法迅速殺死細(xì)胞的過程1.固定的目的：在分子水平上真實(shí)地保存組織細(xì)胞生活狀態(tài)的細(xì)節(jié)，盡量減少細(xì)胞的死后變化。2.固定的類型：固定物理固定法：化學(xué)固定法：3.固定液的作用：迅速均勻滲透到細(xì)胞內(nèi)部，穩(wěn)定各種細(xì)胞成分；破壞細(xì)胞的酶系統(tǒng)，阻止細(xì)胞的自溶；通過化學(xué)作用建立分子交聯(lián)，形成細(xì)胞骨架；提供一定的電子反差。超低溫快速冷凍固定法使用化學(xué)試劑快速殺死細(xì)胞取材↓固定↓脫水↓包埋↓切片↓染色↓鏡檢固定方法：(1)單固定法：用于易于滲透的材料和酶的細(xì)胞化學(xué)(2)雙固定法：戊二醛—鋨酸雙重固定(3)原位固定法：用于難解剖的、對缺氧敏感的組織器官，在保持血液供應(yīng)的狀態(tài)，邊解剖邊滴加固定液，待組織適度硬化后再取材作常規(guī)固定。(4)灌流固定：常用醛類固定：用于腦組織、植物葉片的氣孔狀態(tài)等通過血液循環(huán)的途徑，將固定液灌注到相應(yīng)部位，待組織適度硬化后再解剖取材，作常規(guī)固定。用于解剖關(guān)系復(fù)雜的組織（神經(jīng)組織、腦垂體）戊二醛取材↓固定↓脫水↓包埋↓切片↓染色↓鏡檢三、脫水脫水指用適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑，取代組織細(xì)胞中的游離水的過程。1.必要性：水分存在會(huì)影響非水溶性包埋劑的滲透，進(jìn)而影響切片的完整性2.常用脫水劑：醇類(乙醇)和丙酮3.脫水方法：梯度系列脫水法。30%→50%→70%→80%→90%→95%→100%2次4.注意事項(xiàng)：脫水中斷只能在70%，高濃度脫水劑易使組織變脆，成分抽提；末級脫水劑應(yīng)先用吸水劑處理，以保證脫水徹底；高濃度脫水操作要快，以防樣品內(nèi)進(jìn)入空氣或吸水受潮。取材↓固定

↓脫水↓包埋↓切片↓染色↓鏡檢四、浸透與包埋：用包埋劑逐步取代樣品中的脫水劑，使細(xì)胞內(nèi)外的所有孔隙都被包埋劑填充，聚合后形成適合機(jī)械切割的固體包埋塊。1.包埋劑：理想包埋劑的特點(diǎn)：粘稠度低，容易滲透；聚合均勻，不產(chǎn)生體積收縮；耐電子束轟擊，高溫不變形，不升華；本身無結(jié)構(gòu)，并具有良好的切割性能，切片易染色。常用包埋劑：非水溶性(Epon812)和水溶性包埋劑。包埋劑Epon812或618(環(huán)氧樹脂)固化劑DDSA（十二烷基琥珀酸酐）

MNA（六甲酸酐）增塑劑DBP（鄰苯二甲酸二丁脂）催化劑DMP-30(環(huán)氧樹脂促進(jìn)劑)調(diào)節(jié)塑性而改變切割性能用于618邊脫水邊包埋取材↓固定↓脫水↓包埋↓切片↓染色↓鏡檢2.浸透四.浸透與包埋脫水后經(jīng)環(huán)氧丙烷過渡,再逐漸浸入包埋劑。包埋劑:過渡劑比例為1:3→1:1→3:1→純包埋劑浸透時(shí)間：因材料而異

1:31:13:1單細(xì)胞0.50.5~10.5動(dòng)物材料11~41~2植物材料11~122~12比例時(shí)間材料3.包埋常規(guī)包埋：材料挑入模具，注入包埋劑，做好標(biāo)記；定向包埋：樣品挑入淺槽，擺好方向、注劑、裝標(biāo)簽；注意事項(xiàng)：樣品塊附近不能存在氣泡。4.聚合循序漸進(jìn)提高溫度，促進(jìn)聚合37℃(12h)→45℃(12h)→60℃(24h)取材↓固定↓脫水↓包埋↓切片↓染色↓鏡檢五、超薄切片制刀→修塊→切片→展片→撈片1.切片刀：鉆石刀、玻璃刀1～2mm25/38mm4~6.5mm制作玻璃刀：2.修塊：除去樣品周邊的包埋介質(zhì)和不感興趣部位，保留有用信息便于切割，提供盡可能大的有效觀察面。要點(diǎn)：上、下邊必須平行形狀：頂端面為梯形的錐體（金字塔形）取材↓固定↓脫水↓包埋↓切片↓染色↓鏡檢3.切片△=厚度～熱膨脹推進(jìn)式切片機(jī)示意圖裝刀、加水：特別注意刀高和傾角，液面高度；切片、撈片：切片帶用睫毛筆收集，銅網(wǎng)沾?。磺衅穸鹊呐袛啵呵衅砻娴姆瓷涔夂颓衅卤砻娣瓷涔猱a(chǎn)生的干涉顏色為依據(jù)，不同厚度切片呈現(xiàn)不同的顏色。干涉顏色暗灰色灰色銀白色金黃色紫色切片厚度40nm以下40~50nm50~70nm70~90nm90nm以上取材↓固定↓脫水↓包埋↓切片↓染色↓鏡檢六、染色1.染色原理：使用重金屬鹽類與樣品中的某些成分結(jié)合或被吸附，以增加電子散射量從而達(dá)到提高反差的目的。電子染色2.電子染色劑：具有特異性常用染色劑為鈾和鉛鹽醋酸鈾：能提高核酸、蛋白質(zhì)和結(jié)締組織的反差，對膜系統(tǒng)染色較差。配制：1~3%的50%或70%的乙醇溶液，避光保存。鉛鹽：對膜系統(tǒng)、糖元、核蛋白、脂類有較好的染色作用。常用硝酸鉛和檸檬酸鈉水溶液配成檸檬酸鉛。易產(chǎn)生沉淀污染樣品。配制：硝酸鉛1.33g

檸檬酸鈉1.76g

雙蒸餾水30mlpH11~12pH4.2用力振蕩30min，呈乳狀懸液，加入8ml1N的NaOH，溶液透明后加水至50ml取材↓固定↓脫水↓包埋↓切片↓染色↓鏡檢電解雙噴法1．冷卻設(shè)備；2．泵、電解蔽；3．噴嘴

4．試樣

5．樣品架；

6．光導(dǎo)纖維管研磨、切割以及沖片30~50μm離子減薄塊體脆性樣品步驟一、切割500μm超聲波切割步驟二、單面拋光步驟三、凹坑約10μm步驟四、離子減薄塊體塑性樣品離子減薄電解雙噴橫截面樣品微米級粉體樣品聚焦離子束(FIB)FIB制備透射樣品過程20KV離子束加工樣品高分辨TEM圖像5KV離子束加工樣品高分辨TEM圖像2KV離子束加工樣品高分辨TEM圖像2.3.2.2復(fù)型樣品的制備復(fù)型制樣方法是用對電子束透明的薄膜把材料表面或斷口的形貌復(fù)制下來復(fù)型一級復(fù)型二級復(fù)型萃取復(fù)型塑料一級復(fù)型碳一級復(fù)型塑料——碳二級復(fù)型1、一級復(fù)型一級復(fù)型是指在試樣表面的一次直接復(fù)型一級復(fù)型復(fù)型主要分為塑料（火棉膠）一級復(fù)型和碳膜一級復(fù)型塑料一級復(fù)型，是一種負(fù)復(fù)型，即復(fù)型與試樣表面的浮雕相反，其表面的形貌與樣品的形貌剛好互補(bǔ)，所以稱之為負(fù)復(fù)型。碳膜一級復(fù)型是一種正復(fù)型。塑料一級復(fù)型樣品上滴濃度為1%的火棉膠醋酸戍酯溶液或醋酸纖維素丙酮溶液，溶液在樣品表面展平，多余的用濾紙吸掉，溶劑蒸發(fā)后樣品表面留下一層100nm左右的塑料薄膜。分辨率低（10－20nm），電子束照射下易分解和破裂。碳一級復(fù)型樣品放入真空鍍膜裝置中，在垂直方向上向樣品表面蒸鍍一層厚度為數(shù)十納米的碳膜。把樣品放入配好的分離液中進(jìn)行電解或化學(xué)分離。分辨率高（2~5nm