維持蛋白質結構的作用力

維持蛋白質結構的相互作用力

一、共價相互作用：（二硫鍵）

二硫鍵在胞外蛋白和胞內蛋白中的功能 二硫橋作為蛋白質結構花樣的組成部分

蛋白質結構中原子間的相互作用可分為兩類：共價相互作用和非共價相互作用。二硫鍵(-S-S-)又稱作二硫橋或硫硫鍵：是指兩個硫原子之間形成的化學鍵其鍵能很大，大約為30~100Kcal/mol

，因此是一種很強的化學鍵。它可以把不同的肽鏈或同一肽鏈的不同部分連接起來對穩(wěn)定蛋白質的構象起著重要的作用。二硫鍵的形成：在細胞外大多數二硫鍵的形成是自發(fā)地，而在細胞內它需要細胞膜上的酶系統(tǒng)來將二硫鍵引入蛋白質。因為細胞是依靠很強的還原環(huán)境所維持的，例如5mM的還原谷胱甘肽和0.01mM的氧化谷胱甘肽，在這樣的條件下蛋白質中二硫鍵的形成就不是自發(fā)的了二硫鍵在胞外蛋白中的功能：在胞外蛋白中二硫鍵決定了胞外蛋白的機械性質例如：角蛋白蛇毒毒素蛋白和其它的毒素蛋白、多肽激素消化酶、免疫球蛋白、溶菌酶以及牛奶蛋白等，在這些蛋白質中二硫鍵的作用對于結構的穩(wěn)定SchematicmodelsofanantibodymoleculeandaFabfragment二硫鍵在胞內蛋白中的功能：二硫鍵決定了胞內蛋白的化學性質，新合成的蛋白很少具有二硫鍵，通常胞內蛋白中的二硫鍵只與功能相關而與結構穩(wěn)定無關。Thirodoxin（硫氧還蛋白）

systemSchemeofelectronflowinthethioredoxinsystem.ElectronsfromNADPHareusedtoreducethioredoxinreductase(TrxR)(aNADPH-dependentflavoprotein),whichinturnreducesthioredoxin(Trx).Reducedthioredoxinisabletoreducedisulfidebondsinawidearrayofproteinsubstrates.還原狀態(tài)氧化狀態(tài)Thioredoxin

in

yeastBaoetal.2007ThioredoxinreductaseinyeastZhangetal.2008ComplexofTrxandTrxrinE.coliLennonetal.,Science2000二、非共價相互作用

蛋白質的空間結構主要是由非共價相互作用所維系的。弱的相互作用力使得非共價鍵易于斷裂，使蛋白質分子具有柔性。主要非共價相互作用力:范得華相互作用,靜電相互作用,疏水相互作用,氫鍵和鹽鍵等類型鍵能(Kcal/mol)

色散力－C－H……H―C―

0.03靜電相互作用－COO……H3N－

5C=O……O=C0.3氫鍵C－H……O4N－H……O=

3疏水相互作用+

+

－

－

蛋白質結構中的非共價相互作用

1、范得華相互作用:原子間以及被化學鍵所飽和的分子間存在著弱的相互吸引力①靜電力（葛生力Keeson）；②誘導力(Debye力)；③色散力（London力）。

三種范得華相互作用中，色散力是占主要地位的相互作用力。

極性基團偶極矩之間的靜電力（葛生力Keeson）：極性分子的永久偶極之間存在靜電相互作用，作用力的大小和它們的相對取向及距離相關。誘導力(Debye力)：得拜提出除極性分子間有靜電相互作用外，非極性的對稱分子與具有永久偶極的極性分子相互作用，可使非極性分子中的電荷密度發(fā)生形變，產生誘導偶極矩。這種極性分子的永久偶極矩與非極性對稱分子誘導偶極矩之間的相互作用稱為誘導力。色散力London力:非極性分子中的原子和分子的原點振動引起的,動態(tài)極化可使在某一瞬間電子云的重心偏離核正電荷的中心使得非極性分子產生瞬間偶極矩,此瞬間偶極矩將在鄰近分子中誘導出偶極矩，這種瞬間偶極矩與誘導偶極矩的相互作用力稱作色散力范得華相互作用可用Lennard-Jones勢函數表達:當兩個原子或分子相距較遠時范得華引力較明顯，而當它們彼此接近達到一定距離時開始出現(xiàn)排斥若進一步接近則表現(xiàn)出很強的排斥力。色散力是占主要地位的相互作用力。原子共價鍵類型范得華半徑(?)氫1.00

雙鍵1.60碳芳香環(huán)1.70酰胺1.50氧1.35氮芳香環(huán)1.70硫酰胺1.45蛋白質分子中的原子范得華半徑

范得華力的距離常用范得華半徑來表示兩個原子間的范得華距離，近似地為兩原子間的接觸距離。2、靜電相互作用:因為分子中不同類型的原子形成共價鍵時成鍵電子的分布是不對稱的，因此分子中大多數的原子都帶有部分電荷，另外蛋白質分子中極性氨基酸的側鏈也帶有部分電荷。

蛋白質的靜電相互作用可分為蛋白質分子內部的靜電相互作用和蛋白質分子外部與周圍環(huán)境即溶劑的靜電相互作用。

計算靜電相互作用基本方程為Poisson方程：V2(r)=-4

(r),(r)：位置函數；(r)：電荷密度。

3、氫鍵:氫鍵是通過氫原子參與成鍵的特殊形式的化學鍵當一個電負性較強的原子與氫鍵合后，繼續(xù)與另一個電負性較強的原子鍵合：

X－－H＋......Y－氫鍵是穩(wěn)定蛋白質二級結構的主要因素。氫鍵的本質是X—H之間為極性的共價結合。電負性較強的X原子將氫原子的電子云拉向自己一方，使X—H變?yōu)榕紭O元，從而使X原子帶有部分負電荷，而氫原子則帶有部分正電荷。當帶有部分正電荷的H和具有孤電子對電負性較強的Y原子接近時它們之間存在著靜電引力，于是便形成了帶部分共價鍵性質的氫鍵。氫鍵的鍵能一般為-3~-6Kcal/mol，介于范得華力和共價鍵之間，這樣的能量表明氫鍵既有足夠的穩(wěn)定性，提供顯著的結合能，又可以迅速解離。氫鍵類型供體－受體的距離―O―HO2.8±0.1―O―HO＝C2.8±0.1N－HO＝C2.9±0.1N－HO－2.9±0.1N－HN3.1±0.2N－HS3.7蛋白質分子中的氫鍵

對氫鍵形成特別重要的氨基酸

酪氨酸、蘇氨酸和絲氨酸的側鏈還有羥基；谷氨酰胺和天冬酰胺的側鏈酰胺基團；有時，側鏈原子常常與被捕獲到的蛋白質內部的水分子形成氫鍵，而有時兩個供體或受體基團之間共享一個氫鍵（分叉氫鍵）。4、疏水相互作用：疏水相互作用是由于非極性基團的存在，引起了水分子的結構重排，形成了水和水之間的氫鍵網絡，使水的有序度增加而使熵降低。

維持蛋白質三級結構最主要的因素是疏水相互作用。非極性分子在水中傾向于聚集在一起以減少表面積，這也就是蛋白質分子中疏水內核形成的原因。疏水性的一個重要特點是它的可加和性，即一個大分子的疏水性可由組成它的基團的相對疏水性的加和得到。蛋白質分子疏水作用大小的衡量是將一個去折疊的蛋白質分子的側鏈從水中取出，然后放到一個折疊了的蛋白質分子內部，測量得到的自由能的變化，則表示疏水相互作用的大小。實驗上是測量一個自由氨基酸在水中和非極性溶劑中（常用乙醇和二亞烷）的相對溶解度。ΔG轉移

=

RTln[Snp/SH2O]ΔG轉移為自由氨基酸由水中轉移到非極性溶劑中的轉移自由能，Snp和SH2O

為在非極性溶劑和水中的溶解度。假定甘氨酸的ΔG轉移

=0，

將其它自由氨基酸的測量值相對甘氨酸進行標度，由此人們計算出了各種氨基酸的相對親水性和相對疏水性。氨基酸相對親水性(Kcal/mol)相對疏水性(Kcal/mol)氨基酸相對親水性(Kcal/mol)相對疏水性(Kcal/mol)甘氨酸(Gly)00色氨酸(Trp)8.283.4亮氨酸(Leu)0.111.8酪氨酸(Tyr)8.52.3異亮氨酸(Ile)0.24(2.5)谷胺酰胺(Gln)11.77-0.3頡氨酸(Val)0.401.5賴氨酸(Lys)11.91(-4.2)丙氨酸(Ala)0.450.5天冬酰胺(Asn)12.09-0.2苯丙氨酸(Phe)3.152.5谷氨酸(Glu)12.58-9.9半胱氨酸(Cys)3.63(-2.8)組氨酸(His)12.620.5甲硫氨酸(Met)3.871.3天冬氨酸(Asp)13.31(-7.4)蘇氨酸(Thr)7.270.4精氨酸(Arg)22.31(-11.2)絲氨酸(Ser)7.45-0.3脯氨酸(Pro)

(-3.3)氨基酸側鏈的相對疏水性和親水性

5、鹽鍵

當一個氨基酸的氨基和與它空間相鄰的另一個氨基酸的羧基互相靠近時，形成鹽鍵。-COO......H3N-?相鄰的氨基和羧基的結合能大約為5.0Kcal/mol左右三、蛋白質工程

蛋白質工程的目的之一是提高蛋白質的穩(wěn)定性。蛋白質的去折疊和折疊態(tài)之間的自由能變化之差來衡量：

ΔG＝GD－GN

蛋白質分子的天然構象不一定是自由能最低，最穩(wěn)定的構象。研究發(fā)現(xiàn)幾乎所有的天然蛋白質分子的穩(wěn)定性都介于ΔG5-15Kcal/mol之間，這一性質可能和其生物學功能相關。同時這一性質也使人們有可能通過蛋白質工程的方法來提高蛋白質分子的穩(wěn)定性。

在蛋白質工程研究中，人們擬從下面幾個方面對蛋白質分子進行改造，以圖提高蛋白質分子的穩(wěn)定性：

1、疏水相互作用

2、靜電相互作用

3、氫鍵

4、二硫鍵

疏水相互作用被認為是蛋白質折疊的主要驅動力，蛋白質分子中的疏水基團暴露于溶劑中往往會引起不利于蛋白質折疊的自由能變化，將氨基酸從水中轉移到有機溶劑中的轉移自由能的大小可用來衡量疏水相互作用的大小。Methews等人對T4溶菌酶中的Ile做了11種的不同氨基酸殘基的替換，研究發(fā)現(xiàn)該蛋白質的穩(wěn)定性和轉移自由能之間存在著直接的比例關系，通過計算蛋白質折疊過程中溶劑可接觸表面積的變化來評估疏水相互作用對蛋白質穩(wěn)定性的影響。1疏水相互作用2靜電相互作用蛋白質分子的靜電相互作用包括帶電基團以及原子上的部分電荷之間的相互作用。定點突變的實驗結果表明靜電相互作用對穩(wěn)定性的影響依賴于帶電基團的位置，例如在a螺旋的N端附近引入酸性氨基酸或在C端附近引入堿性氨基酸均可以提高蛋白質分子的穩(wěn)定性。靜電相互作用與溶液的pH值相關并受溶液中其它的離子的影響。3氫鍵氫鍵對蛋白質空間結構的穩(wěn)定性極為重要，特別是對二級結構的形成起著關鍵的作用。Bryan等人用隨機突變的方法誘變枯草桿菌蛋白酶BPN的基因篩選到的一個耐熱突變型蛋白酶序列,測定表明是其218位的一個Asn變成了Ser。該突變酶的1.8A分辨率的空間結構測定表明Asn218變?yōu)镾er218后使得蛋白質結構中的一條β鏈中的另外兩對氫鍵的幾何構型得到改善，因此分子內的氫鍵的增加使得蛋白質結構更加穩(wěn)定，從而提高了枯草桿菌蛋白酶的熱穩(wěn)定性。4二硫鍵引入二硫鍵可以減少蛋白質去折疊的構型熵，因此可以提高蛋白質分子的穩(wěn)定性。但是引入二硫鍵的前提是二硫鍵的引入不能同時增加結構張力。在蛋白質分子中引入二硫鍵來提高蛋白質熱穩(wěn)定性的成功實驗首先來自于對T4溶菌酶和l阻遏蛋白的蛋白質工程研究人們將T4溶菌酶的Ile3換成Cys3使之能與第97位的Cys形成二硫鍵NAD：煙酰胺腺嘌呤二核苷酸Astereoviewshowingtheextensivehydrogenbonds(dashedlines)madebyNAD+withLeu179,Ser198,Glu199,Arg204,Leu266,Leu268andIle291(residuesshowninpink).ManyvanderWaalcontactsaremadewithothersurroundingresidues.Thewatermoleculethatisconservedindi-nucleotidebindingproteinscontainingtheRossmannfoldisalsoshown.InTkTDH,thiswaterformsfourhydrogen