紅花高效液相色譜指紋圖譜研究

實(shí)例一紅花高效液相色譜指紋圖譜研究紅花為菊科紅花的花，活血化瘀中藥，有效成分為查耳酮類和黃酮類成分，其中羥基紅花黃色素Ａ為主要有效成分之一。主產(chǎn)地新疆。紅花藥材指紋圖譜研究主要針對(duì)查耳酮類和黃酮類成分，以新疆主產(chǎn)區(qū)藥材為主要研究對(duì)象。

1.實(shí)驗(yàn)材料

樣品紅花采自新疆、內(nèi)蒙古、陜西、河南、安徽等地，共31份樣品，均經(jīng)品種鑒定。對(duì)照品羥基紅花黃色素Ａ，實(shí)驗(yàn)室自制。試劑乙腈（美國(guó)Tedia公司，色譜純）、重蒸去離子水（實(shí)驗(yàn)室制備）、磷酸（分析純）

2.溶液制備供試品制備取樣品粉末(過4號(hào)篩)2.0ｇ,精密稱定,置具塞三角瓶中,加水50ｍL,稱重,90℃水浴中提取1ｈ,稱重,補(bǔ)足減失重量,濾過,精密量取續(xù)濾液10ｍL,微孔濾膜濾過,作供試品。參照物制備精密稱取羥基紅花黃色素Ａ對(duì)照品適量,加水制成0.2ｇ/L的溶液，作參照物。3.色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)Waters600型高效液相色譜儀,2996二極管陣列檢測(cè)器,WatersMillenium色譜工作站；色譜柱為PhenomenexLuna(250mm4.6mmID,5μm)；乙腈-0.5%磷酸為流動(dòng)相梯度洗脫，運(yùn)行時(shí)間65min；柱溫25℃；流速1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)275nm。進(jìn)樣量：供試品及參照物各20μl。4.測(cè)試方法取待測(cè)溶液適量,注入液相色譜儀，按選定的測(cè)試條件，測(cè)定色譜圖。并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)方法學(xué)考察。流動(dòng)相選擇經(jīng)實(shí)驗(yàn)比較，乙腈-0.5%磷酸溶液梯度洗脫，能較好地使樣品中各色譜峰分離且出峰最多；分析時(shí)間65min，樣品1.5h圖譜顯示，65min后無特征峰出現(xiàn)。A：乙腈，B：0.5%磷酸溶液0—55minA（％）0—25B（％）100—7555—65minA（％）25—0B（％）75—100方法學(xué)考察穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一批次供試品，在室溫下放置，每隔一定時(shí)間進(jìn)樣后，測(cè)定，用“中藥指紋圖譜相似度計(jì)算軟件”計(jì)算，結(jié)果相似度均大于0.95，表明供試品在測(cè)定的24h內(nèi)保持穩(wěn)定。

精密度試驗(yàn)：取同一批次供試品，連續(xù)進(jìn)樣5次，考查進(jìn)樣精密度，用“中藥指紋圖譜相似度計(jì)算軟件”計(jì)算，結(jié)果相似度均大于0.95，表明供試品進(jìn)樣精密度良好。

重現(xiàn)性試驗(yàn)：取同一批次樣品，按上法分別制備5份供試品，測(cè)定，用“中藥指紋圖譜相似度計(jì)算軟件”計(jì)算，結(jié)果相似度均大于0.95，表明本法測(cè)定的重現(xiàn)性良好。供試品測(cè)定同一上述實(shí)驗(yàn)條件下，測(cè)定10批次供試品HPLC色譜圖。

5.指紋圖譜的分析與評(píng)價(jià)根據(jù)31批次供試品測(cè)定結(jié)果所給出的峰數(shù)、峰值（積分值）和峰位（相對(duì)保留時(shí)間）等相關(guān)參數(shù)，進(jìn)行分析、比較，制定優(yōu)化的指紋圖譜。紅花高效液相色譜可分離出約50多個(gè)色譜峰，經(jīng)與參照物對(duì)照以及比較所有測(cè)定和記錄的色譜圖，選取其中36個(gè)共有峰作為指紋圖譜的特征峰。

共有指紋峰標(biāo)定根據(jù)10批次供試品測(cè)定結(jié)果，標(biāo)定共有指紋峰。紅花HPLC指紋圖譜中，共有指紋峰36個(gè)。與羥基紅花黃色素Ａ參照物峰（22號(hào)峰）相比，其它35個(gè)共有指紋峰相對(duì)保留時(shí)間依次為：0.11、0.17、0.20……1.84、2.03。羥基紅花黃色素Ａ

共有指紋峰面積比除參照物峰以外，無共有指紋峰面積（峰）超過總峰面積的10%。

相似度評(píng)價(jià)各地商品紅花的指紋圖譜,采用“計(jì)算機(jī)輔助相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,結(jié)果樣品a～n的相似度分別為0.96,0.78,0.88，……0.93。新疆動(dòng)新疆主產(chǎn)地,不同紅花藥材的指紋圖譜相似度較高（均>0.90)。尤其是吉木薩爾縣紅旗農(nóng)場(chǎng)——紅花栽培基地的紅花指紋圖譜相似度更高（多>0.95)。

指紋圖譜中,保留時(shí)間在15～65min的12～36號(hào)色譜峰峰形及相對(duì)比例較穩(wěn)定,體現(xiàn)了紅花的共同特征；而保留時(shí)間在0～15min的1～11號(hào)色譜峰則變化較多,是不同藥材的差異所在。商品紅花指紋圖譜的主要差異集中在4,5和6號(hào)峰的峰形及其相對(duì)高度上。新疆主產(chǎn)地紅花指紋圖譜,主要差異集中在2,3,4,5,6,8和9號(hào)峰的峰形及其相對(duì)高度上。實(shí)例二西青果高效液相色譜指紋圖譜研究西青果為使君子科訶子或絨毛訶子的幼果。訶子含鞣質(zhì)類、三萜類、酚酸類等成分。其中沒食子酸、訶黎勒酸、訶子酸等鞣質(zhì)為主要化學(xué)成分，含量高達(dá)23～37%。西青果傳統(tǒng)來源主要從印度及斯里蘭卡進(jìn)口。1.實(shí)驗(yàn)材料

樣品共42個(gè)樣品，均為各地市場(chǎng)商品（包括進(jìn)口樣品），絕大多數(shù)為進(jìn)口藥材收載的訶子TerminaliachebulaRetz.的幼果。對(duì)照品沒食子酸、訶黎勒酸、訶子酸由中國(guó)藥品生物制品檢驗(yàn)所提供，供含量測(cè)定用。試劑醋酸乙酯、甲醇、丙酮、甲醇、磷酸、磷酸二氫鉀（均為分析純）,重蒸去離子水（實(shí)驗(yàn)室制備）。儀器Agilent1100液相色譜儀，DAD檢測(cè)器。

2.溶液制備供試品制備取樣品粉末（3號(hào)篩）各0.05g，用丙酮熱回流2次（50ml/30min），過濾，濾液蒸干，殘?jiān)盟龀?0ml，冰箱放置約1h，取出，通過孔徑0.45μm的微孔濾膜,濾液作為供試品。參照物制備取沒食子酸、訶黎勒酸、訶子酸對(duì)照品,用30%甲醇分別做成50mg/ml的溶液,通過孔徑0.45μm的微孔濾膜,濾液作為參照物。

3.色譜條件色譜柱LiChrospher分析柱RP-18（4×125mm；5mm）；預(yù)柱：PhenomenexC18。流動(dòng)相三元梯度洗脫：A.0.05M的磷酸液與0.05M的磷酸二氫鉀液（1:1）；B.甲醇；C.醋酸乙酯。0~5minA（％）94~96B（％）6~3C（％）0~15~15minA（％）96~93B（％）3~2C（％）1~515~20minA（％）93~89B（％）2~6C（％）5~520~35minA（％）89~55B（％）6~40C（％）5~5流速1.0ml/min；柱溫20℃；檢測(cè)波長(zhǎng)280nm；分析時(shí)間40min；進(jìn)樣量供試品及參照物各20μl。4.測(cè)定法取參照物及供試品溶液各20μl,注入液相色譜儀，按選定的測(cè)試條件，測(cè)定并記錄色譜圖。

5.方法學(xué)考察(1)穩(wěn)定性試驗(yàn)：取供試品溶液，室溫下放置，分別在0、1h、2h、3h、4h、5h、24h、48h不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)計(jì)算機(jī)輔助相似度評(píng)價(jià)軟件計(jì)算，結(jié)果相似度為0.9823～0.9993，表明樣品在測(cè)定的48h內(nèi)穩(wěn)定。(2)精密度試驗(yàn)：取供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，各色譜峰保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD均低于3%。（3）重現(xiàn)性試驗(yàn)：取同一批次樣品，依法制得5份供試品液，平行測(cè)定，各色譜峰保留時(shí)間的RSD均低于3%。經(jīng)相似度評(píng)價(jià)其相關(guān)系數(shù)大于0.9929，表明本法測(cè)定的重現(xiàn)性良好。6.指紋圖譜建立根據(jù)10批次供試品測(cè)定結(jié)果所給出的峰數(shù)、峰值（A）和峰位（tR）等相關(guān)參數(shù)，進(jìn)行分析、比較，制定優(yōu)化的指紋圖譜。圖3-42西青果HPLC指紋圖譜123456789101112131415沒食子酸t(yī)R=5.6′訶黎勒酸t(yī)R=29.3′訶子酸t(yī)R=33′

7.西青果指紋圖譜分析與評(píng)價(jià)西青果高效液相色譜可分離出約20多個(gè)色譜峰，經(jīng)與參照物對(duì)照以及比較所有測(cè)定和記錄的色譜圖，選取其中15個(gè)共有峰作為指紋圖譜的特征峰。共有指紋峰標(biāo)定根據(jù)10批次供試品測(cè)定結(jié)果，標(biāo)定共有指紋峰15個(gè)。與訶黎勒酸參照物峰（13號(hào)峰）相比，其它14個(gè)共有指紋峰相對(duì)保留時(shí)間依次為：0.080、0.131、0.189、0.237、0.344、0.475、0.595、0.674、0.760、0.779、0.808、0.947、1.028、1.122。圖3-42西青果HPLC指紋圖譜123456789101112131415沒食子酸t(yī)R=5.6′訶黎勒酸t(yī)R=29.3′訶子酸t(yī)R=33′共有指紋峰特征整個(gè)色譜圖分成3區(qū)段。第Ⅰ區(qū)(1～5號(hào)),主峰為1、3、5號(hào)峰，其表觀豐度呈1號(hào)峰>>3號(hào)峰（沒食子酸）<<<5號(hào)峰；2號(hào)、4號(hào)峰為極弱峰，共同構(gòu)成第Ⅰ區(qū)特征。第Ⅱ區(qū)(6～11號(hào)),共有特征是6、7、11號(hào)峰表觀豐度呈遞增趨勢(shì)，豐度較小的8、9、10號(hào)峰構(gòu)成西青果的突出特點(diǎn)。第Ⅲ區(qū)（12～15號(hào)），特征峰最突出的是13號(hào)峰（訶黎勒酸），12號(hào)峰<<<13號(hào)峰>>>14號(hào)峰<<15號(hào)峰。共有指紋峰面積比除訶黎勒酸參照物峰外，7、11號(hào)峰共有指紋峰面積超過總峰面積的10%,規(guī)定相對(duì)峰面積比值：7號(hào)峰為0.24～0.44,11號(hào)峰為0.24～0.45。

8.西青果液相色譜指紋圖譜主要色譜峰的光譜特征及LC/MS鑒定利用