固相萃取技術(shù)

固相萃?。ㄒ唬└攀觯ǘ㏒PE基本原理（三）SPE法的優(yōu)點（四）SPE裝置與操作（五）吸附劑類型（六）固相萃取條件選擇（一）概述SPE：SolidPhaseExtraction是一種液相色譜分離，利用固體吸附劑將液體樣品中的目標化合物與干擾化合物分離，達到分離和富集目標化合物的目的。采用高效、高選擇性的固定相進行萃取的樣品預處理技術(shù)。

SPE技術(shù)自上世紀70年代后期問世以來，發(fā)展迅速，廣泛應用于環(huán)境、制藥、臨床醫(yī)學、食品等領(lǐng)域。概述——固相萃取目的借助SPE所要達到的目的是：（1）從試樣中除去對以后的分析有干擾物質(zhì)；（2）富集痕量組分，提高分析靈敏度；（3）變換試樣溶劑，使之與分析方法想匹配；（4）原位衍生；（5）試樣脫鹽。使用SPE方法，要盡可能避免柱因超載而被穿透，從而影響分析結(jié)果的準確性。概述——樣品類型

SPE可以用于所有類型樣品的處理，但是液體樣品是最容易處理的。Surveyresponse%（二）SPE基本原理

SPE是一種吸附劑萃取，樣品通過填充吸附劑的一次性萃取柱，分析物和雜質(zhì)被保留在柱上，然后分別用選擇性溶劑去除雜質(zhì)，洗脫出分析物，從而達到分離的目的。

SPE的分離模式主要取決于填充劑的類型和溶劑的性質(zhì)。SPE基本原理SPE也是一個柱色譜分離過程，分離機理、固定相和溶劑的選擇等方面與高效液相色譜（HPLC）有許多相似之處。但是SPE柱的填料粒徑（>40μm）要比HPLC填料（3~10μm）大。由于短的柱床和大的粒徑，SPE柱效比HPLC色譜柱低得多。因此，用SPE只能分開保留性質(zhì)有很大差別的化合物。與HPLC的另一個差別是SPE柱是一次性使用。

（三）SPE法的優(yōu)點(1)簡單、快速和簡化了樣品預處理操作步驟,縮短了預處理時間。(2)處理過的樣品易于貯藏、運輸,便于實驗室間進行質(zhì)控。(3)可選擇不同類型的吸附劑和有機溶劑用以處理各種不同類的有機污染物。(4)不出現(xiàn)乳化現(xiàn)象,提高了分離效率。(5)僅用少量的有機溶劑,降低了成本。(6)易于與其他儀器聯(lián)用,實現(xiàn)自動化在線分析。（四）SPE裝置與操作舉例：反相萃取柱C18,C8,Phenyl,CN,NH2活化：甲醇、乙腈等，1倍柱管體積或3倍柱床體積3~5mL/min平衡：水，1倍柱管體積或3倍柱床體積,3~5mL/min上樣：水溶液（緩沖劑稀釋）生物流體等,1mL/min淋洗：含5~50%極性有機溶劑的緩沖水溶液，1~2倍柱管體積或5~10倍柱床體積，1~2mL/min洗脫：極性或非極性有機溶劑，可選加水、緩沖劑、酸、堿等調(diào)節(jié)劑；2~4倍柱床體積，上樣：流出與吸附劑作用最弱的雜質(zhì)；極性最強淋洗：流出與吸附劑作用比目標物弱的雜質(zhì)；極性比目標物強淋脫：流出目標物活化：洗脫與吸附劑作用比目標物強的雜質(zhì)；極性比目標物弱SPE操作步驟

(1)柱預處理-Condition柱預處理有兩個目的:一個目的是除去填料中可能存在的雜質(zhì)；另一個目的是使填料溶劑化，提高固相萃取的重現(xiàn)性。填料未經(jīng)預處理或者未被溶劑濕潤，能引起溶質(zhì)過早穿透，影響回收率。對于非極性相和離子交換SPE柱使用的柱預處理溶劑為易溶于水的甲醇、乙腈、四氫呋喃和丙酮。通常還要用水或緩沖液洗去殘留在柱上的有機溶劑。對于極性的SPE柱，非極性溶劑適合用于預處理過程。通常很少有人用極性溶劑去處理極性的SPE柱，因為極性溶劑會與鍵合相發(fā)生作用，減少吸附劑的與樣品作用的表面積。

柱預處理–WhyCondition？ConditionedsorbentUnconditionedsorbentGoodtransportbetweensampleandsorbent(2)上樣或吸附(loadingoradsorption)

樣品倒入活化后的固相萃取小柱，然后利用抽真空，加壓或抽真空的方法使樣品進入吸附劑。在該步驟，分析物被保留在吸附劑上。為了保證獲得高的回收率，防止分析物的流失。首先，要用合適強度、pH的溶劑稀釋試樣，即將樣品溶液的溶劑強度調(diào)節(jié)到合適的范圍。當以反相機理進行萃取時，以水或緩沖溶液作為溶劑，其中有機溶劑量不超過10%（V/V）最為適合。再次，要適當減少試樣體積或適當增加固相萃取柱中的填料。加到萃取柱上的試樣量取決于萃取柱的尺寸（填料量）和類型，在試樣溶劑中試樣組分的保留性質(zhì)和試樣中分析物及基質(zhì)組分的濃度等因素有關(guān)。最后，加樣萃取流速應該適當。還應該指出的是，整個加樣萃取過程中，應盡量避免柱子流干進入氣泡。(3)淋洗(Washing)-除去干擾雜質(zhì)淋洗：在樣品進入吸附劑，目標化合物被吸附后，可先用較弱的溶劑將弱保留干擾化合物洗掉。洗滌的目的是為了去除吸附在柱子上的少量基體干擾組分。一般的洗滌液是合適的中等強度的溶劑。對反相萃取柱，清洗溶劑是含適當濃度有機溶劑的水或緩沖溶液。通過調(diào)節(jié)清洗溶劑的強度和體積，盡可能多地除去能被洗脫的雜質(zhì)。為了決定最佳清洗溶劑的濃度和體積，加試樣SPE柱上，用5-10倍SPE柱床體積的溶劑清洗，依次收集和分析流出液，得到清洗溶劑對分析物洗脫廓形。依次增加清洗溶劑的強度，根據(jù)不同強度下分析物的洗脫輪廓圖，決定清洗溶劑合適的強度和體積。(4)洗脫(Elution)-分析物的洗脫和收集洗脫：用較強的溶劑將目標化合物洗脫下來，加以收集。目的：是將分析物完全洗脫并收集在最小體積的洗脫劑中，同時使比分析物更強的保留的雜質(zhì)盡可能多地保留在SPE柱上。較強的溶劑能夠使分析物洗脫并富集到一個很小的體積，但有較多的強保留雜質(zhì)同時被洗脫下來；當用較弱的溶劑洗脫，富集的體積較大，但含較少的雜質(zhì)。為了提高分析物的濃度或為以后的分析調(diào)整溶劑性質(zhì)，如可以把收集到的分析物用氮氣吹干，再溶于小體積適當?shù)娜軇┲?。為了選擇合適的洗脫劑強度和體積，可通過條件實驗確定，如加試樣于SPE柱上后，改變洗脫劑的強度和洗脫液的體積分別洗脫，測定分析物的回收率，在保持有較高回收率的前題下確定最佳洗脫劑的組成和最佳洗脫體積。（五）吸附劑類型

根據(jù)官能團的特性，固相吸附劑被分類為6大種類。正相吸附劑（活性碳、石墨碳等）非極性相（SDB、C18等）極性相（硅膠、FL等）離子交換相（SAX、SCX等）混合、積層相（SAX／PSA等）特殊結(jié)合相（PA等）要讓固相萃取得以成功，必須根據(jù)目的物質(zhì)的特性（有無疏水性構(gòu)造、有無-OH、-COOH、N等極性官能團、離子性官能團等）以及基體的特性來選擇相應合適的固相。另外，對于一般常用的無極性相，不同固相下其選擇性也會有所不同，因此必須選擇其中最為合適的固相。（五）吸附劑類型1、正相固定相2、反相固定相3、離子交換劑4、混合模式固定相5、商品柱舉例吸附劑類型非極性相C18OctadecylC2EthylCHCyclohexylPHPhenyl極性固定相CNCyanopropyl2OHDiolNH2AminopropylSISilica離子交換固定相SCXStrongcationexchangerCBAWeakcationexchangerSAXStronganionexchangerNH2Weakanionexchanger特殊固定相PBA柱鍵合苯硼酸CERTIFY柱C8和苯磺酸（SCX）ENVIRELUT柱ACCUCAT柱SCX/SAX混合Increasingpolarity鍵合型填料常用的鍵合硅膠固定相固定相簡稱極性應用辛烷基C8非極性反相十八烷基C18(ODS)非極性反相乙基C2弱極性反相環(huán)己基CH弱極性反相苯基PH弱極性反相氰丙基CN極性正相二醇基Diol(2OH)極性正相硅膠Si（OH）極性正相氨丙基NH2極性弱陰離子交換三甲基胺丙基SAX極性強陰離子交換乙基羧酸CBA極性弱陽離子交換丙基苯基磺酸SCX極性強陽離子交換1、正相固定相

原理：保留取決于分析物的極性官能團與吸附劑表面的極性官能團之間的相互作用。

條件：用比樣品本身更極性的溶劑洗脫吸附的分析物質(zhì)。流動相：非極性、中等極性；固定相：極性；分析物質(zhì)：極性、中等極性、非極性極性官能團鍵合硅膠：LC-CN，LC-NH2，LC-Diol極性吸附物質(zhì)：硅膠,Florisil，ENVI-Florisil，Alumina硅膠性質(zhì)特點

在SPE法中最常用的吸附劑是硅膠或鍵合相的硅膠即在硅膠表面的硅醇基團上鍵合不同的有機基團，如烷基鏈或其它官能團，如-OH、-C6H5、-NH2、-CN等。實際上吸附劑角色是由這些新接上的含官能基碳鏈來完成。

以硅膠為基質(zhì)的吸附劑主要有以下優(yōu)點：粒徑（e.g.40μm)、孔徑（e.g.60A）、表面積（600m2/g)、鍵合量易控制；機械強度高；化學性質(zhì)穩(wěn)定；適應性廣；可使用的溶劑種類多。硅膠表面的官能團SiSiOH

OHFreesilanolAdsorbedwaterSiloxanebridge(dehydratedsilanol)GeminalsilanolSiOH2OOOHSiOHBoundandreactivesilanolsSiSiOSiOHH2、反相固定相LC-18、LC-8：標準的單鍵合硅膠ENVI-18、ENVI-8：聚合鍵合類填料ENVI-ChromP：苯乙烯：疏水ENVI-Carb：含碳SPE分離方式稱為反相BPC。最適用于極性基質(zhì)中萃取非極性化合物。當樣品溶液通過萃取柱時，雜質(zhì)不被保留，直接通過柱子除去，只有分析物保留在柱上，只要選用一種合適的洗脫溶劑既可將其從柱上洗下。3、硅膠鍵合離子交換劑填充劑為硅膠基質(zhì)的離子交換官能團有：季胺、氨基、二氨基、苯磺酸基、羧基等。此外常用的還有聚合物，如苯乙烯-而乙烯苯共聚物XAD-2及PRP-1等。相對于鍵合相填料，聚合物可適用于全部pH范圍，因而應用廣泛。對于酸性化合物，如有機酸、無機陰離子、酸性蛋白等，一般采用陰離子交換SPE柱；對于堿性化合物，如有機胺、金屬離子、兒茶酚胺和堿性蛋白等，采用陽離子交換SPE柱。

目的物質(zhì)TnertSep構(gòu)造對象化合物弱離子強離子酸性物質(zhì)陰離子交換MA-13級胺-CH2-N(R)○○MA-22級胺-CH2-N(R)○×NH2胺丙基-CH2CH2CH2NH2×○PSA1級?2級胺-CH2CH2CH2NHCH2CH2NH2×○SAX三甲胺丙基-CH2CH2CH2N+(CH3)3Cl-○×堿性物質(zhì)陽離子交換MC-1磺酸-CH2-SO3H○○MC-2羧酸-CH2-COOH○×CBA乙基羧酸-CH2CH2COOH×○PRS丙基磺酸-CH2CH2CH2SO3-Na+○×SCX苯磺酸-CH2CH2C6H4SO3-H+○×SCXPRSCBASAXPSANH2StronganionStronganion,pKa<1Weakanion,pKa4.8StrongcationWeakcation,pKa10.9,10.1Weakcation,pKa9.8NHCH2CH2NH20.7meq/g0.3meq/gpH-sensitive0.8meq/gpH-sensitivepH-sensitiveSO3-SO3-NH2N+Me3CO2H硅膠鍵合離子交換劑

WeakorStrongAcids/Bases4、混合模式固定相5、固定相與分析物作用（1）極性固定相與分析物作用（2）非極性固定相與分析物作用（3）離子交換劑與分析物作用（4）基質(zhì)對分離機制的影響NH3+NH2NH2CompoundSuggestedmechanismNon-polarPolarIonexchangeMatrixtypeSalinesolutionOliveoilDrinkingwater6、商品柱舉例

BondElutPBA固相萃取柱生產(chǎn)商：VarianInc.

硅膠基質(zhì)：40μm或120μm不規(guī)則形狀，酸洗處理，平均孔徑60埃;鍵合相：苯硼酸;端基未封閉；典型載碳量：7.9％；主要保留機理：通過二醇基與分析物之間的共價作用力；應用樣品類型：水樣，生物體液樣品PBA是一種獨特的吸附劑，它由苯硼酸在硅膠表面形成共價鍵，由于共價鍵的作用力與其它作用機理的作用力相比要高10－100倍，化合物可以更緊密的結(jié)合在吸附劑表面，從而得到徹底地凈化。硼基對于包含二醇基團的化合物例如兒茶酚、核酸、小分子量蛋白和糖類等具有很強的特異性。當分析物的官能團共面時，通常會被很強地保留。BondElutCertifySPE柱生產(chǎn)商：VarianInc.硅膠基體：40μm或者120um不規(guī)則形，酸洗處理，60埃平均孔徑鍵合相：混合模式，辛基（C8）和苯磺酸（SCX）

端基封閉：否典型載碳量：9.0%主要保留機理：雙重模式，非極性和強陽離子交換應用樣品類型：尿，生物體液樣品EnvirElut產(chǎn)品名稱：EnvirElut殺蟲劑,除草劑和多環(huán)芳烴分析SPE柱型號規(guī)格：1g/3ml，50只/包生產(chǎn)商：VarianInc.產(chǎn)品簡介：高純度和大容量的EnvirElut吸附劑，使其特別適用于從大體積水樣基質(zhì)中提取多種性質(zhì)的有機化合物。EnvirElut在售出之前，都將嚴格地測試其從水質(zhì)樣品中對所提取的環(huán)境污染物的保留能力。EnvirElut吸附相被直接填充到BondElut直筒柱中，專門用于環(huán)境分析，EnvirElut除草劑、多環(huán)芳烴、殺蟲劑,和苯酚SPE柱，可以用在常規(guī)的VacElut固相萃取真空裝置中（六）固相萃取條件選擇1、SPE柱子類型的選擇2、溶劑的選擇3、柱子尺寸與容量選擇3、樣品pH對吸附性影響4、樣品體積對吸附性能影響1、SPE柱子類型的選擇固相萃取吸附劑的選擇原則不同SPE吸附劑與分析物之間的相互作用力反相SPE萃取劑包括鍵合硅膠萃取劑（C18，C8，C2，苯基，環(huán)己基）和PS-DVB的聚合大孔樹脂萃取劑通過范德華力與分析物作用，非離子型的水溶性化合物可以保留在反相SPE萃取劑上，但甲醇溶液中此類化合物不能被吸附。正相萃取劑像氰基，硅膠，氧化鋁，F(xiàn)lorisil是通過偶極力-偶極力作用力吸附分析物，二醇基、氨基則是通過氫鍵作用力使分析物保留于吸附劑上。溶于正己烷的極性分析物能很好的被正相SPE萃取劑保留。離子交換SPE萃取劑是通過靜電作用保留分析物的。石墨炭黑SPE萃取劑則存在多種作用力包括范德華力、靜電作用力等。不同SPE吸附劑與分析物之間的相互作用力2、柱子尺寸與容量選擇固相的填充劑量與保持容量（capacity）必須選擇與基體及目的物質(zhì)負載量相適合的填充劑量及尺寸。一般來說，小柱類型的總保留量（包括夾雜物在內(nèi)）應該控制在固相填充量的最大5%以下。應選擇合適的尺寸，以確保不至于超過規(guī)定量。分離機制典型的弱溶劑（保留條件）典型的強溶劑（洗脫條件）反相SPE緩沖液或低濃度的甲醇或乙腈乙腈、甲醇或溶劑與水的混合物正相SPE正己烷、甲苯等二氯甲烷、甲醇等陽離子交換SPE低離子強度緩沖液(<0.1mol/L)高離子強度緩沖液（＞0.1mol/L)低反離子強度高反離子強度陰性離子交換SPE低離子強度緩沖液（<0.1mol/L)高離子強度緩沖液(>0.1mol/L)3.溶劑的選擇Monomethyl(MMP),Monoethyl(MEP),Mono-n-propyl(MPRP),Mono-n-butyl(MBP),Mono-n-pentyl(MPEP),Mono-n-octyl(MOP)Phthalates（鄰苯二甲酸鹽酯）4、樣品pH對吸附性影響Ifacompoundisionizable,theextractionwillbepHdependent.5、離子強度對吸附特性的影響Effectofthesolutionionicstrengthontheadsorption.(initialLOMconcentration=2mmolL-1;pH=6;temperature=25oC).Breakthroughvolumeasthepointatwhich1%ofthesampleconcentrationattheentranceofthesorbentbedisdetectedattheoutletofthesorbentbed.Thetypeandquantityofsorbent,hydrophobicityandionizabilityoftheanalytes,andsamplevolumeandpHinteractivelydeterminethebreakthroughvolume.Thebreakthroughvolumeforaspecificmassofsorbentcanbeestablishedbyeitherloadingvariable-volumesamplesofconstantconcentrationorvariable-volumesamplesofvariableconcentration,inwhichcasethelattercomprisesaconstantmolaramountloaded。Alternatively,methodsexistforpredictingthebreakthroughvolume.6、樣品體積對吸附性能影響提高SPE重現(xiàn)性的方法從SPE的操作步驟可以看出，SPE的重現(xiàn)性受多個因素的影響，除了優(yōu)化實驗條件外，提高重現(xiàn)性的方法還可以（1）使用替代物，加入適當?shù)奶娲镒鰠⒈?；?）加入樣品量適當，不超出穿透量和穿透體積；（3）選擇合適的洗滌液和洗脫液，確保分析物在操作中不流失。（七）高選擇性固相萃取技術(shù)鑰匙分子與鎖體物質(zhì)混合除去分子鑰匙，形成含有鑰匙分子結(jié)合位點和孔穴的印跡聚合物，可以重新識別印跡分子建立含鑰匙的聚合物，相互作用分子印跡技術(shù)（MolecularImprintingTechnique,MIT）就是仿照抗體的形成機理，在模板分子周圍形成一個高度交聯(lián)的剛性高分子，除去模板分子后在聚合物的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中留下具有結(jié)合能力的反應基團，對模板客體分子表現(xiàn)高度的選擇性識別性能。1、分子印跡固相萃取技術(shù)什么是分子印跡？預定性(predetermination)

決定了人們可以根據(jù)不同的目的制備不同的MIPs，以滿足各種不同的需要；識別性(recognition)

因為MIPs是根據(jù)模板分子量身定做的，它具有特殊的分子結(jié)構(gòu)和官能團，能選擇性地識別模板分子；實用性(practicability)

與天然的生物分子識別系統(tǒng)相比，具有抗惡劣環(huán)境、穩(wěn)定性高、使用壽命長和制備過程簡單等特點。分子印跡技術(shù)的特點分子印跡技術(shù)起源與發(fā)展40年代，Pauling試圖用鎖匙理論解釋免疫體系。引出分子印跡技術(shù)。1949年，Dickey首先提出了“分子印跡”這一概念。1972年，Wulff小組報道了人工合成的有機分子印跡聚合物。1977年，德國的Wulff小組創(chuàng)立預組裝方式。1984年，瑞典的Mosbach將模板與功能單體之間的非共價鍵引入MIPs，創(chuàng)立自組織方式（非共價印跡方法）。1995年，英國的Whitcombe等建立犧牲空間印跡方法。1997年，在瑞典的Lund大學成立了國際性的分子印跡學會(SocietyforMolecularImprinting,SMI)。分子印跡技術(shù)的基本理論和原理分子印跡聚合物（MIPs）的制備過程分子印跡方法與作用機理非共價鍵型和共價鍵型分子印跡聚合物的制備(1)具有適當?shù)膭傂?聚合物在脫去模板分子后仍能保持空穴原來的形狀和大小。(2)具有一定的柔性,使底物與空穴的結(jié)合能快速達到平衡。柔性對于分子印跡聚合物模擬酶來說尤其具有重要意義。(3)具有一定的機械穩(wěn)定性,這一點對于高效液相色譜(HPLC)尤為重要。(4)具有熱穩(wěn)定性,使其能在較高溫度環(huán)境下使用,因為對于一般的反應來說,溫度較高使動力學上更有利。理想的分子印跡吸附劑應具備的性質(zhì)分子印跡吸附劑的制備方法制備分子印跡聚合物原材料：

模板分子：功能單體：交聯(lián)劑（1:4:20）

溶劑或分散劑、引發(fā)劑交聯(lián)劑聚合反應溶劑非共價型MIPs中,反應溶劑起著致孔劑的作用，對印跡分子等應具有較高的溶解性,能促進印跡分子與功能分子間的相互作用,至少不干擾這種效應。在極性溶劑中,印跡分子主要靠疏水作用與功能單體結(jié)合。在非極性溶劑中則主要靠氫鍵等作用與功能單體結(jié)合。盡可能采用介電常數(shù)低的溶劑,如甲苯、氯仿、二氯甲烷等。為避免溶脹發(fā)生,吸附中所用的溶劑最好與聚合反應溶劑一致引發(fā)劑偶氮二異丁腈(AIBN)或偶氮二(2,42二甲基)戊腈(ABDV)、2,2`-偶氮雙(N,N`-二甲基-異丁基脒)在加熱或UV照射下引發(fā)。分子印跡聚合物的制備方法：本體聚合

(BulkPolymerization)原位聚合(InSituPolymerization)懸浮聚合法

(suspensionpolymerization)多步溶脹聚合法

(multi-stepswelling