寡核苷酸的純化與質(zhì)量鑒定

/6寡核苷酸的純化與質(zhì)量鑒定寡核苷酸的純化與質(zhì)量鑒定市售或者委托別人合成的寡核苷酸常常已經(jīng)純化，自行合成的須經(jīng)過(guò)純化后方可應(yīng)用。一、寡核苷酸的收獲和去保護(hù)基結(jié)合在合成柱內(nèi)玻璃粉上的寡核苷酸鏈經(jīng)濃氨水處理后便脫落下來(lái)，核苷酸鏈上的保護(hù)基因在濃氨水中于55℃水浴中保溫6小時(shí)以上被去除，經(jīng)柱脫鹽干燥后分裝保存。一將合成柱一頭的封蓋打開(kāi)，將顆粒倒入一個(gè)帶有密封墊的螺口蓋小瓶?jī)?nèi)，加入新開(kāi)封的濃氨水。密封好，置55℃水浴過(guò)夜(至少6小時(shí))。這步操作將脫支持物與去保護(hù)基兩步合并到一起，目的是為了減少脫支持物不徹底造成的寡核苷酸的丟失。合成柱不易拆開(kāi)的，可在合成柱一端接上5一次性注射器，分兩次加入以上量的濃氨水，使氨水充滿合成柱并設(shè)法使之停留在柱內(nèi)，留置1分5鐘后將氨水推入小瓶?jī)?nèi)，再向柱內(nèi)注入第二次氨水，作用15分鐘后推出。同法進(jìn)行55℃過(guò)夜處理。用注射器注入氨水需注意盡量密封，以免氨氣揮發(fā)，可將注射器的活塞插入針管內(nèi)，推入的距離不要太大，以免壓力過(guò)大使氨水從柱的另一端流出。二)從5(5℃水浴中取出小瓶后不能立即開(kāi)蓋以免液體因氨氣的逸出而飛濺，需將小瓶置4℃冷卻，以降低瓶?jī)?nèi)氨氣產(chǎn)生的壓力。三準(zhǔn)備柱。2稱(chēng)取10a灑在225去離子水中，待浸透后置100℃水浴中煮沸1小時(shí)。室溫下放置3分0鐘，傾去上層不沉淀小顆粒。用一個(gè)10一次性注射器制作分離柱，柱下不接導(dǎo)管，裝至102刻度，在頂上放一圓形濾紙片，以防止加液時(shí)攪動(dòng)柱床，用0氨水洗柱，讓液體自然流干。這樣的分離柱床外水約為。準(zhǔn)確的體積可用藍(lán)葡聚糖溶液測(cè)定。四將過(guò)夜處理的寡核苷酸濃氨水液加到柱d,用0氨氣洗滌小瓶，待液體完全進(jìn)柱后將其加入柱，然后用氨水洗脫并立即收集此流出液。若重復(fù)使用柱，起碼要用0氨水洗脫，除去柱內(nèi)的鹽份。五測(cè)20取4收集液用去離子水1稀釋后于20測(cè)值。六收集液適當(dāng)分裝成數(shù)份如每份，于20℃凍結(jié)，在離心真空濃縮器中干燥。七離心真空干燥，然后用去離子水04溶解干粉，再真空干燥一次，將寡核苷酸溶解適當(dāng)濃度備用。根據(jù)1寡核苷酸計(jì)算產(chǎn)量。為了不浪費(fèi)寡核苷酸，測(cè)所用的稀釋液可以保留，可用來(lái)溶解寡核苷酸、進(jìn)行5末端標(biāo)記等。注意每次測(cè)定寡核苷酸濃度時(shí)應(yīng)將比色杯清洗干凈，以免被其他污染。干燥的寡核苷酸可在室溫下運(yùn)輸，收藏最好于低溫。二、寡核苷酸質(zhì)量鑒定寡核苷酸的質(zhì)量需經(jīng)電泳鑒定，確定產(chǎn)物的純度。取大約0寡核苷酸進(jìn)行末端標(biāo)記，操作見(jiàn)寡核苷酸探針標(biāo)記部分）。用20聚%丙烯酰胺變性膠電泳分離，用已知長(zhǎng)度的標(biāo)記寡核苷酸作長(zhǎng)度對(duì)照，放射自顯影。如果寡核苷酸質(zhì)量很好小片段較少，用作引物時(shí)可不必純化用作探針者，必須經(jīng)過(guò)聚丙烯酰胺序列膠分離純化。三、聚丙烯酰胺變性膠分析和純化寡核苷酸一）配（制0丙烯酰胺變性膠工作液含丙烯酰胺、，甲撐雙丙烯酰胺、、尿素二裝配聚丙烯酰胺凝膠模板，根據(jù)膠的厚度計(jì)算所用膠量，制備聚丙烯酰胺凝膠，分析膠膠厚0.4，制備膠厚。三）電泳及（檢測(cè)分析1膠.：將標(biāo)記好的寡核苷酸在80℃加熱5分鐘，加1/1體0積的加樣

液（0.溴0酚5藍(lán)%、液（0.溴0酚5藍(lán)%、電泳緩沖液用,上樣前預(yù)電泳分鐘。電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)進(jìn)膠時(shí)停止電泳約小時(shí)。取下一面玻板，用保鮮膜覆蓋膠面。在暗室中放一張光片在樣品部位，曝光?分鐘。用記號(hào)筆作好位置標(biāo)記以便定位，沖洗光片?？捎靡阎L(zhǎng)度的寡核苷酸作大小標(biāo)志，多個(gè)樣品一起分析時(shí)可以不用標(biāo)志。二甲苯藍(lán)的位置相當(dāng)于2個(gè)5核苷酸。位置正確的寡核苷酸帶可挖出作探針。純化制備2膠.：膠厚度一般為，上樣量為?齒寬。將寡核苷酸溶在去離子甲酰胺中，濃度為，直接加樣，不要加染料，否則會(huì)干擾觀察條帶?？稍谕鈧?cè)兩邊的樣品孔中加染料作為電泳進(jìn)程的指示。當(dāng)溴酚藍(lán)進(jìn)膠時(shí)停止電泳，需要~小時(shí)。由于膠比較厚，電泳中產(chǎn)熱多，電壓不能過(guò)高，一般為?/以免玻板破裂，如果有恒溫循環(huán)水裝置，電壓不受限制。將一側(cè)的玻板去掉覆蓋一層保鮮膜，翻轉(zhuǎn)玻板使膠在玻板的下方，輕輕去掉玻板，再覆上一層保鮮膜。在膠下方放一塊在紫外線激發(fā)下能發(fā)熒光薄層層析板，用短波紫外線燈照射。由于吸收紫外線，在區(qū)帶處板不發(fā)熒光而呈黑色條帶，用清潔刀片切下所要的條帶。四）從制（備膠中回收寡核苷酸將膠塊放在離心管中搗磨碎，加入、酚，37℃搖混過(guò)夜。離心分離收集上清。再用抽提膠末3小時(shí)。將兩次洗脫液合并，用正丁醇濃縮液體至體積.乙醚抽提3次除去正丁醇。過(guò)e、真空干燥。也可乙醇沉淀法。大頭醫(yī)生/免責(zé)聲明1.用戶明確同意其使用網(wǎng)絡(luò)服務(wù)所存在的風(fēng)險(xiǎn)將完全由其本人承擔(dān)；因其使用網(wǎng)絡(luò)服務(wù)而產(chǎn)生的一切后果也由其本人承擔(dān)。對(duì)用戶及任何第三方不承擔(dān)任何責(zé)任。不擔(dān)2保.或保證網(wǎng)絡(luò)服務(wù)一定能滿足用戶的要求，也不擔(dān)保網(wǎng)絡(luò)服務(wù)不會(huì)中斷，對(duì)網(wǎng)絡(luò)服務(wù)的及時(shí)性、安全性、準(zhǔn)確性也都不作任何擔(dān)保或保證。不3.保證為向用戶提供便利而設(shè)置的外部鏈接的準(zhǔn)確性和完整性，同時(shí)，對(duì)于該等外部鏈接指向的不由實(shí)際控制的任何網(wǎng)頁(yè)上的內(nèi)容，也不承擔(dān)任何責(zé)任。對(duì)4于.因不可抗力或不能控制的原因造成的網(wǎng)絡(luò)服務(wù)中斷或其它缺陷，不承擔(dān)任何責(zé)任，但將盡力減少因此而給用戶造成的損失和影響。對(duì)5于.任何自本網(wǎng)站而獲得的他人的信息、內(nèi)容或者廣告宣傳等任何資訊（以下統(tǒng)稱(chēng)信息），不保證真實(shí)、準(zhǔn)確和完整性。如果任何單位或者個(gè)人通過(guò)上述信息而進(jìn)行任何行為，須自行甄別真?zhèn)魏椭?jǐn)慎預(yù)防風(fēng)險(xiǎn)。否則，無(wú)論何種原因，本網(wǎng)站不對(duì)任何非與本網(wǎng)站直接發(fā)生的交易和/或行為承擔(dān)任何直接、間接、附帶或衍生的損失和責(zé)任。用6戶.同意，對(duì)于向用戶提供的下列產(chǎn)品或者服務(wù)的質(zhì)量缺陷本身及其