山東大學生物化學核酸-02

第五章

核

酸生物化學

第四節(jié)核酸的性質（一）酸水解對酸的敏感性：糖苷鍵＞磷酸酯鍵嘌呤糖苷鍵＞嘧啶糖苷鍵利用酸水解可以研究核酸的堿基組成。（二）堿水解RNA的磷酸酯鍵對堿敏感。DNA抗堿水解。生理意義：DNA更穩(wěn)定，遺傳信息。RNA是DNA的信使，完成任務后迅速降解。一、核酸的水解（三）酶水解非特異的磷酸二酯酶：蛇毒磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得5’-核苷酸牛脾磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得3’-核苷酸特異的磷酸二酯酶：核酸酶第四節(jié)核酸的性質一、核酸的水解1、核酸酶的分類底物專一性：核糖核酸酶RNase脫氧核糖核酸酶DNase作用方式：核酸外切酶（exonuclease)、核酸內切酶(endonuclease)。單鏈核酸酶、雙鏈核酸酶、雜鏈核酸酶磷酸二酯鍵的斷裂方式：5’-（寡）核苷酸3’-（寡）核苷酸核酸酶RNaseH作用于DNA-RNA中的RNA鏈牛胰核糖核酸酶（pancreaticribonuclease),RNaseI最適pH：7.0-8.2產物：以3’-嘧啶核苷酸結尾的寡核苷酸，高度專一的內切酶RNaseT1耐熱、耐酸產物：以3’-鳥苷酸結尾的寡核苷酸，專一性更高RNaseT2產物：以3’-腺苷酸結尾的寡核苷酸核酸酶2、RNase核酸酶S1作用于單鏈DNA部分牛胰核糖核酸酶，DNaseI切斷雙鏈或單鏈DNA產物：以5’-磷酸為末端的寡核苷酸DNA限制性內切酶具有非常嚴格的堿基序列專一性核酸酶3、DNase4、N-糖苷酶以限制性內切酶及連接酶進行核酸剪接GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGGCTTAAAATTCGAATTCGGCTTAAGCTTAAAATTCGGCTTAAAATTCGGCTTAAAATTCGEcoRIDNALigaseEcoRIstickyendEcoRIstickyendJuangRH(2004)BCbasics目標基因殖入質粒并轉化宿主菌1plasmid1cell重組質粒轉化宿主目標基因殖入質粒限制酶限制酶染色體目標基因重組基因細胞轉化宿主菌JuangRH(2004)BCbasics二、

核酸的酸堿性質P504核酸的磷酸基具有酸性，堿基具有堿性，因此，核酸具有兩性電離的性質。但核酸中磷酸基的酸性大于堿基的堿性，其等電點偏酸性。DNA的pI約為4～5，RNA的pI約為2.0～2.5，在pH7～8電泳時泳向正極。第四節(jié)核酸的性質1、堿基的解離p5052、核苷的解離P5053、核苷酸的解離P5064、核酸的滴定曲線P507三、

核酸的紫外吸收堿基、核苷、核苷酸和核酸在240~290nm的紫外波段有強烈的光吸收，λmax=260nm第四節(jié)核酸的性質1、鑒定純度純DNA的A260/A280應為1.8（1.65-1.85）純RNA的A260/A280應為2.0。若溶液中含有雜蛋白或苯酚，則A260/A280比值明顯降低。2、含量計算1ABS值相當于：50ug/mL雙螺旋DNA或：40ug/mL單鏈DNA（或RNA）或：20ug/mL寡核苷酸3、判斷DNA是否變性在DNA的變性過程中，摩爾吸光系數(shù)增大（增色效應）在DNA的復性過程中，摩爾吸光系數(shù)減?。p色效應）第四節(jié)核酸的性質四、

核酸的變性、復性及雜交第四節(jié)核酸的性質(一)變性P508核酸雙螺旋區(qū)的氫鍵斷裂，變成單鏈，不涉及共價鍵斷裂。當核酸的氫鍵在外界因素的影響下,發(fā)生斷裂,使兩條鏈分開,但不降解.叫核酸的變性.

第四節(jié)核酸的性質1、影響核酸變性的因素:1).外因:凡能破壞氫鍵和堿基堆積力的因素,都是核酸變性的因素.如:A熱變性,B酸堿變性（pH小于4或大于11）,C有機試劑變性（尿素、鹽酸胍、甲醛）等.2).內因:A.堿基的含量.(AT易變性,GC不易)B.DNA的均一性.C.堿基的順序效應.1).DNA的變性現(xiàn)象將DNA的稀鹽溶液加熱到80--1000C,幾分鐘后,DNA將發(fā)生一系列的物理化學性質的改變(宏觀表現(xiàn)).260nm的紫外吸收值升高.(增色效應)比旋下降.粘度下降.浮力密度升高.酸堿滴定曲線改變.生物活性喪失.第四節(jié)核酸的性質2、DNA的熱變性與Tm值增色效應與減色效應增色效應：DNA變性過程中，摩爾吸光系數(shù)增大。減色效應：DNA復性過程中，摩爾吸光系數(shù)減小。第四節(jié)核酸的性質核酸的變性與復性Garrett&Grisham(1999)Biochemistry(2e)p.373增色效應減色效應DNA的變性是爆發(fā)式的，變性作用發(fā)生在一個很窄的溫度范圍內。HyperchromicEffect核酸變性觀察5070901.31.21.11.0Temperature(C)Relativeabsorbance(260nm)TmAdaptedfromVoetetal(1999)FundamentalofBiochemistryp.739DNA變性作用發(fā)生在一個很窄的溫度范圍內。2、熔解溫度（Tm）：DNA的雙螺旋結構失去一半時對應的溫度。濃度50ug/mL時，雙鏈DNAA260=1.00，完全變性（單鏈）A260=1.37當A260增加到最大增大值一半時，即1.185時，對應的溫度即為Tm。DNA的Tm一般在82—95℃之間溶解溫度Tm3、影響DNA的Tm值的因素①DNA均一性。均一性高，變性溫度范圍越窄，據此可分析DNA均一性。溶解溫度Tm核酸G+C組成分越高者Tm越大7080901001.41.21.0Relativeabsorbance(260nm)Temperature(°C)Pneumococcus肺炎球菌(38%)G+CE.coli(52%)S.Marcescens粘質沙雷氏菌

(58%)M.Phlei分枝桿菌

(66%)AdaptedfromGarrett&Grisham(1999)Biochemistry(2e)p.372②G-C含量與Tm值成正比。測定Tm，可推知G-C含量。G-C%=（Tm-69.3）×2.44P509核酸G+C含量與Tm值成正比③介質中離子強度P509離子強度高，Tm高。Tm值與介質中離子強度的關系陽離子中和核酸的負電荷而使Tm增大60708090100110100806040200Tm(C)G+C(%)0.15MNaCl0.015MNacitrate0.01Mphosphate0.001MEDTAAdaptedfromGarrett&Grisham(1999)Biochemistry(2e)p.3723’5’5’3’DNA分子的復性(二)、復性指經加熱變性的DNA在適當條件下，二條互補鏈全部或部分恢復到天然雙螺旋結構的現(xiàn)象，它是變性的一種逆轉過程。熱變性DNA一般經緩慢冷卻后即可復性，此過程稱之為退火(annealing)。DNA分子的復性復性機制：10-20bp成拉鏈熱變性DNA在緩慢冷卻時可以復性，快速冷卻不能復性。復性速度可用Co·t衡量。Co為變性DNA原始濃度mol·L-1，t為時間，以秒表示。變性DNA在適當條件下（一般低于Tm值20~25℃），兩條鏈重新締合成雙螺旋結構。核酸復性的速度與其基因組復雜度有關p51010-610-510-410-310-210-11101001K10K00.51.0Fractionreassociatedc0t(mole/L?

sec)1101021031041051061071081091010E.coliT4MS2Mousesatellite牛CalfPolyU/PolyAAdaptedfromGarrett&Grisham(1999)Biochemistry(2e)p.374復性所需時間(長)基因組大小分子雜交（三）分子雜交：(hybridization)

不同來源的核酸變性后，合并在一處進行復性，這時，只要這些核酸分子的核苷酸序列含有可以形成堿基互補配對的片段，復性也會發(fā)生于不同來源的核酸鏈之間，即形成所謂的雜化雙鏈，這個過程稱為雜交(hybridization)。1、SouthernBlottingDNA樣品→酶切→電泳→堿變性→轉膜→固定→雜交→洗滌→放射自顯影SouthernBlotting可用于DNA之間同源性分析，確定特異性DNA序列的大小和定位。(三)分子雜交分子雜交核酸分子間的雜交反應

hybridizationRNADNA1DNA2探針SouthernhybridizationNorthernhybridizationJuangRH(2004)BCbasics雜交可以發(fā)生于DNA與DNA之間，也可以發(fā)生于RNA與RNA之間和DNA與RNA之間。Northernblotting（印跡法）SouthernBlotting的轉印Albertsetal(2002)MolecularBiologyoftheCell(4e)p.499取出轉印紙以探針雜交呈色Albertsetal(2002)MolecularBiologyoftheCell(4e)p.4992、

NorthernBlotting研究對象是mRNA，探針一般是DNA。總RNA或mRNA需在變性條件下電泳（乙二醛、甲醛）3、

WesternBlotting抗原與抗體的雜交研究克隆基因表達產物、鑒定克隆株的常用技術。Northernblotting（印跡法）菌落轉印到濾紙后以探針雜合蓋上濾紙顯像呈色加入探針轉印中取出濾紙溶解細胞核酸變性JuangRH(2004)BCbasicsColonyhybridization樣本

DNA每一點上涂布有已知

DNA生物芯片Schena(2000)MicroarrayBiochipTechnology,p.A31互補的

DNA會互相雜合產生信號基因芯片利用雜交反應JuangRH(2004)BCbasics第五節(jié)

核酸研究技術一、

核酸的分離純化和定量盡可能保持其天然狀態(tài)，防止降解和變性。條件溫和，防止過酸、過堿、劇烈攪拌。抑制核酸酶。（一）DNA分離純化真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶于水或高鹽溶液（1mol/LNaCl），但不溶于低鹽溶液（0.14mol/LNaCl），據此，采用高鹽提取，低鹽沉淀，可將DNP與RNA核蛋白分開，提取出DNP。DNP可用水飽和的酚抽提，去除蛋白質。還可用氯仿異戊醇去除蛋白質。水相中的DNA可被0.3MNaAC-70%乙醇沉淀。一、核酸的分離純化和定量（二）RNA的制備RNase的滅活：玻璃器皿：140-200°C，8小時；塑料器皿：0.1%DEPC(焦碳酸二乙酯)，37°C

，過夜提取液加鹽酸胍或異硫氰酸胍反應體系中加RNasin等特異的RNase抑制劑一、核酸的分離純化和定量不同構象的核酸（線形、環(huán)形、超螺旋），密度和沉降速率不同，用Cs-Cl密度梯度離心可以將不同構象DNA、RNA與蛋白質區(qū)分開來。這一方法常用于質粒DNA的純化。二、核酸的沉降特性與超速離心超螺旋DNA或（一）瓊脂糖電泳用于大片段DNA的分離，精度低，但分離范圍廣影響遷移率的因素：①

核酸分子的大小，遷移率與分子量的對數(shù)成反比②凝膠濃度③

DNA的構象，超螺旋最快，環(huán)型其次，線型最慢。④

電壓，不大于5V/cm染色：0.5ug/mlEBRNA的瓊脂糖凝膠電泳一般要加入甲醛或戊二醛三、核酸的凝膠電泳瓊脂糖電泳可以用于DNA分子量的測定三、核酸的凝膠電泳（二）PAGE電泳

以聚丙烯酰胺作支持物，這種凝膠的孔徑比瓊脂糖膠要小，所以可用于分析相對分子質量小于1000bp的DNA片段和RNA的電泳。聚丙烯酰胺凝膠強度較好，常用垂直板電泳。三、核酸的凝膠電泳(一)、

限制修飾系統(tǒng)

限制性內切酶往往與一種甲基化酶同時成對存在，構成一個限制修飾系統(tǒng)，甲基化酶使細菌自身的DNA帶上標志，限制性內切酶專門用于降解入侵的外源DNA。限制酶的命名，如：E.coRI第一位：屬名E（大寫）第二、三位：種名的頭兩個字母小寫co第四位：菌株R第五位：從該細菌中分離出來的這一類酶的編號四、限制性核酸內切酶與DNA物理圖譜構建（1979年發(fā)現(xiàn)p504）同裂酶：來源不同的限制酶（名稱自然不同），識別位點相同，切割位點相同，產生同樣的粘性末端。BamHI：GG↓ATCCBstI：GG↓ATCCMboI：GAT↓CSau3A：GAT↓C同尾酶：來源各異，識別的靶序列不同，但都產生相同的粘性末端。BclI：TG↓ATCABglII：AG↓ATCA四、限制性核酸內切酶與DNA物理圖譜構建(二)、

DNA物理圖譜及構建（限制酶切圖譜、DNA酶切位點圖譜）在研究某一種DNA時，弄清該DNA分子有哪些限制酶切位點是很重要的。建立物理圖譜是進一步分析此DNA的基礎。四、限制性核酸內切酶與DNA物理圖譜構建（一）雙脫氧終止法英國Sanger1955確定牛胰島素結構，1958獲諾貝爾化學獎。1975設計出DNA測序法，1980獲諾貝爾化學獎。合成一段與待測DNA序列互補的DNA片段群。五、

DNA序列分析核酸測序原理PolyacrylamideGelElectrophoresisATC32PAT32PA32PTAGCTACGATCG32PATCGA32PATCGAT32PATCGATC32PATCGATCG32PATCGATCGA32PATCGATCGAT32P凝膠電泳泳可以分開各種不同長度的核酸，在電泳膠片依序排開︰但這樣的圖譜不能判別出各核酸端點的核苷酸種類若能把尾端核苷酸相同的片段提出，跑在同一行，由比較