基因克隆載體

第三章基因克隆載體

(質(zhì)粒載體)載體(P39)概念：攜帶外源DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞，并為其提供復(fù)制和功能基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)的工具。功能1.運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞

2.為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力

3.為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供條件載體在基因工程中的必要性目的外源DNA很難進(jìn)入受體細(xì)胞目的外源DNA一般不帶復(fù)制子系統(tǒng)目的外源DNA一般不具備表達(dá)的調(diào)控系統(tǒng)載體應(yīng)具備的條件（P38）

1.具有針對(duì)受體細(xì)胞的親緣性或親和性（可轉(zhuǎn)移性）2.具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制位點(diǎn)或整合位點(diǎn)3.具有多種單一的酶切位點(diǎn)（多克隆位點(diǎn)）

4.具有合適的選擇性標(biāo)記

自我復(fù)制表達(dá)，外源基因的插入不影響其功能的發(fā)揮，易于從宿主細(xì)胞分離出來(lái)5.分子量盡可能小，以提高其載裝能力

目的基因能否有效導(dǎo)入受體，并在其中高效表達(dá)，很大程度上取決于所用的載體。質(zhì)粒的基本生物學(xué)特征生物細(xì)胞內(nèi)固有的、能獨(dú)立于寄主染色體而自主復(fù)制、并穩(wěn)定遺傳的一類核酸分子常見(jiàn)于原核細(xì)菌和真菌中絕大多數(shù)的是DNA型（除了酵母的殺傷質(zhì)粒（killerplasmid）是一種RNA質(zhì)粒外）絕大多數(shù)具有共價(jià)、封閉、環(huán)狀的分子結(jié)構(gòu)，即cccDNA分子量范圍：1－300kb，多數(shù)在10kb某些藍(lán)藻、真菌和綠藻中也有發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒的存在形式：開(kāi)環(huán)DNA分子(oc-DNA)線性DNA分子(l-DNA)超螺旋DNA分子(scDNA)同一質(zhì)粒盡管分子量相同，不同的構(gòu)型電泳遷移率不同：scDNA最快、lDNA次之、ocDNA最慢。共價(jià)閉合環(huán)狀DNA分子(ccc-DNA)質(zhì)粒DNA的復(fù)制質(zhì)?？截悢?shù)即一個(gè)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒的數(shù)量與染色體數(shù)量之比。每種質(zhì)粒在相應(yīng)的宿主細(xì)胞內(nèi)保持相對(duì)穩(wěn)定的拷貝數(shù)。根據(jù)在每個(gè)細(xì)胞中的分子數(shù)（拷貝數(shù)）多寡，質(zhì)?？煞譃閮纱髲?fù)制類型：嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒：分子量大，低拷貝數(shù)，1－3拷貝松弛型質(zhì)粒：分子量小，高拷貝數(shù)，10－60拷貝P38質(zhì)粒的不相容性（P39）在沒(méi)有選擇壓力的情況下，兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不能在同一宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定的共存。不相容性質(zhì)粒：不能共存于同一細(xì)胞內(nèi)不同質(zhì)粒相容性質(zhì)粒：共存于同一細(xì)胞內(nèi)不同質(zhì)粒質(zhì)粒的不相容性：分子機(jī)制兩種含有不同復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復(fù)制時(shí)各受自己的拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)恒定，因此在經(jīng)過(guò)若干復(fù)制周期和細(xì)胞分裂周期后仍能共處于同一細(xì)胞內(nèi)。任何兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，不能同時(shí)存在于一個(gè)細(xì)胞中，這種現(xiàn)象稱為質(zhì)粒的不相容性，不相容性的質(zhì)粒組成不相容性群。兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復(fù)制時(shí)受到同一種拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的干擾，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)不同，其中拷貝數(shù)多的質(zhì)粒在以后的細(xì)胞分裂周期中更具優(yōu)勢(shì)。一、質(zhì)粒載體質(zhì)?？寺≥d體是以質(zhì)粒DNA分子為基礎(chǔ)構(gòu)建而成的克隆載體。天然質(zhì)粒的缺陷天然存在的野生型質(zhì)粒由于分子量大、拷貝數(shù)低、單一酶切位點(diǎn)少、遺傳標(biāo)記不理想等缺陷，不能滿足克隆載體的要求，因此往往需要以多種野生型質(zhì)粒為基礎(chǔ)進(jìn)行人工構(gòu)建。（1）分子量大，拷貝數(shù)低第一個(gè)用于基因克隆的天然質(zhì)粒pSC101，分子長(zhǎng)9.1kb。但只有一個(gè)EcoRI切點(diǎn)充當(dāng)克隆位點(diǎn)，Tetr作為篩選標(biāo)志。（2）篩選標(biāo)志不理想ColE1質(zhì)粒的篩選標(biāo)志是大腸桿菌素E1（colicinE1）。colicinE1能殺死不含ColE1質(zhì)粒的菌，形成“噬菌斑”。

唯一的克隆位點(diǎn)EcoRI正好位于這個(gè)基因的內(nèi)部。因此可通過(guò)插入失活篩選。但細(xì)菌群體容易自發(fā)突變出抗colicinE1的細(xì)胞…….3.2構(gòu)建質(zhì)?？寺≥d體的基本策略能在受體中進(jìn)行有效的復(fù)制（有復(fù)制起始位點(diǎn)）。含多克隆位點(diǎn)含有供選擇克隆子的標(biāo)記基因，如：常用的標(biāo)記基因：Apr，Kmr，Smr，Tcr基因等DNA分子盡可能小和較高的拷貝數(shù)。根據(jù)特殊需要，組裝各種“元件”，構(gòu)建不同用途的質(zhì)?？寺≥d體。理想的載體應(yīng)該有兩種抗菌素抗性基因。3.3質(zhì)?？寺≥d體的構(gòu)建(P39)選擇合適的出發(fā)質(zhì)粒正確獲得構(gòu)建質(zhì)粒克隆載體的元件組裝合適的選擇標(biāo)記基因選用合適的啟動(dòng)子構(gòu)建過(guò)程力求簡(jiǎn)單出發(fā)質(zhì)粒含有質(zhì)?？寺≥d體必備的元件：復(fù)制起始位點(diǎn)選擇標(biāo)記基因克隆位點(diǎn)啟動(dòng)子和終止子出發(fā)質(zhì)粒（親本質(zhì)粒）親本質(zhì)粒必須含有質(zhì)粒克隆載體必備的元件：復(fù)制起始位點(diǎn)選擇標(biāo)記基因克隆位點(diǎn)啟動(dòng)子和終止子組裝合適的選擇標(biāo)記基因絕大多數(shù)質(zhì)粒載體都是用抗菌素抗性標(biāo)記不帶有抗菌素抗性基因的受體菌不能在含有抗菌素的培養(yǎng)基（選擇培養(yǎng)基）中生長(zhǎng)。當(dāng)帶有抗菌素抗性基因的載體進(jìn)入受體菌后，受體菌才能生長(zhǎng)。

氨芐青霉素抗性（Ampr）卡那霉素抗性（Kanr）四環(huán)素抗性（Tetr）鏈霉素抗性（Strr）氯霉素抗性（Cmlr）合適的啟動(dòng)子真核生物基因在原核生物中表達(dá)，改用原核生物或病毒（噬菌體）基因的啟動(dòng)子。原核生物基因在真核生物中表達(dá)，仍用原核生物基因的啟動(dòng)子。選用外界條件誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。(1)質(zhì)粒克隆載體pBR322pBR322是經(jīng)人工改造的一種較為理想的大腸桿菌質(zhì)粒載體，應(yīng)用廣泛。現(xiàn)在已經(jīng)被許多更優(yōu)良的新型克隆載體所替代。(P40)pBR322質(zhì)粒是按照標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)粒載體命名法則命名的?！皃”表示它是一種質(zhì)粒；“BR”則是分別取自該質(zhì)粒的兩位主要構(gòu)建者F．Bo1ivar和R．L．Rodriguez姓氏的頭一個(gè)字母，“322'’系指實(shí)驗(yàn)室編號(hào)，以與其他質(zhì)粒載體如pBR325，pBR327，pBR328等相區(qū)別。pBR322的結(jié)構(gòu)pBR322的構(gòu)建過(guò)程復(fù)制起始位點(diǎn)：源于ColE1衍生質(zhì)粒pMB1。Apr基因：源于pSF124質(zhì)粒轉(zhuǎn)座子Tn3。Tcr：源于pSC101質(zhì)粒。pBR322的優(yōu)點(diǎn)具有較小的分子量，4363bp，可以克隆10kb以下的外源DNA。含有松弛型質(zhì)粒ColE1的復(fù)制起始位點(diǎn)，可在E.coliHB101和E.coliC600等受體細(xì)胞進(jìn)行高拷貝復(fù)制。具有兩種選擇標(biāo)記基因Ampr和Tetr。插入失活其中有7種限制酶：EcoRV,NheI,BamHI,SphI,SalI,XmaIII和NruI，它們的識(shí)別位點(diǎn)是位于四環(huán)素抗性基因內(nèi)部，另外有2種限制酶：ClaI和HindIII的識(shí)別位點(diǎn)是存在于這個(gè)基因的啟動(dòng)區(qū)內(nèi)，在這9個(gè)限制位點(diǎn)上插入外源DNA都會(huì)導(dǎo)致tetr基因的失活；還有3種限制酶(ScaI、PvuI和PstI)在氨芐青霉素抗性基因（ampr）內(nèi)具有單一的識(shí)別位點(diǎn)，在這個(gè)位點(diǎn)插入外源DNA則會(huì)導(dǎo)致ampr基因的失活。這種因DNA插入而導(dǎo)致基因失活的現(xiàn)象，稱之為插入失活效應(yīng)。當(dāng)外源DNA片斷插入Tcr基因后，導(dǎo)致Tcr基因失活，變成只對(duì)Ap有抗性，即通過(guò)對(duì)抗生素的雙抗或單抗來(lái)篩選是否有外源片斷插入。篩選標(biāo)記－插入失活（2）質(zhì)?？寺≥d體pUC18/19UniversityofCalifornia的J.Messing和J.Vieria于1978年，在pBR322的基礎(chǔ)上改造而成。pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19

(P41)pUC18/19與pBR322的主要差別是用乳糖操縱子的一個(gè)DNA片斷（466bp）替換了pBR322選擇標(biāo)記Tcr基因。此DNA片斷含有乳糖操縱子的啟動(dòng)子、調(diào)節(jié)因子和β－半乳糖苷酶的α-肽基因。pUC18/19的結(jié)構(gòu)復(fù)制起點(diǎn)：來(lái)自pBR322質(zhì)粒。Ampr基因：來(lái)自pBR322質(zhì)粒lacZ的啟動(dòng)子：來(lái)自大腸桿菌lacZ’基因：大腸桿菌lacZ的-肽鏈序列，是LacZ

的氨基端片斷多克隆位點(diǎn)：10個(gè)連續(xù)的單酶切位點(diǎn)，位于lacZ’基因的5’端。pUC18/19的結(jié)構(gòu)pUC18/19質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)①更小的分子量：如pUC18為2682bp，pUC8為2750bp。②選擇方便：Xgal顯色、抗菌素雙重直接選擇。③克隆便利：具有多克隆位點(diǎn)（MCS），使有兩個(gè)不同粘性末端的外源DNA方便地插入。④測(cè)序方便：pUC的MCS與M13噬菌體載體的MCS完全相同，便于把外源DNA轉(zhuǎn)移到M13載體上測(cè)序。選擇原理Ampicillin抗性和lacZ的肽互補(bǔ)（藍(lán)白斑）相結(jié)合。

藍(lán)白斑篩選Xgal（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl--D-galactoside）是-半乳糖苷酶的作用底物-半乳糖苷酶作用于Xgal顯色反應(yīng)-半乳糖苷酶能把無(wú)色的化合物Xgal分解成半乳糖和一個(gè)深藍(lán)色的物質(zhì)5-溴-4-氯靛藍(lán)誘導(dǎo)物：IPTGIPTG是乳糖的類似物。能誘導(dǎo)lac操縱子的啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，使受體菌基因組中的lacZ的C端部分和載體的lacZ’肽都表達(dá)。從而互補(bǔ)。但載體MCS上插入外源DNA后，不能產(chǎn)生肽！lacZ的肽互補(bǔ)-肽（lacZ’基因編碼）：-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片斷（11-41氨基酸）。lacZ只有在4聚體的狀態(tài)下才有功能。pUC質(zhì)粒載體上的lacZ’編碼的肽與這個(gè)缺失突變的-半乳糖苷酶“互補(bǔ)”，使它能形成4聚體，又能分解Xgal，產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)。-互補(bǔ)pUC質(zhì)粒結(jié)構(gòu)中的lacZ’基因所編碼的-肽鏈（編碼β-半乳糖酶基因的氨基末端）可參與-互補(bǔ)作用。這種載體適合于可編碼β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細(xì)胞。雖然質(zhì)粒和宿主編碼的片段各自均無(wú)活性，但它們共處一個(gè)細(xì)胞中時(shí)可融為一體，形成具有酶學(xué)活性的蛋白質(zhì)。這樣，LacZ基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變株與帶有完整近操縱基因區(qū)段的β-半乳糖苷酶陰性的不同突變株之間實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)，這種互補(bǔ)現(xiàn)象叫做-互補(bǔ)。質(zhì)?？寺≥d體引入與lacZ’互補(bǔ)的E.coli，在含IPTG和X－gal的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，菌落呈藍(lán)色。如果在MCS區(qū)插入一個(gè)外源片斷，就會(huì)使lacZ’基因失活，引入lacZ’互補(bǔ)的E.coli，肽不能生成，就無(wú)所謂互補(bǔ)，在含IPTG和X－gal的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中X－gal不會(huì)被降解，菌落呈白色。IPTG誘導(dǎo)的結(jié)果：藍(lán)白斑篩選MCS無(wú)插入時(shí)，互補(bǔ)，藍(lán)菌斑。MCS有插入時(shí)，不互補(bǔ)，白菌斑（教材P94）通過(guò)看培養(yǎng)皿上的菌斑的顏色就能直接知道是否有DNA插入。IPTG誘導(dǎo)的結(jié)果：1、具有更小的分子量和更高的拷貝數(shù)。2、適用于組織化學(xué)方法檢測(cè)重組體。

質(zhì)粒克隆載體引入lacZ’互補(bǔ)的E.coli，在含IPTG和X－gal的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，菌落呈藍(lán)色。如果在MCS區(qū)插入一個(gè)外源片斷，就會(huì)使lacZ’基因失活，引入

lacZ’互補(bǔ)的E.coli，在含IPTG和X－gal的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，菌落呈白色。（3）農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒表達(dá)載體的構(gòu)建(P53)Ti（tumor-inducingplasmid）質(zhì)粒：根癌農(nóng)桿菌含有一種內(nèi)源質(zhì)粒，當(dāng)農(nóng)桿菌同植物接觸時(shí)，Ti質(zhì)粒中有一段DNA，稱為T(mén)-DNA（transfer-DNA），能轉(zhuǎn)移并整合到植物基因組中，并導(dǎo)致冠癭瘤的形成。大小因種類而異，在200－250kb之間。章魚(yú)堿型農(nóng)桿堿型農(nóng)桿菌素型琥珀堿型Ti質(zhì)粒分為4個(gè)功能區(qū)：

T－DNA區(qū)：是根癌農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞時(shí)從Ti質(zhì)粒上切割下來(lái)轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞的一段DNA，含有編碼植物激素和冠癭堿的基因

Vir區(qū)：Vir

區(qū)上的基因能激活T-DNA轉(zhuǎn)移，使根癌農(nóng)桿菌表現(xiàn)出毒性

Con區(qū)：該區(qū)段上存在與細(xì)菌間接合轉(zhuǎn)移的有關(guān)基因，調(diào)控Ti質(zhì)粒在農(nóng)桿菌之間的轉(zhuǎn)移

Ori區(qū)：Ori區(qū)上的基因調(diào)控Ti質(zhì)粒的自我復(fù)制。T－DNA區(qū)Ti質(zhì)粒進(jìn)入植物細(xì)胞的只是一小部分，約25kb。能轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞內(nèi)的DNA片斷稱為T(mén)－DNA（transfer-DNA）T－DNA左右兩端邊界各有一個(gè)25bp長(zhǎng)的正向重復(fù)序列(左邊界，右邊界)，在不同Ti質(zhì)粒中高度保守。

邊界序列對(duì)T－DNA轉(zhuǎn)移和整合不可缺少；已證實(shí)只要保留兩端邊界序列，雖然中間序列不同程度被外源片斷所替換，仍可轉(zhuǎn)移整合到植物基因組中－Ti質(zhì)粒遺傳轉(zhuǎn)化的理論依據(jù)。

T－DNA進(jìn)入植物細(xì)胞后，能以單拷貝或多拷貝形式隨機(jī)整合到染色體DNA上。且T－DNA上的基因能被植物轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)識(shí)別，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。在T－DNA已鑒定出多種基因章魚(yú)堿合成基因（ocs）或胭脂堿合成基因（nos）或其他胭脂堿合成基因。細(xì)胞分裂素合成基因位點(diǎn)Shi和控制植物生長(zhǎng)素合成的基因位點(diǎn)Roi。在兩種基因表達(dá)產(chǎn)物的共同作用下，破壞植物內(nèi)源激素的平衡，干擾植物細(xì)胞的正常分裂，引發(fā)植物產(chǎn)生腫瘤。Vir區(qū)Ti質(zhì)粒T－DNA上游的一組基因，表達(dá)產(chǎn)物可激活T－DNA向植物細(xì)胞轉(zhuǎn)移，引發(fā)腫瘤，顯示致病性。Con區(qū)含有與農(nóng)桿菌之間接合轉(zhuǎn)移有關(guān)的基因，受宿主合成的冠癭堿激活，使Ti質(zhì)粒在細(xì)菌間轉(zhuǎn)移。Ori區(qū)調(diào)控Ti質(zhì)粒的自我復(fù)制乙酰丁香酮/羥基乙酰丁香酮植物根部損傷部位會(huì)分泌出酚類物質(zhì)乙酰丁香酮/羥基乙酰丁香酮，這些酚類物質(zhì)能誘導(dǎo)Ti質(zhì)粒上的vir基因以及根癌農(nóng)桿菌染色體上的一個(gè)操縱子表達(dá)。vir基因產(chǎn)物將Ti質(zhì)粒上的T-DNA單鏈切下，而根癌農(nóng)桿菌染色體上的操縱子表達(dá)產(chǎn)物則與單鏈T-DNA結(jié)合形成復(fù)合物，轉(zhuǎn)化植物根部細(xì)胞。Ti質(zhì)粒介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的過(guò)程①根癌農(nóng)桿菌對(duì)植物細(xì)胞的識(shí)別和附著②根癌農(nóng)桿菌對(duì)植物信號(hào)物質(zhì)的感受③根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒上的vir基因以及染色體上操縱子的活化④vir區(qū)基因被激活，virD基因編碼的核酸內(nèi)切酶分別將T-DNA的RB序列和LB序列切出單鏈切口，釋放出T-DNA的單鏈線性拷貝，T-DNA復(fù)合體的產(chǎn)生⑤T-DNA復(fù)合體在RB序列的引導(dǎo)下定向地穿過(guò)農(nóng)桿菌的細(xì)胞膜、細(xì)胞壁、進(jìn)入植物細(xì)胞壁并整合到植物的染色體基因組中Ti質(zhì)粒介導(dǎo)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞示意圖天然的基因工程研究發(fā)現(xiàn)只有邊界序列對(duì)DNA的轉(zhuǎn)移是必需的，而邊界序列之間的T-DNA并不參與轉(zhuǎn)化過(guò)程，因而可以用外源基因?qū)⑵涮鎿Q。天然的基因工程1、Ti質(zhì)粒是一種天然的質(zhì)粒表達(dá)載體，外源基因組裝在T－DNA上，有可能引入植物細(xì)胞。2、轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞只能分裂，而不能分化成植株，不能達(dá)到選育轉(zhuǎn)基因植物的目的。3、通過(guò)改造T－DNA，構(gòu)建了一系列Ti質(zhì)粒表達(dá)載體。Ti質(zhì)粒本身存在的缺陷轉(zhuǎn)化細(xì)胞在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生植物激素，從而破壞受體激素的平衡，阻礙轉(zhuǎn)化細(xì)胞的再生，因此需將參與合成植物生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的基因剔除冠癭堿合成基因?qū)D(zhuǎn)基因植物意義不大，因此也可刪除Ti質(zhì)粒分子量過(guò)大（200～800kb），小一些利于操作，因此可除去不必要的大片段DNA需加入大腸桿菌復(fù)制起始位點(diǎn)，以利于在大腸桿菌中的操作和保存pCAMBIA1300圖譜潮霉素抗性基因左邊界右邊界復(fù)制起點(diǎn)卡那霉素抗性基因(4)穿梭質(zhì)粒載體人工構(gòu)建的、具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)和選擇標(biāo)記、可以在兩種不同的寄主細(xì)胞中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。

常用的穿梭質(zhì)粒載體大腸桿菌枯草桿菌穿梭載體大