第13章 維生素類藥物的分析

第十三章維生素類藥物的分析概述維生素：是維持人體正常代謝機能所必需的微量營養(yǎng)物資。人體不能合成維生素。如果人體缺少某種維生素，就會引起維生素缺乏癥，而影響人體的正常生理機能。如：人體缺少VA,夜盲癥.

人體缺少VC,壞血病.

VitA、D2、D3、

E、K1

等脂溶性水溶性

VitB族(B1、B2、B6、B12)

VitC、葉酸、煙酸、煙酰胺VitMVitPP對維生素類藥物的分類，目前仍按它們的溶解性質(zhì)分為-H維生素A醇-COCH3維生素A醋酸酯-COC15H31維生素A棕櫚酸酯R:第一節(jié)脂溶性維生素類藥物的分析一、維生素A的分析（一）化學結構與性質(zhì)1、化學結構為一個具有共軛多烯側(cè)鏈的環(huán)己烯（一）結構與性質(zhì)一、具有UV吸收存在多種立體異構化合物維生素A325.5100%新維生素Aa32875%新維生素Ab320.524%新維生素Ac310.515%異維生素Aa32321%異維生素Ab32424%相對生物效價VitA2VitA3易發(fā)生脫氫、脫水、聚合反應鯨醇△或有金屬離子存在時氧化↑共軛多烯側(cè)鏈易被氧化（二）環(huán)氧化物VitA醛VitA酸（三）與三氯化銻發(fā)生呈色反應CHCl3溶解性（四）不溶于水易溶于有機溶劑和植物油等三氯化銻反應（一）條件無水無醇CHCl3鑒別二、藍色紫紅（BP（1998））λmax為326nm一個吸收峰UV法（二）λmax為350～390nm三個吸收峰去水VitA（VitA3）↓VitAUSP顯色劑磷鉬酸規(guī)定斑點顏色和Rf值BP

對照品法顯色劑三氯化銻TLC法（三）含量測定三、紫外分光光度法－三點校正法維生素A的含量測定，過去曾用SbCl3比法。但由于SbCl3比色法呈色極不穩(wěn)定，測定結果受水份、溫度影響較大，反應專屬性差，目前已被紫外分光光度法所替代。但由于SbCl3比色法操作簡便、快速，所以目前對食品或飼料中維生素A的測定仍常用SbCl3比色法。這里我們主要介紹紫外分光光度法。（一）

UV法由于在維生素A的分子中具有共軛多烯的結構，所以具有特征的紫外吸收。這樣，就可以用紫外分光光度法測定維生素A的含量。但是，由于在維生素A中，有很多結構相似的相關物質(zhì)，這些相關物質(zhì)在維生素A的最大吸收波長附近也有吸收（相關物質(zhì)產(chǎn)生的吸收叫不相關吸收），這些吸收對測定有影響。為了消除不相關吸收的影響，準確測出維生素A的含量，Morton和Stubbs等人提出了一個校正公式－三點校正法，用來測定維生素A的含量雜質(zhì)：立體異構體、氧化產(chǎn)物及光照產(chǎn)物、合成中間體、去氫維生素A（VitA2）、去水維生素A（VitA3）三點校正法1.條件：（1）雜質(zhì)的吸收在310~340nm波長范圍內(nèi)呈一條直線，且隨波長的增大吸收度減??；（2）物質(zhì)對光的吸收具有加和性。波長的選擇：三點校正法，即用三個波長點的吸光度對維生素A樣品的吸光度進行校正。所以在測定時，需要選擇三個測定波長。這三個波長的選擇方法是：（1）1

VitA的max（328nm）（2）23

分別在1的兩側(cè)各選一點?。@兩個波長分別在1兩側(cè)十幾個nm處，即（等波長差法）ⅱ．VA在這兩個波長下的吸光度應該等于1下的吸光度的6/7，即A2=A3=6/7A1（等吸光度法）當然，在這三個波長的范圍內(nèi)，雜質(zhì)的吸收應為一條直線測定對象VitA醋酸酯第一法等波長差法第二法等吸收度法(皂化法)測定對象VitA醇測定法（1）基本步驟:第一步A選擇選擇依據(jù)：所選A值中雜質(zhì)的干擾已基本消除注意：

C為混合樣品的濃度第二步求第三步求效價換算因數(shù)由純品計算而得：第四步：求標示量％方法：（2）

第一法維生素A醋酸酯判斷是否在326～329nm之間在326～329nm之間改用第二法是否求算并與規(guī)定值比較

規(guī)定值差值

判斷差值是否超過規(guī)定值的有一個以上超過無超過

計算A328（校正）

用A328計算03%－15%－3%第二法第二法

VitAD膠丸中VitA的含量測定

精密稱取本品(規(guī)格10000VitAIU/丸)裝量差異項下（平均裝量0.08262g/丸）的內(nèi)容物0.2399g至250ml量瓶中，用環(huán)己烷稀釋至刻度，搖勻；精密量取2.0ml，置另一20ml量瓶中，用環(huán)己烷稀釋至刻度，搖勻。以環(huán)己烷為空白，測定最大吸收波長為328nm，并在下列波長處測得吸收度為A300：0.354A316：0.561A328：0.628A340：0.523A360：0.216A300/A328：0.555A316/A328：0.907A328/A328：1.000A340/A328：0.811A360/A328：0.299求本品中維生素A的含量？A300/A328：0.564A316/A328：0.893A328/A328：1.000A340/A328：0.833A360/A328：0.3440.5550.9071.0000.8110.299

+0.01－0.010+0.02+0.04－－－－－=====適用于維生素A醇（等吸收度法）第一法無法消除雜質(zhì)干擾時用此法[皂化法、6/7A法]（3）第二法水溶性脂溶性判斷max是否在323～327nm之間取未皂化樣品采用色譜法純化后再測定計算是否判斷A300/A325是否大于0.73是否取未皂化樣品采用色譜法純化后再測定計算A325(校正)03%－3%三氯化銻比色法（二）優(yōu)點簡便快速λmax618nm～620nm標準曲線法缺點呈色不穩(wěn)定（5~10s內(nèi)）水分干擾與標準曲線溫差≤1℃專屬性差三氯化銻有腐蝕性苯并－二氫吡喃醇三維生素E

名稱R1R2相對活性α-生育酚β-生育酚γ-生育酚δ-生育酚CH3CH3HHCH3HCH3H1.00.50.20.1***生物效價右旋體：消旋體=1.4：10（天然品）（合成品）dl－α－生育酚醋酸酯結構與性質(zhì)一、苯環(huán)+二氫吡喃環(huán)+飽和烴鏈1、易溶于有機溶劑，不溶于水2、UV3、酯鍵易水解△75℃15′（一）硝酸反應橙紅色鑒別二、（橙紅色）生育紅生育酚HNO3強氧化劑取本品約30mg，加無水乙醇10ml溶解后，加硝酸2ml，搖勻，在75℃加熱15分鐘，溶液應顯橙紅色。三氯化鐵－聯(lián)吡啶反應△[O]（二）生育酚對-生育醌[O]弱氧化劑紅色=41.0～45.5λmax=284nmλmin=254nm0.01%無水乙醇中UV法（三）維生素EUV圖薄層板硅膠G展開劑環(huán)己烷-乙醚（4：1）顯色劑硫酸（105℃5′）VitE

Rf

=0.7TLC法（四）游離生育酚硫酸鈰滴定液（0.01mol/L）二苯胺（亮黃→灰紫）利用游離生育酚的還原性，將硫酸鈰還原成硫酸亞鈰檢查

三、原理（一）試劑（二）（M生育酚=430.8）例取本品0.10g，加無水乙醇5ml溶解后，加二苯胺試液1滴，用硫酸鈰液（0.01mol/L）滴定，消耗硫酸鈰液（0.01mol/L）不得過1.0ml?！?.15％限量（三）藥典規(guī)定消耗硫酸鈰液（0.01mol/L）≤1.0ml設：應消耗硫酸鈰液≤Vml 0.01×1.0＝實際濃度×V若硫酸鈰液濃度不是0.01000mol/L，應重新計算硫酸鈰的消耗量例

Ce(SO4)2=0.01020mol/L四、含量測定GC法（一）GC特點1、選擇性好靈敏度高速度快分離效能好揮發(fā)性低、不穩(wěn)定、極性強→衍生化易受樣品蒸氣壓限制載氣→N2固定液→硅酮（OV-17）擔體→硅藻土或高分子多孔小球柱溫→265℃檢測器→氫火焰離子化檢測器(FID)內(nèi)標→正三十二烷

n≥500R≥2VitE測定的色譜條件2、內(nèi)標法加校正因子內(nèi)標法供試液（樣品+內(nèi)標）內(nèi)標物對照液（對照+內(nèi)標）是樣品中不存在的物質(zhì)與被測組分峰靠近能與各組分完全分離與被測組分的量接近校正因子：實際工作中的計算方法例內(nèi)標液

取正三十二烷加正己烷溶解并稀釋成1.0mg/ml溶液對照液

精密稱取VitE對照品0.2011g

置棕色具塞錐形瓶中，精密加入內(nèi)標液10ml，密塞，振搖使溶解，取

1~3ul注入GC儀，測定，計算供試液

精密稱取供試品0.1998g置棕色具塞錐形瓶中，精密加入內(nèi)標液

10ml，密塞，振搖使溶解，取1~3ul

注入GC儀，測定，計算對照液供試液0.3730.368本品含C31H52O3應為96.0~102.0%BPGC

內(nèi)標正三十二烷

R≥1.4USPGC

內(nèi)標十六酸十六醇酯

R≥1.0JPHPLC

外標dl－α－生育酚

R≥1.4利用生育酚的易氧化性還原型氧化型二苯胺（亮黃→灰紫）△原理1、鈰量法（二）指示劑2、防止Ce(SO4)2的水解減慢生育酚被O2氧化速度C、酸性條件Ce(SO4)2易溶于水生育酚易溶于醇B、溶劑分子量較大，反應慢易被O2氧化A、反應速度H2SO4討論3、含量計算4、MVitE

=472樣品→dl－α－生育酚固定相→十八烷基硅烷鍵合硅膠流動相→甲醇-水（49：1）檢測波長→292nmR＞2.6RSD≤0.8%JP-RP-HPLC法（外標法）（三）測定對象→血清中VitA和VitE固定相→十八烷基硅烷鍵合硅膠流動相→甲醇-水（96：4）檢測波長→8′前330nm8′后292nmRP-HPLC法（外標法）（四）氨基嘧啶環(huán)－CH2－噻唑環(huán)(季銨堿)第二節(jié)水溶性維生素類藥物的分析HClCl-一、維生素B1（一）溶解性1、易溶于水2、水溶液呈酸性（二）UV共軛雙鍵λmax=246nm結構與性質(zhì)一、嘧啶環(huán)——伯氨噻唑環(huán)——季銨1、可與酸成鹽2、與生物堿↓→↓3、含量測定——非水堿量法（三）硫色素反應（四）堿性ChP鑒別試驗二、（一）硫色素反應硫色素＋2HVitB1H+H+H+H+（二）沉淀反應S元素反應Cl-反應（三）其他反應三、含量測定喹那啶紅－亞甲藍（紫紅→天藍）（一）非水溶液滴定法UV法（二）片劑、注射劑=421（每片）相當于標示量的%=A=ECL規(guī)格g/片g/100mlgChP（每ml）相當于標示量的%=規(guī)格g/mlml準確度高靈敏度低操作繁瑣設備簡單（三）硅鎢酸重量法重量法特點1、原理2、2×337.273479.22

取本品約50mg，精密稱定，加水50ml溶解后，加鹽酸2ml，煮沸，立即滴加硅鎢酸試液4ml，繼續(xù)煮沸2分鐘，用80℃恒重的垂熔玻璃坩堝濾過，沉淀先用煮沸的鹽酸溶液（1→20）20ml分次洗滌，再用水10ml洗滌1次，最后用丙酮洗滌2次，每次5ml，在80℃干燥至恒重，精密稱定，所得重量與0.1939相乘，即得測定方法3、例

精密稱取本品0.0519g，加水50ml溶解，加鹽酸2ml煮沸，立即滴加硅鎢酸試液4ml，繼續(xù)煮沸2分鐘，用80℃恒重的垂熔玻璃坩堝濾過，沉淀先用煮沸的鹽酸溶液（1→20）20ml分次洗滌，再用水10ml洗滌1次，后用丙酮洗滌2次，每次5ml。在80℃干燥至恒重，稱得沉淀重量為0.2557g。求本品的含量按干燥品計算為多少？(本品干燥失重項下測定結果為3.73%)A.取樣量±50mg提高靈敏度B.80℃

保持4個H2OC.HCl

增大沉淀顆粒D.硅鎢酸：VitB1=8：1

使沉淀完全E.硅鎢酸邊攪拌邊緩慢加入增大沉淀顆粒實驗條件4、NaOH（四）硫色素熒光法原理1、激發(fā)波長365nm發(fā)射波長435nm方法與計算2、+NaOH+鐵氰化鉀+異丁醇+NaOH+異丁醇+NaOH+鐵氰化鉀+異丁醇+NaOH+異丁醇SdAb對照液供試液特點3、（1）靈敏度高，線性范圍寬（2）代謝產(chǎn)物不干擾，適用于體液分析二維生素CL－抗壞血酸1、易溶于水2、水溶液呈酸性結構與性質(zhì)一、（一）溶解性二烯醇結構二酮基結構二烯醇結構（二）強還原性有活性有活性無活性△糖類的顯色反應50℃結構與糖類相似（三）具糖的性質(zhì)C3－OH的pKa=4.17C2－OH的pKa=11.57酸性（四）一元酸L(+)－抗壞血酸活性最強手性C（C4、C5）（五）光學活性**與堿反應（六）水解反應（七）UV特征與氧化劑的反應（一）鑒別試驗二、1、與AgNO3反應2、與2，6-二氯靛酚反應(ChP2000)氧化型玫瑰紅色還原型藍色OHˉ(ChP2000)（玫瑰色）（無色）3、與堿性酒石酸銅反應USP4、與KMnO4反應糖類的反應（二）或鹽酸50℃吡咯USP（藍色）(糠醛)（戊糖）50℃(吡咯)UV（三）BP0.01mol/LHCl指示劑淀粉指示液原理1、碘量法（一）含量測定三、H+取本品約0.2g，精密稱定，加新沸過的冷水100ml與稀醋酸10ml使溶解，加淀粉指示液1ml，立即用碘滴定液（0.1mol/L）滴定，至溶液顯藍色，在30秒內(nèi)不褪。每1ml碘滴定液(0.1mol/L)相當于8.806mg的C6H8O6方法2、（1）酸性環(huán)境d.HCl

（2）新沸冷H2O減慢VitC被O2氧化速度討論4、（3）立即滴定趕走水中O2減少O2的干擾（4）附加劑干擾的排除片劑——滑石粉——過濾注射劑——抗氧劑——丙酮甲醛Na2SO3NaHSO3

Na2S2O3Na2S2O5CHHOOaS3aSO+H2NHON2252HONHCOS3a2，6-二氯靛酚鈉滴定法法（二）USPJP原理1、自身指示終點法方法2、（2）快速滴定

2min內(nèi)

（1）酸性環(huán)境HPO3-HAc

穩(wěn)定VitC防止其他還原性物質(zhì)干擾（3）剩余比色測定

（定量過量）（測剩余染料）討論3、（4）缺點

需經(jīng)常標定貯存≤一周不穩(wěn)定干擾多氧化力較強HPLC法（三）1、HPLC的優(yōu)點靈敏度高選擇性高分離分析同步微量分析干擾少

快速2、HPLC法分離VitC常用方法及測定對象

對象制劑、生物樣品、果汁方法離子交換色譜法離子對色譜法分配色譜法（正、反相）血、尿、組織、細胞等例多種維生素片中VitA、VitB1、VitB2

、VitB6

、煙酰胺、VitC、VitE的含量測定色譜柱

ODS流動相

A、水-甲醇（4：1）

B、甲醇

（梯度洗脫）抗氧劑

二巰基丙烷磺酸鈉水溶性維生素

離子對色譜法（樟腦磺酸）內(nèi)標法+校正因子內(nèi)標物——苯酚脂溶性維生素

外標法108．在三氯醋酸或鹽酸存在下，經(jīng)水解、脫羧、失水后，加入吡咯即產(chǎn)生藍色產(chǎn)物的藥物應是

A.氯氮卓

B.維生素AC.普魯卡因

D.鹽酸嗎啡

E.維生素C99：88．中國藥典（2000年版）采用以下何法測定維生素E含量

A.酸堿滴定法

B.氧化還原法

C.紫外分光光度法

D.氣相色譜法

E.非水滴定法98：79．中國藥典（2000年版）采用氣相色譜法測定維生素E含量，內(nèi)標物質(zhì)為

A.正二十二烷

B.正二十六烷

C.正三十烷

D.正三十二烷

E.正三十六烷99：77.下列藥物的堿性溶液，加入鐵氰化鉀后，再加正丁醇，顯藍色熒光的是

A.維生素AB.維生素B1

C.維生素CD.維生素DE.維生素E97：77．既具有酸性又具有還原性的藥物是

A.維生素AB.咖啡因

C.苯巴比妥

D.氯丙嗪

E.維生素C99m：132.維生素C的鑒別反應，常采用的試劑有

A.堿性酒石酸銅

B.硝酸銀

C.碘化鉍鉀

D.乙酰丙酮

E.三氯醋酸和吡咯99m：84.測定維生素C注射液的含量時，在操作過程中要加入丙酮，這是為了

A.保持維生素C的穩(wěn)定

B.增加維生素C的溶解度

C.使反應完全

D.加快反應速度

E.消除注射液中抗氧劑的干擾98：85.能發(fā)生硫色素特征反應的藥物

是

A.維生素AB.維生素B1

C.維生素CD.維生素EE.煙酸97：81．使用碘量法測定維生素C的含量,已知維生素C的分子量為176.13，每1ml碘滴定液

(0.1mol/L)相當于維生素C

的量為

A.17.61mgB.8.806mgC.176.1mgD.88.06mgE.1.761mg97：[121—125]（99：[121—125]）

可發(fā)生以下反應或現(xiàn)象的藥物為

A.維生素B1B.維生素CC.兩者均能D.兩者均不能

121.與碘化汞鉀生成黃色沉淀

122.麥芽酚反應

123.在乙醚中不溶

124.與2,6-二氯靛酚反應使顏色消失

125.硫色素反應ADCBA115．維生素A的鑒別試驗為

A.三氯化鐵反應

B.硫酸銻反應

C.2,6-二氯靛酚反應

D.三氯化銻反應

E.間二硝基苯的堿性乙醇液反

應77．中國藥典（2000年版）規(guī)定維生素A的測定采用紫外分光光度法（三點校正法），此法又分為

A．等波長差法

B．等吸收度法

C．6/7A法

D．差示分光法

E．雙波長法78．維生素E的鑒別試驗有

A．硫色素反應

B．硝酸氧化呈色反應

C．硫酸-乙醇呈色反應

D．堿性水解后加三氯化鐵乙醇液與2,2-聯(lián)吡啶乙醇液呈色反應

E．Marquis反應80.下面哪些描述適用于維生素AA.分子具有長二烯醇側(cè)鏈，易被氧化

B.具有較長的全反式共軛多烯結構

C.含酯鍵，經(jīng)水解后產(chǎn)生苯并二氫吡喃衍生物，易被氧化

D.與三氯化銻的無醇氯仿液中呈不穩(wěn)定蘭色，很快轉(zhuǎn)變?yōu)樽霞t色

E.樣品用無水乙醇溶解后，加硝酸加熱后，呈橙紅色

維生素A與

反應即顯藍色，漸變成紫紅色；反應需在

條件下進行。（）維生素A分子中由于具有共軛多烯側(cè)鏈，因而其性質(zhì)很穩(wěn)定，不易被氧化變質(zhì)。三氯化銻無水×

維生素E在酸性或堿性溶液中加熱可水解生成游離

，當有氧或其他氧化劑存在時，則進一步被氧化成醌型化合物，尤其在堿性下更易發(fā)生。生育酚

維生素B1的噻唑環(huán)在

介質(zhì)中可開環(huán)，再與嘧啶環(huán)上氨基縮合環(huán)合，然