腐爛蘋果中的細(xì)菌分離以及理化性質(zhì)的檢測

腐爛蘋果中的細(xì)菌分離以及理化性質(zhì)的檢測摘要：從腐爛蘋果中取樣培養(yǎng)細(xì)菌，用平板直線劃線法分離純化細(xì)菌，經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后進(jìn)行鏡檢和革蘭氏染色實(shí)驗(yàn)，最后對分離出的純種細(xì)菌進(jìn)行理化性質(zhì)檢測：細(xì)菌水解淀粉實(shí)驗(yàn)以及探究pH對細(xì)菌生長的影響實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，腐爛蘋果中的細(xì)菌形狀小而圓，是革蘭氏陽性菌；水解淀粉實(shí)驗(yàn)說明該細(xì)菌中沒有水解淀粉的酶；分光光度法所得的數(shù)據(jù)顯示該細(xì)菌的生長環(huán)境偏中堿性。關(guān)鍵詞：腐爛蘋果、細(xì)菌、平板直線劃線法、革蘭氏染色、水解淀粉、分光光度法StudytheBacteriaofRottenApplesintheSeparationandPhysical&ChemicalPropertiesLinjia-wan(Collegeoflifescience,SouthChinaNormalUniversity,Guangzhou510631,China)Abstract:Sampletrainingbacteriafromtherottenapples,andpurifybacteriawithflatlinearcrossedmethod;Afterexpandingthebacteria,theyaretestedbyMicroscopicexaminationandGramstaining,andfinally,testphysicalandchemicalpropertiesoftheisolatedpurebacteriawithBacteriahydrolysisstarchexperimentandexploringthepHofthegrowthofthebacteriainfluenceexperiment.Theexperimentalresultsshowthatthebacteriainrottenapplesaresmall,roundinshape,andaregram-positive;Theexperimentofthebacteriahydrolysisstarchindicatedthatthosebacteriadon’thaveenzymethatcanhydrolyzeamylum;Spectrophotometryincomedatasshowedthatthosebacterialiketogrowintheenvironmentofalkalineslant.Keywords:rottenapples;bacteria;Flatlinearcrossedmethod;Gramfaerbung;hydrolyzeamylum;Spectrophotometry引言：現(xiàn)今，市場的水果攤位仍會(huì)出售腐爛的水果，而有些人不清楚腐爛水果會(huì)滋生很多細(xì)菌，即使把腐爛的部分挖去，細(xì)菌也會(huì)蔓延到其它部分。例如蘋果只要爛了一個(gè)小洞，其3厘米厚的果肉都已相應(yīng)變質(zhì)。食用后，輕則容易引起腸道不適、腹瀉嘔吐等，重則會(huì)患上痢疾或腸胃炎，甚至可能造成脫水休克。因此，檢測腐爛水果中腐爛果肉以及完好果肉的細(xì)菌性質(zhì)的實(shí)驗(yàn)具有重要意義。1材料與方法1.1材料以及試劑腐爛蘋果2個(gè)、牛肉膏、蛋白胨、無菌水、結(jié)晶紫、碘液、95%乙醇、番紅、NaCl、可溶性淀粉、瓊脂、盧戈氏碘液、1mol/LHCL以及1mol/LNaCl(用于調(diào)節(jié)pH)1.2實(shí)驗(yàn)用具接種鏟、接種環(huán)、超凈工作臺(tái)、平板培養(yǎng)皿、試管、酒精燈、酒精棉球、硅膠塞、顯微鏡、擦鏡紙、載玻片、蓋玻片、吸水紙、小滴管、牛皮紙、報(bào)紙、火柴、吹風(fēng)筒、三角瓶、pH計(jì)、分光光度計(jì)、恒溫?fù)u床、手提式滅菌鍋、移液槍、托盤天平1.3實(shí)驗(yàn)方法平板直線劃線法、鏡檢法、革蘭氏染色法、分光光度法2染色以及理化性質(zhì)實(shí)驗(yàn)原理2.1細(xì)菌的革蘭氏染色實(shí)驗(yàn)原理先將細(xì)菌標(biāo)本用結(jié)晶紫染色，再加媒染劑碘液（增加染料和細(xì)菌細(xì)胞的親和力），使它和結(jié)晶紫在菌體細(xì)胞中形成分子量較大的紫碘復(fù)合物，然后用酒精進(jìn)行脫色，最后用復(fù)染劑復(fù)紅染色。假使細(xì)菌細(xì)胞不被脫色而保留初染紫顏色者，稱為革蘭氏陽性菌；若被脫色，而染上復(fù)染劑的紅顏色者，稱為革蘭氏陰性菌。通過結(jié)晶紫初染和碘液媒染后，在細(xì)胞壁內(nèi)形成了不溶于水的結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物，革蘭氏陽性菌由于其細(xì)胞壁較厚、肽聚糖網(wǎng)層次較多且交聯(lián)致密，故遇乙醇脫色處理時(shí)，因失水反而使網(wǎng)孔縮小，再加上它不含類脂，故乙醇處理不會(huì)出現(xiàn)縫隙，因此能把結(jié)晶紫與碘復(fù)合物牢牢留在壁內(nèi)，使其仍呈紫色；而革蘭氏陰性菌因其細(xì)胞壁薄、外膜層類脂含量高、肽聚糖層薄且交聯(lián)度差，在遇脫色劑后，以類脂為主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖網(wǎng)不能阻擋結(jié)晶紫與碘復(fù)合物的溶出，因此通過乙醇脫色后仍呈無色，再經(jīng)復(fù)紅復(fù)染，就使革蘭氏陰性菌呈紅色。2.2細(xì)菌水解淀粉實(shí)驗(yàn)原理某些細(xì)菌可以產(chǎn)生水解淀粉的淀粉酶，它能把淀粉水解為糊精、麥芽糖、葡萄糖，再被細(xì)菌所利用。淀粉水解后，遇碘不再變藍(lán)色、產(chǎn)生透明圈。菌體培養(yǎng)后，平板上加上盧戈氏碘液，在淀粉發(fā)生水解的地方，淀粉-碘復(fù)合物的藍(lán)色特征就會(huì)消失。淀粉的水解發(fā)生在離開菌落的一段距離，這是因?yàn)楫a(chǎn)生的胞外淀粉酶滲入到周圍的培養(yǎng)基中所致。若無透明圈，表明該細(xì)菌無淀粉酶。2.3pH影響細(xì)菌生長實(shí)驗(yàn)的原理不同微生物對pH條件的要求各不相同，它們只能在一定的pH范圍內(nèi)生長，可分為生長最低pH，生長最適pH，生長最高pH。細(xì)菌一般在pH4-9范圍內(nèi)生長，生長最適pH一般為6.5-7.5；在實(shí)驗(yàn)條件下，人們常將培養(yǎng)基pH調(diào)至接近中性，而微生物在生長過程中常由于糖的酵解產(chǎn)酸或蛋白質(zhì)降解產(chǎn)堿而使環(huán)境的pH發(fā)生變化，從而影響微生物的生長。3實(shí)驗(yàn)步驟3.1配制培養(yǎng)基3.1.1配制牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基按比例稱取牛肉膏、蛋白胨、NaCl、瓊脂，將以上藥品溶解于水中，待藥品完全溶解后再補(bǔ)充水分至500ml。用pH試紙檢測培養(yǎng)基的pH，直至達(dá)到pH7-7.6，將配制好的培養(yǎng)基分裝于三角瓶中，放在滅菌鍋中121℃滅菌30分鐘。將滅菌的培養(yǎng)基倒平板和倒斜面，做好標(biāo)記放在冰箱中保存。配制牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基按比例稱取牛肉膏、蛋白胨、NaCl，將以上三樣藥品溶解于水中，待藥品完全溶解后再補(bǔ)充水分至150ml。用pH試紙檢測培養(yǎng)基的pH，直至達(dá)到pH7-7.6，把其中的100ml的培養(yǎng)基倒入5個(gè)三角瓶,調(diào)節(jié)pH分別為3,5,7,9,11，用作細(xì)菌懸液，把剩下的培養(yǎng)基分別裝在5支試管中（用于pH對細(xì)菌生長影響實(shí)驗(yàn)的空白對照），調(diào)節(jié)pH分別為3,5,7,9,11,做好標(biāo)記封口，放進(jìn)高壓滅菌鍋121滅菌30min，待用。3．1.3配制淀粉培養(yǎng)基稱取牛肉膏，蛋白胨，NaCl，可溶性淀粉，瓊脂，并溶解在沸水中，倒入三角瓶，封口，放進(jìn)高壓滅菌鍋112℃滅菌30min。滅菌后在無菌條件倒平板，待用。3.2取樣培養(yǎng)在超凈工作臺(tái)上用酒精擦拭腐爛蘋果的表皮，然后用接種鏟挖取腐爛果肉以及完好的果肉，分別接種于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，做好標(biāo)簽標(biāo)記，放在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。3.3分離純化上述細(xì)菌經(jīng)24小時(shí)后長出細(xì)菌，在超凈工作臺(tái)上用接種環(huán)挑取該細(xì)菌，然后用平板直線劃線法在牛肉膏蛋白胨劃線，進(jìn)行分離純化，做好標(biāo)記并放在37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí)。劃線分離純化后得到純種單個(gè)細(xì)菌菌落。3.4鏡檢在載玻片上滴一滴無菌水，用無菌操作方法從培養(yǎng)皿單菌落中挑取少量菌體與水滴充分混勻，涂成薄膜；將涂片用吹風(fēng)筒吹干；將載片通過微火2-3次固定；將涂片置于水平位置，滴加染液覆蓋于涂菌處，染色2分鐘；用自來水的細(xì)水流由載片上端流下，沖去染液；干燥水分之后用低倍鏡和高倍鏡觀察細(xì)菌的形態(tài)和大小，確定該菌落是否是單菌落。3.5保種把分離純化得到的單個(gè)菌落接在斜面培養(yǎng)基上，放在冰箱存放待用。3.6革蘭氏染色用無菌操作方法從試管斜面中沾取菌液1環(huán)，用接種環(huán)在潔凈的載玻片上涂一薄而均勻的菌膜，涂菌后將接種環(huán)在火焰上滅菌；用吹風(fēng)筒吹干；將細(xì)菌涂片膜向上，通過火焰3次來固定細(xì)菌于玻片上；用結(jié)晶紫初染涂片1分鐘；水洗稍干之后，加入碘液媒染1分鐘；水洗稍干之后，用95%乙醇脫色5-20秒；水洗稍干之后，用復(fù)紅復(fù)染1分鐘。3.7細(xì)菌水解淀粉酶實(shí)驗(yàn)在超凈工作臺(tái)上，以無菌操作技術(shù)，把菌種接種在淀粉培養(yǎng)基上，可劃成“+”字形，培養(yǎng)基的一邊接一個(gè)種。在培養(yǎng)基底部做好記號，蓋上蓋，倒置于37℃下培養(yǎng)24小時(shí)；將平皿蓋打開，滴入適量盧戈氏碘液于接種處，輕輕旋轉(zhuǎn)平板，使碘液均勻鋪滿平板。3.8pH對細(xì)菌生長的影響實(shí)驗(yàn)在超凈工作臺(tái)內(nèi)，將純種菌接到之前做好的裝有牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的三角瓶里，將已接種的5個(gè)三角瓶置于37℃、200r/min震蕩培養(yǎng)48小時(shí)；將上述三角瓶取出，在分光光度計(jì)（600nm）上分別測定培養(yǎng)物的OD值，記錄好結(jié)果。4實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1腐爛蘋果中的腐爛果肉以及完好果肉都含有細(xì)菌、霉菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，腐爛果肉一定含有細(xì)菌和真菌，而完好果肉中可能有細(xì)菌和真菌。果肉培養(yǎng)1天后，長出細(xì)菌，3-5天之后長出了白色霉菌，細(xì)菌2-3天之后死亡。圖一左為腐爛蘋果A中的腐爛果肉，右為腐爛蘋果A中的完好果肉圖一說明該腐爛蘋果的腐爛部分含有細(xì)菌，而該完好部分不含細(xì)菌。圖二左為腐爛蘋果B中的完好果肉，右為腐爛蘋果B中的腐爛果肉圖二表明該腐爛蘋果完好部分的細(xì)菌瘋狂地長滿整個(gè)培養(yǎng)基，說明完好的果肉也有細(xì)菌，腐爛果肉反而不長細(xì)菌。圖三腐爛蘋果B中的腐爛果肉圖三顯示雖然腐爛蘋果B中的腐爛果肉不長細(xì)菌，但3-4天之后，長出了白色的霉菌。4.2細(xì)菌的單個(gè)菌落特征以及革蘭氏染色特征圖四平板直線劃線分離單菌落圖四劃線材料是腐爛蘋果A腐爛果肉中的細(xì)菌，肉眼可見分離純化出了單個(gè)菌落。分離純化得到的單個(gè)菌落濕潤，正反面顏色一致，呈白色，菌落小而微隆起，菌落與配養(yǎng)基結(jié)合不緊密，有臭味。圖五細(xì)菌的革蘭氏染色圖五顯示，通過革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察該細(xì)菌呈紫色，是革蘭氏陽性菌，細(xì)胞小而圓。圖六保存單個(gè)菌落于試管中4.3細(xì)菌無水解淀粉的酶圖七細(xì)菌水解淀粉實(shí)驗(yàn)圖圖七在細(xì)菌水解淀粉的測定中，滴加盧戈氏碘液的后觀察到菌苔周圍沒有出現(xiàn)透明圈，表明該細(xì)菌不含水解淀粉的酶。4.4不同pH對細(xì)菌的影響不同經(jīng)分光光度法的測定，得到不同pH下液體培養(yǎng)基的OD值不同，列表如下：pH值357911OD600表一細(xì)菌不同pH的OD600圖八細(xì)菌不同pH的生長曲線5分析與討論5.1腐爛蘋果中的腐爛果肉以及完好果肉都含有細(xì)菌、霉菌綜合腐爛蘋果A和B的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象得：完好果肉也含有細(xì)菌。只要水果發(fā)生霉變腐爛，各種微生物特別是各種真菌都會(huì)在腐爛水果中不斷加快繁殖，并在繁殖過程中產(chǎn)生大量有毒物質(zhì)。這些有毒物質(zhì)又不斷從腐爛部分，通過水果汁液向未腐爛部分滲透、擴(kuò)散，導(dǎo)致未腐爛部分同樣含有微生物的代謝物。腐爛蘋果B的腐爛部分不長細(xì)菌的原因可能是在用酒精擦拭蘋果表面時(shí)把細(xì)菌殺死，但2-3天后長出了霉菌，表示酒精沒有殺死霉菌。無論是腐爛果肉還是完好的果肉都有細(xì)菌、真菌，所以，腐爛的水果不能吃。5.2平板直線劃線法不能分離出單菌落原因：在劃線前，培養(yǎng)基放在冰箱中冷藏，劃線后，在室溫下的培養(yǎng)基的蓋皿液化形成許多小水珠，水珠掉落到劃線處，造成劃線失敗。解決方法：重新配培養(yǎng)基，倒平板冷卻后不放冰箱冷藏，直接劃線接種。5.3分離出的細(xì)菌是革蘭氏陽性菌鏡檢和革蘭氏染色的圖片看不清單個(gè)細(xì)菌。原因一是挑取鏡檢的細(xì)菌較多，二是該細(xì)菌非常小。該細(xì)菌有臭味這一特性，跟腐爛的水果有臭味是相吻合。分理出的細(xì)菌是革蘭氏陽性菌，陽性菌的磷壁酸抗原性很強(qiáng)，是該菌的重要表面抗原；某些革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁表面還有一些特殊的表面蛋白，如a蛋白等。所以吃腐爛水果對人體有害。5.4不同