流式細(xì)胞儀的原理與應(yīng)用

流式細(xì)胞術(shù)原理和應(yīng)用■姓名：白小燕■專業(yè)：微生物學(xué)一

簡介二構(gòu)造及工作原理三FCM的數(shù)據(jù)分析FCM的應(yīng)用一簡介

流式細(xì)胞儀(FlowCytometer):是集激光技術(shù)、電子物理技術(shù)、光電測量技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)、細(xì)胞熒光化學(xué)技術(shù)以及單克隆抗體技術(shù)為一體的高科技細(xì)胞分析儀。流式細(xì)胞術(shù)(FlowCytometry，F(xiàn)CM):利用流式細(xì)胞儀對處于快速直線流動狀態(tài)中的細(xì)胞或亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行多參數(shù)、快速的定量分析和分選的技術(shù)。流式細(xì)胞儀的特點(diǎn)單個細(xì)胞或微粒分析同時多參數(shù)分析速度快：10000個細(xì)胞(微粒)/秒統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：提供細(xì)胞群體的均值和分布情況分選感興趣的細(xì)胞或微粒流路(液流系統(tǒng)）流動室 鞘液SHEATH樣本流SAMPLE單細(xì)胞懸液5*105~1*106個/ml光路（光學(xué)系統(tǒng)）光源濾片電路（檢測系統(tǒng)）光電倍增管PMT放大電路HV及GAIN增益A/D轉(zhuǎn)換統(tǒng)計(jì)（分析系統(tǒng)）計(jì)算機(jī)二構(gòu)造及工作原理

流動室是儀器核心部件，被測樣品在此與激光相交。流動室由石英玻璃鋼制成，并在石英玻璃中央開一個孔徑為430μm×180μm的長方形孔，供細(xì)胞單個流過，檢測區(qū)在該孔的中心，這種流動室的光學(xué)特性良好，流速較慢，因而細(xì)胞受照時間長，可收集的細(xì)胞信號光通量大，配上廣角收集透鏡，可獲得很高的檢測靈敏度和測量精度。液流系統(tǒng)流動室InjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid液流系統(tǒng)激光光源：目前臺式機(jī)FCM，大多采用氬離子氣體激光器。激光(laser)是—種相干光源，它能提供單波長、高強(qiáng)度及穩(wěn)定性高的光照，是細(xì)胞微弱熒光快速分析的理想光源。由于細(xì)胞快速流動，每個細(xì)胞經(jīng)過光照區(qū)的時間僅為1μs左右，每個細(xì)胞所攜帶熒光物質(zhì)被激發(fā)出的熒光信號強(qiáng)弱，與被照射的時間和激發(fā)光的強(qiáng)度有關(guān)，因此細(xì)胞需要足夠的光照強(qiáng)度。

光學(xué)系統(tǒng)信號散射光信號

FS細(xì)胞大小

SS細(xì)胞顆粒性熒光信號

FL1–FITC

FL2–PE

FL3–ECD

FL4–PC5光學(xué)系統(tǒng)散射光信號——

細(xì)胞大小及顆粒性FSSS光學(xué)系統(tǒng)光路（濾片特性）光學(xué)系統(tǒng)電路電壓調(diào)節(jié)光電倍增管電壓volts增益Gain信號放大方式檢測系統(tǒng)電信號輸入到放大器放大，放大器分兩類：線性放大和對數(shù)放大。細(xì)胞DNA含量、RNA含量等的測量一般選用線性放大測量。在細(xì)胞膜表面抗原等的檢測時，細(xì)胞膜表面抗原的分布有時要相差幾十倍，甚至幾萬倍，通常使用對數(shù)放大器。

檢測系統(tǒng)常用熒光染料介紹FITC：綠色525nmPE：橙黃色575nmECD：橙紅色610nmPE－CY5：深紅色675nmPerCP：深紅色675nmPE－CY7：深紅色755nm7AAD：深紅色675nmPI(碘化丙啶）：橙紅色620nm 488nm波長的氬離子激光激發(fā)三FCM的數(shù)據(jù)分析單參數(shù)一維直方圖縱坐標(biāo)表示細(xì)胞數(shù)，橫坐標(biāo)表示相對熒光信號或散色光信號值，單位是道數(shù)。2.雙參數(shù)二維點(diǎn)圖顯示來自同一細(xì)胞的兩個參數(shù)與細(xì)胞數(shù)量間的關(guān)系。橫、縱坐標(biāo)分別表示兩個參數(shù)的相對含量。通過分別計(jì)算兩坐標(biāo)所表示參數(shù)的陽性率來得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果。白血病免疫分型HLA-B27:強(qiáng)直性脊柱炎淋巴細(xì)胞亞群造血干細(xì)胞計(jì)數(shù)：造血干細(xì)胞移植網(wǎng)織紅細(xì)胞PNH診斷（CD55、CD59）血小板活化試驗(yàn)1流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用四FCM的應(yīng)用細(xì)胞大小細(xì)胞的顆粒度細(xì)胞表面分子：CD系列細(xì)胞漿內(nèi)分子：胞內(nèi)細(xì)胞因子細(xì)胞核內(nèi)分子：P53細(xì)胞功能檢測：細(xì)胞周期、凋亡2流式細(xì)胞術(shù)的科研應(yīng)用概念：白細(xì)胞分化抗原(DC)CD(clusterofdifferentiation)指的是分化群或分化簇。在使用CD命名細(xì)胞膜表面免疫標(biāo)志的初期，他專職白細(xì)胞膜上的抗原或抗原識別的抗體，故又稱白細(xì)胞分化抗原。目前“CD”代表的不僅僅是白細(xì)胞表面抗原，還有紅細(xì)胞膜表面抗原、血小板表面抗原、髓系細(xì)胞表面抗原及其他組織細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)的抗原等，研究方法以流式細(xì)胞術(shù)檢測法為主。1、在血液學(xué)中的應(yīng)用：2、細(xì)胞周期分析：DNA的含量隨細(xì)胞周期(G1，S，G2，M)的各個時期呈現(xiàn)出周期性的變化G1期，是細(xì)胞RNA和蛋白質(zhì)的合成期，即DNA合成前期,此時細(xì)胞核內(nèi)DNA含量保持二倍體；進(jìn)入S期后，DNA開始合成，即DNA合成期,細(xì)胞核內(nèi)DNA的含量介于二倍體至四倍體之間；細(xì)胞進(jìn)入G2期，即細(xì)胞分裂前期，DNA含量為四倍體,直到進(jìn)入M期，即細(xì)胞分裂期,細(xì)胞分成兩個子細(xì)胞,M期結(jié)束進(jìn)入下一個細(xì)胞周期。1）細(xì)胞增殖周期各時相細(xì)胞數(shù)的比率:

在生物細(xì)胞核中，DNA含量隨細(xì)胞增殖周期時相不同而發(fā)生變化。因此，不同種類的細(xì)胞，其細(xì)胞各期（G0/1期,S期,G2/M期）百分比含量是不同的。亞G1峰檢測：凋亡細(xì)胞最突出的形態(tài)學(xué)特征是細(xì)胞核固縮、染色質(zhì)濃集、細(xì)胞體變圓皺縮而細(xì)胞膜保持完整，其中胞核變化尤為突出。染色質(zhì)濃集是由于凋亡細(xì)胞雙鏈DNA發(fā)生裂解所致。DNA降解后，形成長度為180-200bp的DNA片段，稱凋亡小體。即在流式細(xì)胞檢測上可出現(xiàn)亞二倍體(G1)峰值。而常規(guī)壞死的DNA分解是隨機(jī)的，DNA片段大小不一，在流式細(xì)胞檢測上可出現(xiàn)比亞二倍體(G1)峰更