發(fā)酵工程-第二章

第二章微生物菌種選育本章內(nèi)容

一、菌種的來源二、發(fā)酵高產(chǎn)菌種選育三、菌種退化與保藏四、微生物菌種擴大培養(yǎng)一最常用的工業(yè)微生物細菌醋桿菌屬的醋化醋桿菌、弱氧化醋桿菌乳酸桿菌枯草桿菌丙酮丁醇梭菌大腸桿菌谷氨酸棒狀桿菌第一節(jié)菌種的來源最常用的工業(yè)微生物酵母菌釀酒酵母假絲酵母屬產(chǎn)朊假絲酵母解脂假絲酵母熱帶假絲酵母畢赤酵母屬、漢遜酵母屬最常用的工業(yè)微生物霉菌曲霉屬米曲霉黑曲霉青霉屬青霉菌：點青霉、產(chǎn)黃青霉桔青霉根霉屬德氏根霉米根霉、小麥曲根霉紅曲霉屬紫紅曲霉最常用的工業(yè)微生物放線菌鏈霉菌屬小單孢菌屬地中海諾卡氏菌米蘇里游動放線菌二、工業(yè)微生物來源1、菌種保藏機構(gòu)索取有關(guān)菌種2、自然界采集3、發(fā)酵制品中分離目的菌株菌株分離：將一個混雜著各種微生物的樣品通過分離技術(shù)區(qū)分開，并按照實際要求和菌株的特性采取迅速、準確、有效的方法對他們進行分離篩選，進而得到所需微生物的過程。1.菌種選擇的總趨勢野生菌→變異菌自然選育→代謝控制育種誘發(fā)基因突變→基因重組的定向育種

三、微生物菌種的選擇性分離

2.菌種選擇的要求

（1）能在廉價原料制成的培養(yǎng)基上迅速生長，且生成的目的產(chǎn)物產(chǎn)量高、易于回收；（2）生長速度和反應(yīng)速度較快，發(fā)酵周期較短；（3）培養(yǎng)條件易于控制；（4）抗噬菌體及雜菌污染的能力強；（5）菌種不易變異退化；（6）對放大設(shè)備的適應(yīng)性強；（7）菌種不是病原菌，不產(chǎn)生任何有害的生物活性物質(zhì)和毒素。篩選包括以下幾個方面（1）把分離到的野生型菌株進一步純化并進行代謝產(chǎn)物的鑒別；（2）從已知菌種和大自然中分離新菌株①尋找新的發(fā)酵產(chǎn)品的產(chǎn)生菌；②尋找老產(chǎn)品的新的優(yōu)良菌株。選擇篩選方法時必須考慮兩個要點：（1）選擇性（2）靈敏度。分離篩選原理與技術(shù)微生物分離和篩選一般可分為采樣、富集、分離、目的菌。新種分離與篩選的步驟

調(diào)查研究（包括資料查閱）

試驗方案設(shè)計

含微生物樣品的采集（如何使樣品中含所需微生物的可能性大？）

樣品預(yù)處理（如何在后續(xù)的操作中使這種可能性實現(xiàn)）

菌種分離

根據(jù)目的菌株及其產(chǎn)物特點分

選擇性分離方法 隨機分離方法

(定向篩選←選擇壓力)

(用篩選方案-檢測系統(tǒng)進行間接分離）

富集液體培養(yǎng)固體培養(yǎng)基條件培養(yǎng)

(初篩)

菌種純化

復(fù)篩

菌種純化初步工藝條件摸索再復(fù)篩生產(chǎn)性能測試較優(yōu)菌株1-3株保藏及進一步做生產(chǎn)試驗?zāi)承┍匾囼灪突蜃鳛橛N的出發(fā)菌株毒性試驗等

（一）含微生物樣品的采集采樣時應(yīng)注意的問題:土壤微生物的分布采土深度土壤植被情況采樣季節(jié)土壤的酸堿度對于分離篩選新菌種，還存在另兩個選擇標準：土壤來源廣泛在已適應(yīng)相當(dāng)苛刻環(huán)境壓力的微生物類群中尋找新菌種（二）樣品的預(yù)處理目的：提高分離效率方法：物理方法：熱處理；膜過濾法；離心法化學(xué)方法誘餌法（三）分離方法的選擇

根據(jù)目的菌有無選擇性特征來選擇分離方法菌種的營養(yǎng)特征獨特

生長特征獨特

無選擇性特征根據(jù)產(chǎn)物的特征進行

隨機分離選擇性分離的關(guān)鍵：生長培養(yǎng)條件的選擇與控制，從而實現(xiàn)定向富集篩選。選擇性分離

選擇性分離原理和技術(shù)生長條件的選擇與控制原理控制營養(yǎng)成分

控制培養(yǎng)基酸堿度

添加抑制劑

控制培養(yǎng)溫度

控制通氣條件

選擇性分離技術(shù)富集液體培養(yǎng)技術(shù)固體培養(yǎng)技術(shù)施加選擇壓力，進行定向篩選

A.富集液體培養(yǎng)增加混合菌群中所需菌株數(shù)量的一種技術(shù)技術(shù)特點：給混合菌群提供一些有利于目的菌株生長或不利于目的菌以外的其他菌型生長的條件培養(yǎng)方式分批培養(yǎng)方式：以最大比生長速率（μmax）篩選，存在選擇壓力的控制、移種時間和次數(shù)等問題連續(xù)培養(yǎng)方式：以比生長速率（μ）篩選

μ

ABS0基質(zhì)濃度對A、B兩種菌的比生長速率（μ）的影響

當(dāng)S<S0時，富集什么菌株？當(dāng)S>S0時，富集什么菌株？連續(xù)富集培養(yǎng)技術(shù)分離菌株的優(yōu)點

分離的菌株特別適合連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)過程有利于分離具有某種工業(yè)生產(chǎn)特性的菌株可以篩選出能共生的穩(wěn)定混合培養(yǎng)物

B.固體培養(yǎng)技術(shù)常用于分離某些酶產(chǎn)生菌

選擇壓力：在選擇培養(yǎng)基中加入所需酶的基質(zhì)

四、重要工業(yè)微生物菌種的分離

篩選菌種的重要指示：菌的營養(yǎng)特征、生長溫度、設(shè)備和生產(chǎn)過程的適應(yīng)性、穩(wěn)定性、產(chǎn)物得率、易從培養(yǎng)液中回收產(chǎn)物。抗生素產(chǎn)生菌的篩選篩選模型：試驗菌篩選方法：鋪菌法復(fù)印平板法液體培養(yǎng)篩選

抗藥性篩選篩選模型：氨芐青霉素和β-內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生菌（克雷白氏菌）協(xié)同

I II無試樣時（不含棒酸時），I對II菌作用不大有試樣時（含棒酸時），I對II菌恢復(fù)藥效，棒酸抑制水解酶活性

固體培養(yǎng)篩選試驗菌代表微生物類型金黃色葡萄球菌209p革蘭氏陽性球菌枯草桿菌6633 革蘭氏陽性桿菌 大腸桿菌革蘭氏陰性腸道細菌恥垢分枝桿菌607

結(jié)核桿菌 白色念珠菌 酵母狀真菌 青霉菌

絲狀真菌

藥理活性化合物產(chǎn)生菌的篩選

藥理活性化合物是指能抑制人類代謝中某一個關(guān)鍵酶的微生物產(chǎn)物即酶抑制劑，從而達到治療的目的。篩選模型：目標酶生長因子產(chǎn)生菌的篩選

篩選模型：營養(yǎng)缺陷型試驗菌

篩選方法：利用被分離的微生物產(chǎn)物能否促進營養(yǎng)缺陷型試驗菌生長氨基酸產(chǎn)生菌的篩選

樣品

預(yù)處理

初篩（除真菌）

在分離平板上生長獲得多個單菌落復(fù)印平板（copy法）

平板培養(yǎng)，其中有產(chǎn)生氨基酸的菌落分泌氨基酸對應(yīng)到copy前相應(yīng)

u.v線殺死長好的菌落

位置，找到目的菌落

再鋪上一層含營養(yǎng)缺陷型試驗菌的瓊脂

培養(yǎng)后

產(chǎn)氨基酸菌落周圍有生長圈

目的菌落進行液體培養(yǎng)，對產(chǎn)物進行定量測定篩選產(chǎn)物含量高的菌株多糖產(chǎn)生菌的篩選取樣特點：碳水化合物工業(yè)的廢棄物篩選方案：從菌落外觀判斷，選擇外觀呈粘液狀的菌落，然后根據(jù)液體培養(yǎng)測定多糖含量來篩選高產(chǎn)菌。細菌分離：以乳酸菌為例

取未成熟的醬醪樣品1g至無菌磨口瓶中

加麥芽汁至瓶口處，封塞，25℃培養(yǎng)24-48h培養(yǎng)基中長出絹絲狀波動物，鏡檢桿狀，陽性染色初步斷定乳酸菌

用選擇性培養(yǎng)基分批富集培養(yǎng)2-3代稀釋分離法分離單菌落，培養(yǎng)基為含麥芽汁、CaCO3的瓊脂培養(yǎng)基

根據(jù)透明圈挑選菌落

性能測定（鏡檢桿狀，染色陽性；乳酸紙層析鑒定）

Rf值定性（有機酸呈黃斑點）

乳酸生成量測定（滴定法）放線菌的分離：

以產(chǎn)鏈霉素菌種的分離為例

（從退化菌種中篩選）

取工業(yè)發(fā)酵液（含孢子）樣品1環(huán)放入帶玻璃珠的裝有10ml無菌水的小三角瓶中，搖勻

采用稀釋法制平板，獲取單菌落

斜面保藏高產(chǎn)菌恢復(fù)根據(jù)高產(chǎn)菌的特點，選擇目的菌落放大培養(yǎng)，發(fā)酵液性能測試篩選模型：形態(tài)依據(jù)真菌的分離篩選：以啤酒酵母的分離為例

取發(fā)酵液少許以10倍稀釋成10-1-10-7

稀釋分離法取0.1ml加入固體培養(yǎng)基鋪平皿（×2）

在麥芽汁固體培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)48-72h

形態(tài)篩選根據(jù)正常株特點進行挑選，接種斜面?zhèn)溆?/p>

純化，采用平板分離法進一步純化，至少反復(fù)三次

①生成子囊孢子速度測定 ②發(fā)酵力測定性能測定③熱死溫度測定

④凝集力測定

⑤雙乙酰含量測定

二、發(fā)酵高產(chǎn)菌種選育自然選育常規(guī)育種(誘變育種)細胞工程育種基于代謝調(diào)節(jié)的育種技術(shù)基因工程育種蛋白質(zhì)工程育種代謝工程育種

菌種選育改良的具體目標提高目標產(chǎn)物的產(chǎn)量提高目標產(chǎn)物的純度，減少副產(chǎn)物改良菌種性狀，改善發(fā)酵過程改變生物合成途徑，以獲得高產(chǎn)的新產(chǎn)品

自然選育定義：在生產(chǎn)過程中，不經(jīng)過人工處理，利用菌種的自發(fā)突變，選育出油量菌種的過程。存在兩種可能：菌種衰退；代謝更加旺盛，生產(chǎn)性能更高。誘變育種原理：理論基礎(chǔ)是基因突變，包括染色體畸變和基因突變兩大類。常用誘變劑：物理、化學(xué)、生物三大類。誘變劑類型常用誘變劑物理紫外線、快中子、X射線、激光等化學(xué)堿基類物質(zhì)2-氨基嘌呤、5-溴尿嘧啶、8-氮鳥嘌呤與堿基反應(yīng)的物質(zhì)DES、EMS、NTG、NMU、NEU、NA、NM、4-NQO、EI、羥胺DNA分子中插入或缺失一個或幾個堿基吖啶類物質(zhì)、吖啶氮芥衍生物生物噬菌體、轉(zhuǎn)座子誘變育種的方法包括：誘變（出發(fā)菌株的篩選、誘變劑種類、計量的選擇）和篩選（初篩、復(fù)篩）雜交育種定義：人為利用真核微生物的有性生殖或準性生殖，或原核微生物的接合、F因子轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)化等過程，促使兩個具有不同遺傳性狀的菌株發(fā)生基因重組，以獲得性能優(yōu)良的生產(chǎn)菌株。一般程序：選擇原始親本、誘變篩選直接親本、直接親本間親和力鑒定、雜交、分離到基本培養(yǎng)基或選擇培養(yǎng)基、篩選重組體、重組體分析鑒定。原生質(zhì)體融合主要步驟：選擇親本、制備原生質(zhì)體、原生質(zhì)體融合、原生質(zhì)體再生及篩選優(yōu)良性狀的融合子?；蚬こ逃N第三節(jié)菌種退化和菌種保藏

一、菌種退化1、引起菌種退化的原因定義：指生產(chǎn)菌種或選育過程中篩選出來的較優(yōu)良的菌株，由于進行接種傳代或保藏之后，群體中某些生理特性和形態(tài)特征逐漸減退或完全喪失的現(xiàn)象。原因：基因突變、連續(xù)傳代、其他因素2、菌種復(fù)壯定義及常用方法退化菌種的復(fù)壯、通過宿主進行復(fù)壯、聯(lián)合復(fù)壯3、防止退化的措施合理的選育菌種、選用合適培養(yǎng)基、創(chuàng)造良好培養(yǎng)條件、控制傳代次數(shù)、利用不同類型的細胞進行移種傳代、采用有效的菌種保藏方法（二）微生物菌種保藏1保藏原理：采用低溫、干燥、缺氧、缺乏、營養(yǎng)、添加保護劑或酸度中和劑等方法，使微生物處于代謝不活潑，生長受抑制的環(huán)境中。2方法①斜面低溫保藏法②砂土管保藏法③冷凍真空干燥法④液氮超低溫保藏法

3、保藏菌種的質(zhì)量控制①保藏樣品制備前，應(yīng)反復(fù)核對，監(jiān)測生理生化指標，與親本特征比較。②保藏樣品制備后，仍要按3%抽樣檢查，一旦有誤，此批全部廢掉。③注重菌種保藏的連續(xù)性。（三）菌種保藏機構(gòu)1、國外菌種保藏機構(gòu)（1）ATCC(AmericanTypeCultureCollection）美國典型菌種保藏中心（2）NRRL(AgriculturalResearchServiceCultureCollection)美國農(nóng)業(yè)研究菌種保藏中心（3）DSMZ(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH)德國微生物菌種保藏中心（4）NBRC(NITEBiologicalResour