G 試驗(yàn)和 GM 試驗(yàn)檢測(cè)原理和臨床應(yīng)用

G試驗(yàn)和GM試驗(yàn)檢測(cè)原理和臨床應(yīng)用首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院左大鵬G試驗(yàn)和GM試驗(yàn)的檢測(cè)原理和臨床應(yīng)用。目前我們國際合國內(nèi)都對(duì)侵襲性真菌病的診斷制訂了標(biāo)準(zhǔn)，其中有權(quán)威的是歐洲癌癥研究和治療組織暨侵襲性真菌病感染協(xié)作組，我們簡(jiǎn)稱叫歐洲標(biāo)準(zhǔn)所制訂的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)它對(duì)侵襲性真菌病它分了三個(gè)不同的診斷層次。一個(gè)叫確診，一個(gè)叫臨床診斷，一個(gè)叫疑診。我們國家的很多的專業(yè)委員會(huì)也都根據(jù)歐洲標(biāo)準(zhǔn)就結(jié)合我們國家和專業(yè)的特點(diǎn)制訂了我們國家各個(gè)專業(yè)的診斷標(biāo)準(zhǔn)。比如說中國侵襲性真菌感染工作組在2010年第3次修訂的血液病和惡性腫瘤患者侵襲性真菌感染的診斷，診斷標(biāo)準(zhǔn)和治療原則，這第3次修訂，第一次是2006，第二次2008，2010年是第3次修訂了。這應(yīng)該是血液里的腫瘤病人所用的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。中華醫(yī)學(xué)會(huì)器官移植學(xué)分會(huì)制訂的實(shí)體器官移植患者侵襲性真菌感染的診斷和治療指南。這可能是實(shí)體器官移植的這個(gè)方面的診斷標(biāo)準(zhǔn)。中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)會(huì)，中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)會(huì)，中華醫(yī)學(xué)會(huì)急診協(xié)會(huì)，中華婦產(chǎn)科學(xué)會(huì)也都根據(jù)自己的專業(yè)制訂了的相應(yīng)的侵襲性真菌感染的診斷和治療指南。這作為我們從事這些方面的醫(yī)務(wù)工作者所遵循的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。那我們看不管是國內(nèi)和國際現(xiàn)在都采用這樣一種方式。首先要看這個(gè)病人有沒有宿主因素，它是不是容易發(fā)生侵襲性真菌，真菌感染的高危人群，你要是這樣的，你要一個(gè)健康人這就不具備了，起碼有一些原因它容易得侵襲性真菌感染要具備這樣一個(gè)高危因素。第二它有臨床表現(xiàn)，當(dāng)然包括臨床癥狀和影像學(xué)，比如說胸片，CT，顱片等等。還有有微聲學(xué)的檢查，還有一個(gè)病理學(xué)檢查，如果你只有宿主因素有臨床表現(xiàn)我們叫做擬診，不叫疑診，疑似診斷。如果說你在這兩個(gè)基礎(chǔ)上又多了一條有微生物學(xué)證據(jù)，或者是培養(yǎng)的，或者是非培養(yǎng)的技術(shù)凡是證明他有真菌性感染的這種可能性就要臨床診斷，臨床診斷。如果再加上從肺的組織，從臟器的組織取出病理來確定，那叫確診。所以侵襲性真菌感染根據(jù)宿主因素臨床表現(xiàn)微生物學(xué)真菌，組織病理的結(jié)果，可以把它分成為擬診，臨床診斷跟確診三個(gè)層次。確診了當(dāng)然就已經(jīng)是確定了，治療起來更有針對(duì)性。臨床診斷基本是確定了，大方向也沒有問題。擬診是不能，不叫，就是說我們只能是一種預(yù)防性的治療，或者是一種搶先的有干預(yù)的治療，還不能說它一定有真菌感染。比如說我們高度懷疑，高度懷疑。不管我們前面講了，就是你要做到臨床診斷你就必須有微生物學(xué)的真菌。在歐洲標(biāo)準(zhǔn)和我們國家各個(gè)專業(yè)把腦脊液能夠找到隱球菌抗原這個(gè)陽性結(jié)果作為真菌性腦膜炎或者叫播散性真菌隱球菌病的一個(gè)確診的依據(jù)。這時(shí)候確診就不需要組織學(xué)了，它只要腦脊液里面找到隱球菌的抗原就確診。血清的1、30D葡聚糖的檢測(cè)我們稱為G試驗(yàn)和這個(gè)曲霉菌的半乳甘露聚糖的GM試驗(yàn)，那就這個(gè)G試驗(yàn)和GM試驗(yàn)作為臨床診斷侵襲性真菌病的依據(jù)。當(dāng)然它不是確診，它是臨床診斷。我們來看這是中華內(nèi)科雜志2007年中國，中華這個(gè)重癥協(xié)會(huì)所制定的關(guān)于重癥患者侵襲性真菌感染的診斷語言，它在這個(gè)微生物學(xué)檢查里面它要求所有的標(biāo)本應(yīng)該是新鮮的，合格的，檢測(cè)手段包括傳統(tǒng)的真菌圖片，培養(yǎng)技術(shù)以及新進(jìn)的基于非培養(yǎng)的診療手段。它具體包括了。第一、有血液，這是無菌的。胸腹水無菌體液，隱球菌抗原陽性。第二，血液、胸腹水無菌體液，直接鏡檢，或者細(xì)胞學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)了除隱球菌以外的其他的真菌。如果鏡檢發(fā)現(xiàn)隱球菌就可以確診了。發(fā)現(xiàn)其他的真菌有念珠菌、曲霉菌、毛霉菌等等有，不到確診那叫臨床診斷。第三，在沒有留置導(dǎo)尿管的情況下連續(xù)兩次尿培養(yǎng)，培養(yǎng)是酵母菌陽性或者尿檢發(fā)現(xiàn)有念珠菌管型，那這也算有微生物學(xué)證據(jù)。如果導(dǎo)尿獲得的尿樣培養(yǎng)酵母菌陽性，當(dāng)然它包括一個(gè)菌的計(jì)數(shù)。第五就更換尿管前后的兩份尿樣標(biāo)本，酵母菌陽性你要達(dá)到一定的檢查技術(shù)。第六、氣道的分泌物，包括經(jīng)口氣管插管、支氣管肺泡灌洗，保護(hù)性毛刷等手段所獲取的標(biāo)本，直接鏡檢或者細(xì)胞學(xué)發(fā)現(xiàn)菌絲或孢子或者培養(yǎng)陽性。第七，經(jīng)腹腔、胸腔、盆腔引流或腹膜透析管引流液所直接鏡檢和細(xì)胞學(xué)發(fā)現(xiàn)菌絲和孢子或培養(yǎng)陽性。第八，經(jīng)腦室引流，腦脊液引流的直接鏡檢和細(xì)菌學(xué)發(fā)現(xiàn)菌絲跟孢子或培養(yǎng)陽性。第八條就是血液標(biāo)本半乳糖甘聚糖，甘露聚糖抗原GM試驗(yàn)和1、3BD葡聚糖G試驗(yàn)，連續(xù)2次陽性。所以說上面很多都是培養(yǎng)的技術(shù)，對(duì)吧。當(dāng)然也包括一部分顯微鏡直接觀察。第九條就是把兩個(gè)很重要的非培養(yǎng)技術(shù)G試驗(yàn)和GM試驗(yàn)當(dāng)然還包括腦脊液的隱球菌抗原這樣一個(gè)非培養(yǎng)的檢測(cè)技術(shù)，作為侵襲性真菌感染的確診或者臨床診斷的一個(gè)依據(jù)。所以我們可以看到這個(gè)非培養(yǎng)技術(shù)特別是G試驗(yàn)和GM試驗(yàn)以及腦膜炎隱球菌的抗原的檢測(cè)在信息性真菌病的里面的重要地位。如果你僅僅是在擬診的話，你的經(jīng)驗(yàn)治療，如果你是臨床診斷的話應(yīng)該搶先治療，如果確診就要靶向治療。既經(jīng)驗(yàn)治療怎么用藥，搶先治療怎么用藥還有靶向治療怎么用藥，甚至在血液科還面對(duì)一個(gè)粒缺的病人還有一個(gè)預(yù)防用藥，這些做一個(gè)規(guī)范性的一個(gè)指南。下面我們就來介紹第一個(gè)1、 3BD葡聚糖檢測(cè)，就是G試驗(yàn)這個(gè)原理和應(yīng)用。1、 3B葡聚糖廣泛的存在于真菌的細(xì)胞壁里面，它占到細(xì)胞壁干重的50%，應(yīng)該是屬于真菌細(xì)胞壁的特有成份。就是除了真菌之外別人沒有，別的生物體沒有，人也沒有，細(xì)菌也沒有。這是我們就要查的這個(gè)1、3B葡聚糖的位置，當(dāng)然還有甘露聚糖，那現(xiàn)在我們也可以去查甘露聚糖。一般我們今天主要講的是1、3B葡聚糖。1、 3B葡聚糖它對(duì)熱極為穩(wěn)定，在高壓121度的時(shí)候不能滅活，在念珠菌和曲霉菌細(xì)胞壁中含有比較多，所以如果你去檢測(cè)這個(gè)1、3B葡聚糖對(duì)于念珠菌感染跟曲霉菌感染是很重要的。而且這個(gè)1、3B葡聚糖很有特點(diǎn)它只有真菌進(jìn)入到人體的血液和深部組織后經(jīng)過吞噬細(xì)胞的吞噬消化才能從細(xì)胞壁里面給它釋放出來，從而在血液里面和其他體液里面含量增高。當(dāng)然隨著真菌在體內(nèi)的清除，比如說你用了抗真菌藥了，這個(gè)東西你就慢慢下降了。真因?yàn)樗沁M(jìn)行吞噬細(xì)胞的處理才釋放出來，所以在淺部的真菌感染比如說口腔的、皮膚的、或者定植的，它不增高。因此，對(duì)1、3B葡聚糖的檢測(cè)能夠區(qū)分是定植還是感染這是個(gè)非常重要的。痰里培養(yǎng)出細(xì)菌來你培養(yǎng)出陽性那可能定植不是感染。1、3B葡聚糖如果陽性痰里也是陽性，那當(dāng)然你就多考慮是感染。用什么方法來檢測(cè)1、 3B葡聚糖目前主要是用后試驗(yàn)的方法。2006年美國FDA批準(zhǔn)了一個(gè)美國公司叫ACC公司它所上市的Fungitell的這樣一個(gè)臨床事跡和使用。鱟是什么東西？鱟是一個(gè)外形是這樣子，甲殼類的動(dòng)物。它是一個(gè)深海的節(jié)肢動(dòng)物，它將近有幾億年，它非常古老，可以說叫活化石，血是藍(lán)色的，因?yàn)樗锩娴难锩婧~很高，它叫銅藍(lán)蛋白，主要的血這個(gè)鱟體的血里面有個(gè)變形細(xì)胞，相當(dāng)我們的單核細(xì)胞，這個(gè)這個(gè)粒細(xì)胞之類，但是它叫變形細(xì)胞。它有個(gè)溶解物，它里面含有很多的物質(zhì)，這些物質(zhì)能夠被這個(gè)1、3B葡聚糖激活。我們看內(nèi)毒素，大家知道內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌的一個(gè)產(chǎn)物，查3葡聚糖也是通過鱟試驗(yàn)，在鱟的變形細(xì)胞里面會(huì)產(chǎn)生C因子、B因子、凝固蛋白原，還會(huì)產(chǎn)生G因子，內(nèi)毒素試驗(yàn)和1、 33D葡聚糖試驗(yàn)的檢測(cè)都是根據(jù)鱟，鱟試驗(yàn)原理，只不過它們所激活的途徑不一樣，你要查1、 33D葡聚糖你走這條路。那我們現(xiàn)在要查的是代測(cè)樣本中的1、33D葡聚糖是真菌的細(xì)胞壁的產(chǎn)物，能夠找到它我就能夠診斷侵襲性的真菌感染。在試驗(yàn)當(dāng)中這個(gè)物質(zhì)如果你血液當(dāng)中或者什么標(biāo)本當(dāng)中有這個(gè)東西，我加進(jìn)去鱟試劑，比如鱟血里面所提出來的G因子。1、 33葡聚糖可以使它活化，變成活化的G因子。那當(dāng)然試劑里面還有從鱟學(xué)里提出來的凝固酶原，它就會(huì)變成凝固酶。凝固酶又會(huì)使我試劑中的凝固酶原，凝固蛋白酶，變成凝固蛋白。再者凝固蛋白整個(gè)就會(huì)凝了，在血中就會(huì)凝固了，變成凝膠了。整個(gè)液體原來是很清亮的。因?yàn)橛心z就會(huì)有濁度。所以我可以通過測(cè)定這個(gè)標(biāo)本的透光率來反應(yīng)你這個(gè)代測(cè)物1、33葡聚糖的多少。如果越多那就凝得越多透光率就越差。如果里面沒有那整個(gè)你也沒有凝，整個(gè)透光率是100%。所以我可以透光率來推算出你代測(cè)物的含量，這就是所謂的G實(shí)驗(yàn)。另外一個(gè)方法也是1、33葡聚糖也是使G因子活化，也是這個(gè)作用在這個(gè)變成這個(gè)G因子活化之后它就會(huì)變成一個(gè)叫絲氨酸蛋白酶，這時(shí)候我給試劑里面這個(gè)反應(yīng)體加進(jìn)一個(gè)發(fā)色底物，前面是1234四個(gè)寡肽，后面連著一個(gè)發(fā)色集團(tuán)，這個(gè)發(fā)色集團(tuán)就是大家很熟悉的對(duì)硝基苯胺，如果對(duì)硝基苯胺，如果這個(gè)絲氨酸蛋白酶從這兒一切，把四個(gè)寡肽切下來，把發(fā)色集團(tuán)給游離出來那當(dāng)然就顯色了，它這個(gè)黃色在405拉美的時(shí)候它吸光度最高，我們通過測(cè)定吸光度來推測(cè)1、3葡聚糖的含量，這是顯色法。當(dāng)然用的仍然是鱟血里面的G引資這些最原始的這些試劑了。隨著鱟試劑里面的主要成份有蛋白C、蛋白B、蛋白G、凝血，凝固原、凝固蛋白酶等等，還有一些離子。你要測(cè)定1、 33D葡聚糖的試劑，你必須要把C和B屏蔽掉，因?yàn)镃和B有參與內(nèi)毒素的反應(yīng)。只保留G因子。那當(dāng)然這在試劑研發(fā)當(dāng)中所必須解決的一個(gè)問題。那這是真菌的3葡聚糖和內(nèi)毒素在鱟試驗(yàn)中的反應(yīng)曲線是不一樣的，內(nèi)毒素它是一個(gè)經(jīng)過0點(diǎn)的一個(gè)S型的特征曲線，而1、 33葡聚糖是經(jīng)0.0的類似于直，一個(gè)直線的曲線。它的橫坐標(biāo)是它的時(shí)間，縱坐標(biāo)是它的吸光度，當(dāng)然這是采用的顯色法。目前已經(jīng)上市的G試驗(yàn)的系統(tǒng)均采用透光度與濃度建立相，建立這個(gè)檢測(cè)體系。它是以90%的透光率作為一個(gè)臨界點(diǎn)，然后根據(jù)一個(gè)事情要求建立一個(gè)反應(yīng)的時(shí)間T和3濃度C之間的一個(gè)模型。檢測(cè)反應(yīng)體系當(dāng)中的濁度達(dá)到預(yù)定設(shè)置的吸光度或者透光率，比如透光率我以90%，達(dá)到我透光率90%所需要的時(shí)間有多少秒，這個(gè)時(shí)間就和我3濃度呈一個(gè)線性關(guān)系。一個(gè)產(chǎn)品的檢測(cè)實(shí)測(cè)圖了，這是一個(gè)北京金山川的一個(gè)試劑。它先要做標(biāo)準(zhǔn)。它用標(biāo)準(zhǔn)給它分別吸入了100個(gè)PG， 10個(gè)PG，一個(gè)PG，但是稀釋要成稀釋度，實(shí)際上我們的實(shí)際測(cè)定值是1000、 100跟10這三個(gè)水平。我們看這里有幾條線，第一條是藍(lán)色這是一個(gè)空白對(duì)照。第一條線這是1000個(gè)PG的標(biāo)曲，指的是100PG的標(biāo)曲，這個(gè)藍(lán)的是10個(gè)PG的標(biāo)曲，標(biāo)曲就是說，我這標(biāo)準(zhǔn)擱進(jìn)去那肯定是1、3B葡聚糖肯定會(huì)激活G因子最后產(chǎn)生濁度，當(dāng)它的透光率從100%減到90%的時(shí)候有三個(gè)點(diǎn)。比如說一百個(gè)PG的這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品在這個(gè)時(shí)間到了90%的透光率，我們要有一個(gè)折點(diǎn)。這個(gè)10個(gè)PG的，一百，對(duì)，到這兒，一個(gè)PG的到這些。我們就建立一個(gè)透光率，時(shí)間的一個(gè)反應(yīng)曲線。我們來看一個(gè)具體的實(shí)例。我們要的是什么？要的既不是時(shí)間，也不是透光率，我們要的是這個(gè)含量是PG每毫升，那一定要把什么，要把這個(gè)剛才我們講在這個(gè)時(shí)間點(diǎn)這1000個(gè)PG的標(biāo)曲做出來的。在這個(gè)時(shí)間點(diǎn)是100個(gè)PG的標(biāo)曲做出來，這個(gè)時(shí)間點(diǎn)是10個(gè)PG標(biāo)曲做出來的。那三點(diǎn)連成線這是一個(gè)線性關(guān)系?，F(xiàn)在我們?cè)僭O(shè)標(biāo)本擱進(jìn)去在什么時(shí)候留在這個(gè)時(shí)間點(diǎn)就，我們就可以從這個(gè)B曲線的查到相對(duì)應(yīng)的濃度，相對(duì)應(yīng)的濃度。所以建立標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)于G線來說是至關(guān)重要的。G試驗(yàn)有什么用處G實(shí)驗(yàn)可以檢測(cè)多種致病的真菌感染。比如說念珠曲霉鐮刀菌，支頂孢菌，卡氏肺孢子蟲菌，孢子絲菌，粗孢球子菌，組織胞漿菌，皮炎芽生菌等等。但是注意它不能檢測(cè)隱球菌跟接合菌，最后有個(gè)毛霉菌，為什么因?yàn)檫@個(gè)，因?yàn)殡[球菌的壁很厚，它的1、3B葡聚糖不容易釋放。那接合菌它根本就不含有這個(gè)1、3B葡聚糖所以你檢測(cè)不出來。所以當(dāng)然除了隱球菌跟接合菌之外基本上臨床上能遇到的這個(gè)真菌最常見的念珠菌跟曲霉基本上都能夠通過G試驗(yàn)檢測(cè)出來。而且G試驗(yàn)一般先于臨床癥狀四天，就是說你還沒有出現(xiàn)發(fā)燒、沒有出現(xiàn)肺部的呼吸道癥狀，G試驗(yàn)就是陽性的。所以它有的文獻(xiàn)報(bào)道它可能比這個(gè)發(fā)燒要早五天，比呼吸道癥狀要早10天，比這個(gè)高清晰度的CT要早9天，那當(dāng)然了我們要看到這樣一個(gè)信息那簡(jiǎn)直太高興了。臨床還沒有發(fā)生，沒有察覺到你的G試驗(yàn)就已經(jīng)陽性了，當(dāng)然我們看到這樣一個(gè)信息我們就非常高興了。因?yàn)榕R床上還沒有出現(xiàn)真菌感染的跡象有發(fā)燒癥狀，CT，G試驗(yàn)的陽性，那當(dāng)然我們做這樣一個(gè)實(shí)驗(yàn)就抱著很高的期待。對(duì)G試驗(yàn)來講它實(shí)際上是可以查念珠曲霉等很多的真菌，但是據(jù)文獻(xiàn)的報(bào)道它對(duì)念珠菌菌血癥應(yīng)該是首選，你說在念珠菌它更為敏感。所以我們歸納起來G試驗(yàn)既可以作為深不真菌病的初篩的診斷方法，又能作為患者療效的評(píng)價(jià)指標(biāo)。但是相對(duì)來講我們真菌的培養(yǎng)，是不能夠區(qū)別定植和感染，而我們G試驗(yàn)對(duì)于這個(gè)真菌培養(yǎng)陽性的病人你就可以區(qū)分出來你到底是定植的還是感染的。當(dāng)然缺點(diǎn)它是不能夠判斷具體的菌組，是一個(gè)屬，是念珠菌屬還是曲霉菌屬，它不能判定，當(dāng)然它也不能夠去決定一個(gè)種念珠里面是白念是光滑是熱帶還是曲霉里面是煙曲土，土曲還是黃霉，這都不能夠看它的缺點(diǎn)。但是它能從大的輪廓上告訴你它是一個(gè)真菌感染。關(guān)于這個(gè)G實(shí)驗(yàn)的診斷的臨界值不同的方法還有臨界值不一樣的，表列出來我們目前在國際上用得多的三家日本產(chǎn)品和一家美國產(chǎn)品。你看他們的反應(yīng)也不太一樣，有的是動(dòng)態(tài)發(fā)色，有的是終點(diǎn)發(fā)色，有的是動(dòng)態(tài)發(fā)色，它的標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)也不一樣，他的細(xì)胞內(nèi)的來源也不一樣。它的前處理也不一樣，我們不去展開討論了。只是說我們從這個(gè)表格看出不同的檢測(cè)體鏡，他的Cutoff值是不一樣的。你得有20的，有11的，也有80的。所以說Cutoff值主要和試劑中的細(xì)胞裂解液的來源，那當(dāng)然這里面主要G因子，還有前處理方法主要是屏蔽內(nèi)毒素的干擾和標(biāo)準(zhǔn)品是決定檢測(cè)待植物，待測(cè)物的計(jì)量標(biāo)準(zhǔn)是有關(guān)系的。只要這三個(gè)當(dāng)中有一個(gè)變的你的你的Cutoff值就不可能是一樣，你要隨之而改變。我們國家前些年都是用比濁法，比濁法我們國內(nèi)也有些產(chǎn)品，當(dāng)然比較多的是北京金山川的，還有比較多的產(chǎn)品，它參考范圍是10個(gè)PG每毫升，它把20個(gè)PG每毫升作為一個(gè)診斷陽性值，最近又推出來顯色法，顯色法，顯色法它存在一個(gè)不是10了，根據(jù)天津貽諾琦公司它的資料，它說如果有血清的話它就是小于60是陰性，大于100是陽性。如果血漿的話那可能就小于80是陰性，大于120是陽性。在這60個(gè)100和80個(gè)120之間它們是一個(gè)灰色區(qū)域，就是說這個(gè)區(qū)域里面可能有正常的，就非侵襲性真菌感染的，第一要結(jié)合臨床，第二要?jiǎng)討B(tài)觀察。一次陽性結(jié)果的特異性87%到90，如果你2次或者2次以上都陽性的話特異性就會(huì)增加到96%，這是國外的一個(gè)文獻(xiàn)的報(bào)道。所以一般我們國內(nèi)你要使用G試驗(yàn)去診斷侵襲性真菌感染建議2次陽性才能再去做判斷。G試驗(yàn)人們寄著很大的期望。但是G試驗(yàn)它的由于方法性的局限它有很多干擾因素。據(jù)報(bào)道能產(chǎn)生假陽性的因素有，第一，污染。如果體的試管、你的槍頭，你的蒸餾水或者被細(xì)菌和真菌污染的話整個(gè)你的操從采血到，到那個(gè)整個(gè)操作當(dāng)中有這些污染的話，那就是假陽性。另外，如果用了這個(gè)含有葡聚糖的纖維素膜進(jìn)行血液透析跟腹膜透析的患者它也可能出現(xiàn)假陽性。手術(shù)中間使用的紗布或者醫(yī)療器械里面，醫(yī)療器械包括有葡聚糖的你用的，你G試驗(yàn)這樣的你也可能出現(xiàn)假陽性。如果你靜脈輸了白蛋白、凝血因子、免疫球蛋白，你也會(huì)出現(xiàn)假陽性。還有某些細(xì)菌感染，比如說鏈球菌敗血癥的目前報(bào)道也不光是鏈球菌了。很多細(xì)菌敗血癥也可以出現(xiàn)假陽性。中藥的抗腫瘤藥物香菇多糖、這本身就是一個(gè)真菌了，那也可以出現(xiàn)假陽性。另外，磺胺藥、這個(gè)阿莫西林，克拉維酸頭孢類的藥物，多年菌素以及厄他培南。也可以使得這個(gè)試驗(yàn)假陽性。還有吃了蘑菇類的食物假陽性。林外新生兒足跟采血也可能出現(xiàn)假陽性。所以你看這個(gè)試驗(yàn)是人們有很多期望值很高但是它確實(shí)有很多的假陽性的情況。所以有些國外文獻(xiàn)做過統(tǒng)計(jì)說這個(gè)G試驗(yàn)假陽性會(huì)占到10%。假陰性也有，但是情況不是很多見。假陰性也有，但是不是很多見。比如在隱球菌、接合菌，接合菌包括毛菌、真菌和犁頭菌，這種感染的時(shí)候他不可能做出來假陰性。另外有人研究發(fā)現(xiàn)近平滑念珠菌感染。近平滑屬于念珠菌的一種，它屬于念珠菌，但是它的感染可能會(huì)造成假陰性的情況。另外就是你的1、3B葡聚糖和抗體形成的抗炎抗菌符合物這時(shí)候也查不出來。另外使用的抗真菌藥能夠非抑制性的抑制1、3B葡聚糖合成也是假陽性。另外，標(biāo)本放置過長1、 3葡聚糖會(huì)降解一般也會(huì)出現(xiàn)，也可以出現(xiàn)假陰性。下面我們看一個(gè)幾個(gè)例子來說明我們國內(nèi)來用這個(gè)G試驗(yàn)做臨床研究的一些情況。比如說2007年12月到2009年1月我們安貞醫(yī)院對(duì)ICU的一個(gè)擬診的45例進(jìn)行了檢測(cè)，進(jìn)行檢測(cè)，有23例是確定的，這個(gè)和確，和這個(gè)臨床診斷也就是在45例當(dāng)中只有23例是可以符合確定診斷臨床診斷的。那它和口腔的定植的比較，也是23例，它的測(cè)定值都是中位數(shù)30。對(duì)照組16，中位值只有5，他們是有統(tǒng)計(jì)差的。我們又把這些檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了分類，從8.9、 10.8、 11.75、 14.02，我們把把這測(cè)定結(jié)果進(jìn)行分類來將這23例這個(gè)確定跟臨床診斷G試驗(yàn)的敏感性跟特異性的比較我們就發(fā)現(xiàn)如果當(dāng)診斷在14.02的時(shí)候，他的敏感性是82.6%，它的特異性是百分之七，87.5，應(yīng)該講是比較滿意的。陽性預(yù)值是比較高的90.4，陰性預(yù)值77.8當(dāng)然偏低一點(diǎn)。這個(gè)ROC曲線的處理發(fā)現(xiàn)在這個(gè)RO曲線，ROC曲線面積這個(gè)時(shí)候面積最大，所以我們就認(rèn)為14.02就可以作為這個(gè)診斷標(biāo)準(zhǔn)了。同樣北京友誼醫(yī)院也做了一共有18份陽性，它做了182份標(biāo)本當(dāng)然其中確診和高度懷疑的有18份。也是發(fā)現(xiàn)了它這個(gè)有感染的是64.7加減86，它的標(biāo)準(zhǔn)差比較大。沒有感染的是6.3，另外它又以13.7作為個(gè)臨界值。ROC曲線就發(fā)現(xiàn)這13.7的時(shí)候ROC曲線最大，這個(gè)虛線這一部分是在這個(gè)培養(yǎng)的結(jié)果。它是認(rèn)為培養(yǎng)的這個(gè)對(duì)于臨床診斷的這個(gè)ROC曲線還不如G試驗(yàn)對(duì)本段的ROC曲線。ROC曲線是評(píng)價(jià)一個(gè)檢驗(yàn)項(xiàng)目在臨床診斷價(jià)值的重要的一個(gè)評(píng)價(jià)手段。下面我們講第二個(gè)試驗(yàn)叫做半乳甘按聚糖試驗(yàn)，叫GM試驗(yàn)。半乳甘聚糖是曲霉菌細(xì)胞壁的一個(gè)多聚抗原。它只有當(dāng)這個(gè)曲霉菌進(jìn)入到體內(nèi)之后它就會(huì)從這個(gè)在曲霉菌的這種對(duì)數(shù)生長期的過程當(dāng)中它就會(huì)從薄弱的菌絲的頂部釋放出來。釋放到血液當(dāng)中，釋放到組織液當(dāng)中，所以我們通過對(duì)它的檢測(cè)可以來說明有曲霉感染。當(dāng)然它現(xiàn)在也認(rèn)為它也比臨床癥狀和影像學(xué)出現(xiàn)要早。所以GM試驗(yàn)可以作為曲霉菌感染的早期的一個(gè)診斷的篩查指標(biāo)。國外的，國內(nèi)外的薈萃分析都表明它的診斷靈敏度和特異性均在90%，應(yīng)該這個(gè)評(píng)價(jià)還是很高的了。這個(gè)試驗(yàn)是怎么一個(gè)原理它實(shí)際上是一個(gè)免費(fèi)原理，采用的方法是ELISA試驗(yàn)，在這一臺(tái)ELISA試驗(yàn)它今年一定有，你查的是這個(gè)甘露，你查的是這個(gè)這個(gè)這個(gè)，這個(gè)半乳甘露聚糖是個(gè)抗原，那當(dāng)然用的一個(gè)是抗體，抗體就是單抗了是小鼠產(chǎn)生一個(gè)B，EBA2的一個(gè)單抗，這個(gè)單抗識(shí)別的是這個(gè)GM上面的叫呋喃半乳糖的決定值，它的檢測(cè)濃度ELISA可以達(dá)到每毫升一個(gè)NG就查出來了。國外一些研究發(fā)現(xiàn)血液腫瘤患者的曲霉感染以后有三分之二的病人在血液里面都能查到GM，而且要比臨床診斷要早八天。我們采用針對(duì)曲霉菌半乳甘露聚糖的大鼠的EBA-2單抗包被微孔板去檢測(cè)。這個(gè)過程我們就不講它，肯定還有一個(gè)二抗，它實(shí)際上是一個(gè)雙抗體的原理。如果加上中止液硫酸以后就變成一個(gè)黃色的，可以在450到620的這樣一個(gè)分光的工具進(jìn)行檢測(cè)。判斷方法它是一個(gè)定型的試驗(yàn)，當(dāng)然不是定量的時(shí)間，它是用這個(gè)GMI叫指數(shù)，GMI來表示，GMI就是樣本的吸光度，就是你病人樣品吸光度和參考品的吸光度那參考品它會(huì)給你兩個(gè)參考品，那兩個(gè)參考品再氣個(gè)平均值，那當(dāng)然這個(gè)就有一個(gè)平均的吸光度，用樣本的吸光度比上參考品的平均吸光度那比你得出的比值，那這個(gè)比值就叫做GMI，不叫做GM指數(shù)。到底我們?cè)\斷這個(gè)這個(gè)曲霉的感染到底使用這GM試驗(yàn)，什么叫能夠診斷標(biāo)準(zhǔn)，診斷臨界值，不同的國家和地區(qū)的判定標(biāo)準(zhǔn)不同。歐洲許多國家是1.0就是GMI，病人的標(biāo)本的吸光度去比上參考品的平均值的吸光度應(yīng)該是1，或者1.5，連續(xù)兩次它才能有意義。可是2003年美國FDA把這個(gè)臨界值下調(diào)到0.5，為什么要下調(diào)是在提高對(duì)于這個(gè)曲霉菌感染的這個(gè)篩查率敏感率越低它就篩查就越多，然后特異性就會(huì)有所下降。那就會(huì)這樣一個(gè)0.5到1.5之間的這種范圍帶來很多的差異性，怎么去評(píng)價(jià)。到2006年大概美國歐洲他們做了大量的資料，他們一致同意大于0.5連續(xù)兩次是陽性，一次不行陽性的。我們國家在引用這個(gè)，在把這個(gè)檢測(cè)的體積引進(jìn)來，這個(gè)檢測(cè)體積主要是美國伯樂公司生產(chǎn)的試劑。我們通過我們國家研究，大家都認(rèn)為0.8合適，或者說2次0.5合適，0.5合適。所以我們國家要接受的是GMI0.8或者0.5，兩次，一次0.8，兩次0.5，作為診斷侵襲性曲霉感染的標(biāo)準(zhǔn)。這0.5，1，1.5敏感性有所提高，如果是1.5的是48%，1.0是65，那到0.5就是79，79。當(dāng)然特異性的也會(huì)有所提高，所以大概這個(gè)資料是來源于美國的臨床資料，所以它這個(gè)0.5比較合適。GM的檢測(cè)當(dāng)然現(xiàn)在主要是查血清，當(dāng)然也可以查腦脊液，也可以查胸腹水也可以查尿?，F(xiàn)在主要還是在血清的這個(gè)比較多，它認(rèn)為它要比臨床癥狀早5到8天，比高分辨的CT要早7天，比這個(gè)經(jīng)驗(yàn)性抗真菌治療要早12天，這是國外的文獻(xiàn)，國外的文獻(xiàn)。這個(gè)實(shí)驗(yàn)在國外已經(jīng)用了十多年了，2003年美國已經(jīng)使用了，我們國家最近也在使用這個(gè)東西。當(dāng)然這是通過一些文獻(xiàn)還加上我個(gè)人的考慮，我覺得對(duì)于GM結(jié)果的分析不能夠單純的依靠這個(gè)GMI這個(gè)值來判斷，主要還是要看宿主因素的臨床表現(xiàn)，如果病人即使沒有任何的臨床表現(xiàn)。如果病人沒有任何臨床表現(xiàn)，那即使這個(gè)GMI大于1.5你也不要馬上做診斷，特別是沒有宿主因素的情況下，沒有宿主因素情況下。如果病人確實(shí)有宿主因素，或者出現(xiàn)臨床表現(xiàn)了，但是即使GM只有0.5應(yīng)要開始經(jīng)驗(yàn)治療。大家知道真菌的感染死亡率是很高的，特別是曲霉菌的感染死亡率很高，所以我們一定要抓住時(shí)期早期治療，不要拖時(shí)間。當(dāng)時(shí)對(duì)于肺曲霉菌的感染有人認(rèn)為你要做這個(gè)肺泡灌洗液的檢測(cè)可能要比外周血更一些這是一個(gè)肺，薈萃的分析的它有27項(xiàng)GM試驗(yàn)診斷一個(gè)薈萃結(jié)果，總而言之它認(rèn)為對(duì)于確診的曲霉菌來講他的敏感性是77%，特異性是81%。當(dāng)然對(duì)于骨髓移植對(duì)于這個(gè)移植病人來講它可能就會(huì)更高一點(diǎn)。所以說我們現(xiàn)在GM試驗(yàn)它比較推薦于用于惡性腫瘤和骨髓移植的病人的篩查，而不推薦用實(shí)體腫瘤篩查，你的實(shí)體瘤就差一點(diǎn)，實(shí)體移官它只有22%的敏感度，很不敏感。當(dāng)然這個(gè)都是國外的文獻(xiàn)我們?nèi)狈ψ宰约旱墓ぷ?。曲霉的品種不同它的釋放量也不同，因此在檢測(cè)結(jié)果上有些差異。所以煙曲霉跟黃曲霉它的釋放就比較低，土曲霉跟黑曲霉和構(gòu)巢曲霉就釋放比較高，所以你在考慮這個(gè)結(jié)果的時(shí)候你要考慮可能跟曲霉的種不一樣有關(guān)系。同樣GM試驗(yàn)也有假陰性的，假陽性的情況也很多，你比如使用了半合成的青霉素特別是國外用得研究比較多的是哌拉西林，他唑巴坦，用這個(gè)藥可以引起假陽性。當(dāng)然還有包括阿莫西林克拉維酸，另外它和常用的其他細(xì)菌和真菌曾經(jīng)有交叉，另外如果腸道里有定植的曲霉，我們吃一些真菌的植物，可能會(huì)有一些釋放到血里面，另外谷物和大豆里面也會(huì)有這個(gè)GM。另外接受了白蛋白、免疫球蛋白和營養(yǎng)液的，比如說高營養(yǎng)的一些營養(yǎng)液的治療都可能出現(xiàn)假陽性。血透，接受心肺移植的，這個(gè)心肺旁路就是在外面轉(zhuǎn)機(jī)的，自身免疫性疾病都可能有陽性。新生和兒童假陽性達(dá)到83%。所以特GM不太建議在兒童和新生兒展開，是因?yàn)樾律鷥和阅蹋@些奶都有雙歧桿菌，會(huì)跟這個(gè)G，GM試驗(yàn)發(fā)生交叉反應(yīng)。假陰性是比如說我可以出現(xiàn)前帶現(xiàn)象這是一個(gè)很著名的的免疫球的帶現(xiàn)象，帶現(xiàn)象，就是你這個(gè)你查的是這個(gè)抗原，是這個(gè)半乳甘露聚糖和抗原。當(dāng)然如果你抗原太多就是你整個(gè)的試劑里面抗原太多，會(huì)出現(xiàn)這樣一個(gè)前帶現(xiàn)象。另外就是說你釋放入血的半乳甘露它不持續(xù)很快就被清除了，那這個(gè)時(shí)候你查不出來了。另外使用抗真菌藥就兩性霉素B、三唑類的它都能夠抑制菌絲的生長，減少GM釋，釋放。另外局部感染，或者這個(gè)你整個(gè)這個(gè)致病菌的這個(gè)菌絲比較少，都可能出現(xiàn)假陰性的結(jié)果。另外在非粒缺病人，就是不是粒細(xì)胞缺乏所引起的曲霉菌感染的病人當(dāng)中可能會(huì)有假陰性的情況。原因還不是很清楚，但這是個(gè)現(xiàn)象。那下面是個(gè)病例，男性59歲，因?yàn)榧毙园籽『头窝鬃≡海驗(yàn)檎T導(dǎo)化療后出現(xiàn)粒缺、高燒、肺炎加重，這是肺炎，兩肺下都是一個(gè)致密影子，胃癌很厲害。G試驗(yàn)是271高了，GM是1.67也很高了。當(dāng)然這里面肯定考慮是一個(gè)曲霉的肺炎了，那最后進(jìn)行活檢，組織活檢可以看到這個(gè)，像麥子型的這樣分杈的煙曲霉，煙曲霉。確診。由于這個(gè)COPD是慢阻肺了，近年來我們發(fā)現(xiàn)慢阻肺并發(fā)侵襲性肺曲霉菌報(bào)道越來越多。國外有人報(bào)道過說你住院前三個(gè)月和住院后到分離出曲霉的時(shí)間，這段時(shí)間當(dāng)中如果你累計(jì)使用激素超過700毫克強(qiáng)的松，那就可能會(huì)發(fā)生曲霉感染。另外入住ICU，慢性心衰，那還有在入院前三個(gè)月你接受抗菌治療都可能成為慢阻肺發(fā)生肺曲霉菌病的這個(gè)獨(dú)立的一個(gè)因素。另外，器械通氣、侵入性操作跟低蛋白血癥也可能會(huì)使得慢組織的病人繼發(fā)出現(xiàn)了侵襲性曲霉病。所以現(xiàn)在國內(nèi)外對(duì)于慢阻肺的病人發(fā)生真菌的肺炎是高度重視。這是一個(gè)病例。一個(gè)男性59歲，有慢性咳嗽十年，受涼后憋重喘憋加重，高燒3天住院。住院后痰里發(fā)現(xiàn)有這個(gè)真菌的孢子跟菌絲，兩次的GM試驗(yàn)都是陽性，一個(gè)是0.89，一個(gè)是3.5，參考范圍是0.5以下。這是GMI的指數(shù)。1次試驗(yàn)可疑是16.8，參考范圍是小于10，這是比濁法做的。（ppt52）我們看CT，兩個(gè)地方都有這種結(jié)節(jié)性的和支氣管擴(kuò)張，經(jīng)過肺活檢我們發(fā)現(xiàn)里面有曲霉的菌絲和炎癥細(xì)胞的浸潤，所以這是一個(gè)很典型的在慢阻肺的基礎(chǔ)上發(fā)生的真菌性肺炎?，F(xiàn)在對(duì)于這個(gè)GM研究的比較多的實(shí)際上因?yàn)樗禺愋院芨摺ＵJ(rèn)為它敏感度波動(dòng)比較大，因?yàn)槟憧从行﹪馕墨I(xiàn)敏感度從29%到100%。為什么會(huì)有這種波動(dòng)性大，敏感度在不同的文獻(xiàn)報(bào)道的波動(dòng)大，有的作者認(rèn)為有原因。第一個(gè)就是曲霉的生長和抗原的釋放與周圍的環(huán)境營養(yǎng)條件PH值有關(guān)。如果營養(yǎng)充分在7.5，真菌可以持續(xù)生長釋放GM。但是如果說炎癥的發(fā)展受到抑制，因?yàn)闂l件改變了營養(yǎng)不了，PH值偏酸了，那真菌受到抑制，GM就會(huì)減少，所以說在一個(gè)病人可能檢查的不同期的時(shí)候它的結(jié)果是不一樣。另外還跟單克隆這個(gè)關(guān)聯(lián)的抗原暴露有關(guān)系。EB-A2單康是否和表面抗，抗抗原的表面決定簇識(shí)別的結(jié)合是影響這個(gè)方法學(xué)敏感性的重要原因了，有一個(gè)病人它是確診了曲霉沒有問題。用ELISA方法檢測(cè)的支氣管肺泡灌洗液是陽性，但是血清這是陰性。就是說研究者認(rèn)為血液里面肯定有這個(gè)這個(gè)這個(gè)這個(gè)抗原存在，但是查不到是因?yàn)檫@個(gè)抗原和血液中的某些物質(zhì)結(jié)合了，結(jié)合之后把它屏蔽起來了，所以單抗就沒法去識(shí)別。另外就是說你宿主的抗真菌治療，也是決定這個(gè)實(shí)驗(yàn)這個(gè)靈