中國(guó)人乙醛脫氫酶2基因多態(tài)性的基因芯片檢測(cè)方法,醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)論文

中國(guó)人乙醛脫氫酶2基因多態(tài)性的基因芯片檢測(cè)方法,醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)論文硝酸甘油作為治療心絞痛的基本藥物之一廣泛用于臨床。研究發(fā)現(xiàn)硝酸甘油的舒血管作用通過(guò)釋放一氧化氮(NO)所介導(dǎo)。乙醛脫氫酶2(ALDH2)具有硝酸酯酶活性，對(duì)硝酸甘油轉(zhuǎn)化產(chǎn)生NO起了關(guān)鍵作用，而ALDH2基因Glu504Lys多態(tài)性，會(huì)導(dǎo)致ALDH2硝酸酯酶活性顯著下降，使硝酸甘油無(wú)效概率明顯上升(14．9%vs42．4%)。文獻(xiàn)建議，AL-DH2504Lys等位基因攜帶患者慎用硝酸甘油。ALDH2(504Lys)等位基因在歐美人群中攜帶率極低，但在中國(guó)人群中攜帶率較高，部分人群攜帶率高達(dá)30%。因而，在中國(guó)人群中檢測(cè)ALDH2(Glu504Lys)基因多態(tài)性具有積極的現(xiàn)實(shí)意義。本文研究建立了ALDH2(Glu504Lys)基因多態(tài)性檢測(cè)方式方法，以知足臨床檢測(cè)需求。1儀器和試劑PCR儀［BioerTC-96/G/H(b)，杭州博日科技有限公司］;離心機(jī)(飛鴿TGL-16GB上海安亭科學(xué)儀器廠);紫外分光光度計(jì)(onedrop1000，上海諾晶生物有限公司);點(diǎn)樣儀(GSM417，Affymetrix);生物芯片全自動(dòng)雜交儀(BR-526，上海百傲科技股份有限公司);生物芯片識(shí)讀儀(BE-2．0，上海百傲科技股份有限公司);基因芯片圖像分析軟件(Arraydoctor2．0，上海百傲科技股份有限公司);凝膠電泳儀(PowerBC-600BC，上海博彩生物科技有限公司)，凝膠成像系統(tǒng)(BioshineGelx1520，上海鷗翔生物有限公司)。DNA提取試劑盒(BST01051，上海百傲科技股份有限公司);雜交顯色試劑盒(BST03021，上海百傲科技股份有限公司);醛基修飾的載玻片(BSM03011，上海百傲科技股份有限公司);應(yīng)用PrimerPremier5．0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)引物:5＇Biotin-AAGACTTT-GGGGCAATACAG3＇，3＇CTTCTCAGGCTTAAAATGGG5＇;質(zhì)控寡核苷酸:5＇Biotin-ACATCCTCTGGATGATGT-GAGACCATGCGGAGCCCCTCCACG3＇，2條檢測(cè)探針:野生型5＇(T)16CAGGCATACACTGAAGTGAAAA3＇，突變型5＇(T)16GCAGGCATACACTAAAGTGAAAACT3＇，1條質(zhì)控探針:5＇NH2-(T)16GGTCTCACATCATCCAGAGGATGT3＇(上海生工生物工程服務(wù)有限公司);Taq酶，10buffer［天根生化科技(北京)有限公司］;dNTP(上海生工生物工程服務(wù)有限公司);EDTA抗凝外周靜脈血樣本(上海市第一人民醫(yī)院贈(zèng)送);膽紅素(CAS#35-65-4，上海源葉生物有限公司);膽固醇(CAS#57-88-5，99%，上海將來(lái)實(shí)業(yè)有限公司);三酰甘油(CAS#538-24-9，上海將來(lái)實(shí)業(yè)有限公司)。2、方式方法與結(jié)果2．1臨床樣本EDTA抗凝外周靜脈血樣本(上海市第一人民醫(yī)院、長(zhǎng)征醫(yī)院、華東醫(yī)院)，不分病種、檢測(cè)目的、性別、年齡，只要知足雙向測(cè)序和芯片檢測(cè)對(duì)樣本量要求即可入選。2．2樣本處理對(duì)EDTA抗凝外周靜脈血樣樣本，用DNA純化試劑盒(上海百傲科技股份有限公司)提取全基因組DNA。DNA濃度為10～60ngl－1，A260/A280的比值在1．5～2．0。取已純化的DNA3．0l作為擴(kuò)增模板，參加上游引物(10pmoll－1)、下游引物(3．3pmoll－1)各1．0l，Taq酶(2．5Ul－1)1．0l，10buffer2．5l，dNTP(各2．5mmolL－1)2．5l，雙蒸水14l，反響總體積25l。PCR反響條件為:50℃5min;94℃5min;94℃25s，60℃25s，72℃30s，35cycles;72℃5min;PCR產(chǎn)物4℃保存。2．3ALDH2基因芯片的制備將探針用少量純水溶解制備高濃度溶液，分別用2點(diǎn)樣緩沖液配制各探針的點(diǎn)樣液，將各點(diǎn)樣液根據(jù)要求依次參加到384孔板中。使用醛基修飾基片作為ALDH2基因多態(tài)性檢測(cè)芯片制造的固相支持物。采用GSM-417生物芯片點(diǎn)樣儀，根據(jù)設(shè)計(jì)的陣列圖1的點(diǎn)陣排布，進(jìn)行點(diǎn)樣。點(diǎn)樣后置于恒溫箱中固定，避光保存。點(diǎn)樣時(shí)，環(huán)境溫度在18-26℃，相對(duì)濕度為45%～65%。探針點(diǎn)樣濃度為:5molL－1。將點(diǎn)好的芯片置于室溫過(guò)夜固定。2．4雜交檢測(cè)在BaiOe-Hyb全自動(dòng)雜交儀按表1設(shè)置反響程序，按表要求用量分裝雜交顯色試劑盒各試劑。汲取150l雜交液，分別參加包含上述兩個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物各10L，混勻。并將各試劑放入指定位置內(nèi)，運(yùn)行程序，雜交顯色反響自動(dòng)進(jìn)行。雜交完成后，將芯片顯色區(qū)用蒸餾水稍微沖洗、烘干，將芯片放入BE-2．0生物芯片識(shí)度儀中進(jìn)行掃描，獲得的芯片雜交結(jié)果圖像，用基因芯片圖像分析軟件(Arraydoctor2．0，上海百傲科技股份有限公司)提取各點(diǎn)的信號(hào)強(qiáng)度，輸入基因判型的閾值，由軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，輸出芯片檢測(cè)的基因型結(jié)果。2．5ALDH2顯色基因芯片性能評(píng)價(jià)2．5．1芯片檢測(cè)靈敏度選取經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證ALDH2基因型為L(zhǎng)ys504Lys的樣本，提取基因組DNA，濃度調(diào)整為50ngl－1，進(jìn)行梯度稀釋。將每個(gè)稀釋度DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增并與芯片雜交，以重復(fù)三次檢測(cè)判型結(jié)果均正確的最低DNA量為檢出限。經(jīng)試驗(yàn)確定檢出限為5ng基因組DNA。2．5．2芯片檢測(cè)準(zhǔn)確度選取3種ALDH2基因型的濃度為50ngl－1基因組DNA，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增并與芯片雜交。結(jié)果3種基因型樣本檢測(cè)結(jié)果均正確。2．5．3芯片檢測(cè)特異性取魚精DNA稀釋至接近于正常人基因組DNA抽提濃度(20ngl－1)作為陰性對(duì)照進(jìn)行PCR擴(kuò)增并與芯片雜交。檢測(cè)結(jié)果為陰性。2．5．4芯片檢測(cè)重復(fù)性選取ALDH2基因型為L(zhǎng)ys504Lys的濃度為25ngl－1基因組DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并與芯片雜交，每個(gè)樣本重復(fù)檢測(cè)10次。10次檢測(cè)結(jié)果基因型均一致。2．6ALDH2顯色基因芯片干擾實(shí)驗(yàn)取2-8℃保存不超過(guò)5d的三種ALDH2基因型別(ALDH2Glu504Glu編號(hào):H1;ALDH2Glu504Lys編號(hào):H2;ALDH2Lys504Lys編號(hào):H3)的EDTA抗凝外周全血樣本，每種樣本分成5份，1份不加干擾物作為空白對(duì)照(編號(hào):空)，1份參加3000mgdl－1三酰甘油(編號(hào):G)，1份參加250mgdl－1膽固醇(編號(hào):Ch)，1份參加20mgdl－1膽紅素(編號(hào):Bi)，1份完全溶血(編號(hào):He)。根據(jù)血液基因組DNA提取方式方法提取上述樣本血液基因組DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增并與芯片雜交檢測(cè)基因型，每種樣本重復(fù)2次，H3基因型的樣本量較少，只操作1次。研究結(jié)果顯示，含有上述干擾物質(zhì)的血樣，經(jīng)DNA提取后，DNA的濃度和純度與正?？瞻籽獦酉啾龋瑳](méi)有顯著差異，經(jīng)PCR擴(kuò)增及基因芯片雜交檢測(cè)，結(jié)果正常并與已經(jīng)知道基因型一致。因而EDTA抗凝全血樣本中含有3000mgdl－1的三酰甘油，250mgdl－1的總膽固醇，20mgdl－1的膽紅素，對(duì)ALDH2基因芯片測(cè)定沒(méi)有影響，完全溶血的EDTA抗凝全血對(duì)測(cè)定也沒(méi)有影響。2．7ALDH2顯色基因芯片精致細(xì)密度實(shí)驗(yàn)選擇3種ALDH2基因型已經(jīng)知道(雙向測(cè)序)的樣本，每個(gè)樣本分成三份，分別送三個(gè)參加臨床實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室用申報(bào)試劑盒測(cè)定。每個(gè)實(shí)驗(yàn)室采用三個(gè)批號(hào)的試劑盒，每個(gè)批號(hào)試劑對(duì)每個(gè)樣品由同一實(shí)驗(yàn)室的三名檢驗(yàn)員各測(cè)定三次。根據(jù)正確測(cè)定結(jié)果占總測(cè)定結(jié)果的百分率計(jì)算試劑盒產(chǎn)品的批內(nèi)，批間精致細(xì)密度和差異。精致細(xì)密度實(shí)驗(yàn)共獲得243個(gè)檢測(cè)結(jié)果。243個(gè)檢測(cè)結(jié)果與已經(jīng)知道基因型均符合。以定性結(jié)果評(píng)價(jià)，批內(nèi)批間均無(wú)差異。2．8ALDH2顯色基因芯片方式方法比對(duì)實(shí)驗(yàn)將基因芯片檢測(cè)結(jié)果與雙向測(cè)序法檢測(cè)結(jié)果比擬，評(píng)價(jià)ALDH2顯色基因芯片方式方法臨床適用性。選擇三家醫(yī)療機(jī)構(gòu)實(shí)驗(yàn)室，共獲得1035份來(lái)自臨床檢驗(yàn)的EDTA抗凝血樣。將選取的臨床病人檢測(cè)樣本一分為二，一份直接送交選定的基因測(cè)序機(jī)構(gòu)對(duì)樣本基因組DNA中ALDH2基因的Glu504Lys位點(diǎn)進(jìn)行雙向測(cè)序;一份進(jìn)行芯片檢測(cè)。芯片檢測(cè)或測(cè)序不成功的樣本予以剔除。方式方法比對(duì)研究數(shù)據(jù)見(jiàn)表2，共獲得1026個(gè)基因芯片檢測(cè)結(jié)果和1012份雙向測(cè)序結(jié)果。樣本存在3種ALDH2基因型如此圖2所示。經(jīng)統(tǒng)計(jì)有1009份樣本基因芯片檢測(cè)結(jié)果和基因測(cè)序結(jié)果均完好，比對(duì)分析，有1007份基因型檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序結(jié)果完全一致，有2份樣本結(jié)果不一致，芯片檢測(cè)結(jié)果為ALDH2(G/G)型，測(cè)序結(jié)果為(G/L)型。經(jīng)實(shí)驗(yàn)分析，可能的原因是樣本DNA提取失敗，濃度低于檢出限所致。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，測(cè)試試劑盒臨床檢測(cè)的檢出率為:99．13%(1026/1035);正確率為:99．80%(1007/1009)。2．9ALDH2顯色基因芯片穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取制備好的ALDH2基因芯片24片及配套的PCR擴(kuò)增及雜交顯色試劑，置于－20℃冰箱長(zhǎng)期儲(chǔ)存，分別于0，1，3，6，12，18個(gè)月取出3片，用新鮮ED-TA抗凝血樣提取的濃度稀釋至8ngl－1的雜合DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增并與芯片雜交，結(jié)果與新制備的ALDH2基因芯片及配套的PCR擴(kuò)增及雜交顯色試劑檢測(cè)結(jié)果比擬。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，ALDH2顯色基因芯片及其配套試劑，在－20℃儲(chǔ)存18個(gè)月，檢測(cè)靈敏度沒(méi)有明顯變化，具有良好穩(wěn)定性。3、討論3．1芯片設(shè)計(jì)臨檢用基因芯片的設(shè)計(jì)包括探針構(gòu)造的設(shè)計(jì);質(zhì)控探針的考慮;探針濃度的選擇;陣列排布的設(shè)計(jì)等。在探針構(gòu)造設(shè)計(jì)上，為便于探針固定在醛基基片上，探針的5＇端進(jìn)行氨基修飾;為保證探針與擴(kuò)增產(chǎn)物雜交反響的充分性，減小反響的空間位阻，在探針與氨基之間還能夠包含一段5～25聚的聚脫氧胸苷酸。質(zhì)控探針的設(shè)置應(yīng)當(dāng)以到達(dá)質(zhì)量控制目的為原則。本研究基因芯片設(shè)置的質(zhì)控探針能夠同時(shí)起到陽(yáng)性質(zhì)控探針和化學(xué)修飾探針的作用。該探針與檢測(cè)探針一樣只進(jìn)行了5＇氨基修飾，在基片上的固定效果能夠反映探針修飾質(zhì)量;同時(shí)該探針只與反響體系中外加的帶有生物素標(biāo)記的靶標(biāo)(質(zhì)控寡核苷酸)發(fā)生特異性雜交反響，該反響只與雜交經(jīng)過(guò)相關(guān)，故可用于監(jiān)控雜交經(jīng)過(guò)的質(zhì)量。鑒于芯片是用于人染色體基因檢測(cè)，能夠不設(shè)置陰性對(duì)照探針和內(nèi)對(duì)照探針。使用本芯片時(shí)，需用陽(yáng)性對(duì)照品和陰性對(duì)照品建立嚴(yán)格反響條件，并定期重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)來(lái)控制芯片雜交的特異性。對(duì)于芯片陣列的設(shè)計(jì)，必須考慮有助于克制點(diǎn)樣誤差、實(shí)驗(yàn)偏差、軟件自動(dòng)分析結(jié)果時(shí)可能出現(xiàn)誤判的各種可能。通常將陽(yáng)性對(duì)照探針按一定規(guī)則排布，便于軟件自動(dòng)對(duì)陣列的定位、尋點(diǎn)、采集信號(hào)。每個(gè)探針點(diǎn)的重復(fù)次數(shù)最好不少于3次，取平均值可克制點(diǎn)樣誤差。本研究每個(gè)探針重復(fù)6次，穿插排列，除有利于克制點(diǎn)樣誤差，還可發(fā)現(xiàn)由于實(shí)驗(yàn)偏差導(dǎo)致的信號(hào)不均勻分布導(dǎo)致的誤判。3．2芯片性能評(píng)價(jià)基因芯片檢測(cè)技術(shù)操作簡(jiǎn)便、可快速、準(zhǔn)確、高通量的分析數(shù)以千計(jì)的基因組信息，非常合適于常規(guī)臨床檢驗(yàn)。評(píng)價(jià)基因芯片性能的方式方法和指標(biāo)必須與實(shí)際應(yīng)用相對(duì)應(yīng)。臨床檢驗(yàn)關(guān)心的性能指標(biāo)主要包括:準(zhǔn)確性、靈敏性、特異性、重復(fù)性、抗干擾性、穩(wěn)定性等。評(píng)價(jià)上述指標(biāo)時(shí)，應(yīng)當(dāng)使用真實(shí)的臨床樣本，而不建議使用質(zhì)粒。質(zhì)粒比基因組小很多，比擬純，試驗(yàn)結(jié)果與真實(shí)樣本差異很大。在評(píng)價(jià)靈敏性時(shí)，宜選擇雜合型樣本。同等濃度下與純合子相比，雜合型樣本等位基因的拷貝數(shù)減半，對(duì)擴(kuò)增的影響更大。評(píng)價(jià)重復(fù)性時(shí)，選擇中等濃度DNA更有代表性。3．3測(cè)定結(jié)果分析文獻(xiàn)報(bào)道，ALDH2504Lys等位基因在歐美人群中攜帶率極低，但在中國(guó)漢族人群中的攜帶率17%～