實時熒光定量PCR技術

實時熒光定量PCR技術的研究進展及其在水產養(yǎng)殖中的應用M140101006高金偉摘要：實時熒光定量PCR的是繼常規(guī)PCR之后分子生物學方法學研究的一大飛躍，具有特異性強、靈敏度高、重復性好、定量準確、自動化程度高、速度快、全封閉反應等優(yōu)點，在人類和動物疾病的快速檢測、食品安全檢測、定量分析、基因分型、基因表達研究、以及疫苗效力測定中廣泛應用，已成為分子生物學研究的重要工具。本文從實時熒光定量PCR技術的原理、熒光標記技術、定量方法以及實時熒光定量PCR技術在水產養(yǎng)殖研究領域的應用現狀作了一個綜述。關鍵詞：熒光定量；PCR；熒光標記；水產養(yǎng)殖實時熒光定量PCR技術(Real-timefluorescentquantitativePCR,real-timeFQ-PCR)是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。實時熒光定量PCR是在普通PCR定性技術基礎上發(fā)展起來的核酸定量技術。在熒光定量PCR技術發(fā)展的過程中，兩個重要的發(fā)現起著關鍵的作用：一是TaqDNA多聚酶的5'端核酸外切酶活性被發(fā)現，它能降解特異性熒光標記的探針，使得間接檢測PCR產物成為可能；另一個是熒光雙標記探針被使用在一密閉的反應管中能實時地監(jiān)測反應全過程。在1996年由美國AppliedBiosystems公司推出了一種實時熒光定量PCR技術，它是利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應中每一個循環(huán)擴增產物量的變化，通過Ct值和標準曲線的分析對起始模板進行定量分析［1］。該技術不僅實現了PCR從定性到定量檢測的飛躍，而且所有反應均在同一溶液中進行，不需任何后處理過程，具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高、能實現多重反應、定量結果具實時性和準確性等特點［2］。目前已得到廣泛應用，包括對mRNA表達的研究、各種基因定量分析、點突變分析和等位基因分析、單核苷酸多態(tài)性分析、DNA甲基化的檢測及對各種傳染病進行定量定性分析。1實時熒光定量PCR技術原理實時熒光定量PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。工作原理在常規(guī)PCR基礎上添加了熒光染料或熒光探針。而用于常規(guī)PCR的專門熱循環(huán)儀配備熒光檢測模塊，可監(jiān)測擴增時的熒光。熒光染料能特異性摻入DNA雙鏈，發(fā)出熒光信號，而不摻入雙鏈中的染料分子不發(fā)出熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產物增加完全同步。熒光探針法是指當標記在探針的5'端熒光報告基團(reporterR)未被標記在3’端淬滅基團(quencherQ)抑制時，可檢測到報告基團的熒光信號。檢測到的熒光信號的強度與PCR反應產物的量成正相關，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物的形成完全同步。定量原理實時熒光定量PCR是在反應體系中加入熒光基團，使產物的數量與檢測到的熒光強度成線性關系，從而得出產物的擴增曲線。擴增曲線有指數增長期和非指數平臺期2個階段。在指數增長階段，每個循環(huán)PCR產物量大約增加一倍。然而隨著反應的進行，反應體系組成成分的消耗，反應進入平臺期(28~40個循環(huán))。只有在熒光信號擴增期PCR產物量的對數值與起始模板量之間存在線性關系，可以在指數期的某一點上來檢測PCR產物的量，并由此推斷模板最初的含量。設定一定的熒光信號的域值(threshold)。如果檢測到熒光信號超過域值，就被認為是真正的信號，它可用于定義樣本的域值循環(huán)數Ct(C代表循環(huán)cycle,t代表域值threshold）［3］oCt值的含義是:每個反應管內的熒光信號達到設定的域值時所經歷的循環(huán)數。研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系，起始拷貝數越多，Ct值越小。公式表示：Ct=-klogX0+b（X0指原始模板數）。利用已知起始拷貝數的標準品可做標準曲線，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。2實時熒光定量PCR熒光標記技術實時熒光定量PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。探針類熒光標記物是利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴增產物的增加，熒光染料是利用其它的一些理化特征指示擴增產物的增加。前者因增加了探針的識別步驟，特異性更高；后者的優(yōu)點是簡便易行。熒光標記探針按其基團標記和能量轉移的方式,目前已經開發(fā)出幾種相關的技術,大體可以分為水解探針和雜交探針兩類。TaqManTM探針（水解探針）、TaqManMGB（水解探針）、Dual-oligoFRETpairs（雙雜交探針）、MolecularBeacons（雜交探針）、ScorpionsTM/AmplifluorTM（雜交探針）、Universalprobelibrary-LNA（lockednucleicacids水解探針）、LUX（雜交探針）、Simpleprobe探針等［4］。水解探針TaqManTM及TaqMan系歹1」探針TaqManTM探針的長度為20~24bp,在其5’末端標記一個熒光報告基團，3’末端標記一個熒光淬滅基團，其序列與兩引物包含序列內的一段DNA模板完全互補。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收。TaqManMGB探針是在TaqMan探針的基礎上改進的，長度可縮短到13bp,在探針的3'端增加了MGB（minorgroovebinder）分子，能夠結合雙鏈DNA小溝部位，配對更容易，且節(jié)約了成本；MGB提高了探針的Tm值，能夠分辨1個堿基的差別（完全配對才有熒光信號）；連在MGB分子后的是非熒光物質的淬滅基團，這種探針淬滅效果更好、無背景熒光、熒光標記靈活、提高熒光信號的信噪比等優(yōu)點。TaqMan-分子信標（TaqMan-MB）是在分子信標及TaqMan探針的基礎上設計的一種更好、無背景熒光、熒光標記靈活、提高熒光信號的信噪比等優(yōu)點。TaqMan-分子信標（TaqMan-MB）是在分子信標及TaqMan探針的基礎上設計的一種均相熒光檢測探針，該探針保留了分子信標的莖環(huán)結構,有效解決了背景熒光的問題,不同在于除環(huán)部序列外,其5’端的臂序列有基因識別位點［4］。當進行PCR擴增時，每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物的形成完全同步［3］。常用的熒光基團是FAM、TET、HEX、TAMRA等［5］。Universalprobelibrary-LNA探針Universalprobelibrary-LNA（lockednucleicacids）是一種雙RNA聚合的類似物，其2’-O,4’-C形成亞甲基的橋鍵,這個連接限制了呋喃核糖環(huán)的靈活性,因而將其結構鎖定成一個剛性的雙環(huán)模式,因此而提高雜交效率和優(yōu)越的穩(wěn)定性。在5’端和3’端分別標記上熒光報告基團與熒光淬滅基團,單體摻入寡核苷序列可以增加形成體的Tm值,其穩(wěn)定性比PNA高（PNAS2000,97:563325638）因LNA與DNA雜交較DNA與DNA、DNA與RNA甚至PNA與DNA雜交有更高的親和性,故這種探針穩(wěn)定性最好；而且探針實現了設計迅速簡單、低成本的水解探針特點［6］。cycling探針cycling探針是一種由DNA、RNA構成的雜合探針，與RNaseH組合使用，內部含有RNA堿基,5’端和3’端分別標記熒光物質與淬滅物質。探針完整時,熒光淬滅作用抑制熒光物質發(fā)出熒光。當探針與擴增產物中的互補序列雜交，RNaseH切斷探針的RNA部分，淬滅作用解除,熒光物質發(fā)出熒光［7］。雜交探針分子信標技術分子信標(molecularbeacon)技術是一種在游離狀態(tài)下呈莖-環(huán)結構(stem-loopstructure)的雙標記寡核苷酸探針，是TaqMan探針的衍生形式。環(huán)形部分可與靶DNA序列互補，一般為15~30bp；莖部核苷酸互補，但與靶DNA無序列同源性，一般5~7bp。在3'和5‘端即莖環(huán)結構兩條臂的末端分別標記熒光基團和淬滅基團。探針游離時呈發(fā)夾結構，兩端的熒光基團緊密相鄰熒光信號被淬滅；在PCR變性后復性階段，分子信標與模板雜交，從而打開發(fā)卡結構形成FRET，淬滅基團的抑制作用被解除，釋放出熒光信號，熒光的強度與溶液中分子信標的量成正比，也與被擴增的模板量相對應，從而實現了對目的基因的定量檢測［8］。該方法優(yōu)點是靈敏度高、特異性強、熒光背景低，其缺點是設計要求高、雜交探針不能完全與模板結合、穩(wěn)定性較差、探針合成的時候標記較復雜。常用的熒光基團有FAM和TexasRed。2.1.2.2雙雜交探針雙雜交探針(Dual-oligoFRETpairs)又稱為FRET探針或者LightCycle探針，采用兩條相鄰(距離1~5bp)、與模版互補的特異探針和一對序列特異性引物。第一個探針3’端帶有熒光供體，第二個探針的5’端帶有熒光受體。在3’端用熒光激發(fā)供體基團,在毗鄰探針5’端受體基團處實施熒光信號監(jiān)測。在PCR反應變性后退火，探針頭尾相連地雜交在靶標序列上，因此兩基團靠近，從供體到受體產生FRET發(fā)出熒光，受體熒光信號的增加與擴增子出現的量成比例［9］。檢測時只檢測受體基團發(fā)出的熒光；變性時，兩探針游離，兩基團距離遠，不能檢測到熒光。該方法淬滅效率高，兩條探針均與目的基因特異性結合才能檢測到受體基團發(fā)出的熒光，檢測的特異性增加。熒光淬滅的程度與起始模板的量成反比，以此可以進行PCR定量分析。但兩個探針結合于模板上影響擴增效率，合成兩個探針，成本相對較高。常用的熒光基團：LC-Red640和LC-Red705［10］。復合探針法該法結合了分子信標和LightCycler兩種技術的優(yōu)點，為使用非熒光淬滅劑，本底低，對擴增效率影響小，探針設計、合成、標記、純化方便，是我國研究和開發(fā)的一種新型定量PCR技術。該技術的特點是先合成熒光探針后合成淬滅探針，熒光探針(25bp)5’端標以熒光報告基團，而淬滅探針(15bp)3'端標以熒光淬滅基團，淬滅探針能與熒光探針5’端雜交，吸收熒光信號［8］。當反應中無模板時，兩探針結合形成復合探針，熒光探針發(fā)出的熒光被淬滅探針吸收，無熒光產生；當反應溶液中有模板時，在PCR復性階段熒光探針優(yōu)先與模板結合，兩探針分離，產生熒光，其強度與PCR體系中模板數量成正比，可進行PCR定量［9］。2.1.3熒光標記引物熒光引物法是從分子信標的概念變化而產生的一種聯合分子探針系統，它是把熒光基團標記的發(fā)夾結構的序列直接與PCR引物相結合，從而使熒光標記基團直接摻入PCR擴增產物中。目前主要有Amplifluor,Sunrise,Amplisensor,Scorpion,LUX(lightuponextent-ion)等。2.1.4其他探針Simple探針和神標熒光探針。Simple探針只在5’端標有報告熒光，在報告熒光和5’端之間連接一種“l(fā)inker”結構，當在高溫條件下，"linker”結構改變，釋放熒光。這種探針的優(yōu)點是不用淬滅基團，無背景熒光。神標熒光探針是AlleLogic公司新發(fā)明的一種熒光探針。該探針操作簡單、成本低，效果比常規(guī)TaqMan探針增加60%，試驗設備無需更換。它不需要熒光淬滅基團，是在單一鏈DNA序列上多重標記恰當的、易處理的熒光染料［11］。雙鏈DNA(dsDNA)結合染料目前用于實時PCR的主要dsDNA結合染料SYBRGreenI是一種非飽和菁類熒光素，可以嵌合于DNA雙鏈結構的小溝中，發(fā)射熒光信號；而不摻入鏈中的染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。結合dsDNA后熒光強度的增加與初始模板量相關，可以進行定量DNA分析。SYBRGreenI染料法與探針法相比，其檢測方法更簡便，同時降低了成本。但該染料能夠結合任何dsDNA分子，特異性差；對PCR有一定的抑制性，且熒光強度低，穩(wěn)定性差。目前已針對SYBRGreenI的缺點開發(fā)了一些改進染料，如SYBRGreenER、PowerSYBR等可以通過優(yōu)化PCR的反應條件，減少或去除非特異性產物和引物二聚體的產生，另外，也可以借助融解曲線分析法來區(qū)分非特異性產物和引物二聚體而進行定性診斷。3實時熒光定量PCR技術的幾種定量方法標準曲線法的絕對定量絕對定量FQ-PCR一般用一系列已知濃度的標準品制作標準曲線，在相同的條件下目的基因測得的熒光信號量同標準曲線進行比較，從而得到目的基因的量［12］。該標準品可以是純化的質粒DNA、PCR擴增產物、體外轉錄的RNA或者是化學合成的目的基因。標準品的量可根據260nm的吸光值并用DNA或RNA的分子量來轉換成其拷貝數確定。將標準品進行梯度稀釋，并以此為模板進行PCR反應。以標準品拷貝數的對數值為橫坐標，以測得的CT值為縱坐標，繪制標準曲線。通過此標準曲線與被測樣品的CT值，即可對樣品進行定量。該法優(yōu)點是穩(wěn)定、準確。如果想要明確得到樣本的初始濃度或病毒載量，則使用絕對定量法最佳。無參照基因法的相對定量在該方法同時擴增待測靶基因片段和一個內源性管家基因片段，測得兩者的CT值之差。CT)，不需要標準曲線，而是運用數學公式來計算相對量，前提是假設每個循環(huán)增加一倍的產物數量，在PCR反應的指數期得到CT值來反映起始模板的量，1個循環(huán)(CT=1)的不同相當于起始模板數2倍的差異。比較不同待測標本的△CT值與正常標本的△CT值的變化，即可對待測標本靶基因的原始拷貝數作出判斷，進而診斷出待測標本的病理狀況。該法得出的結果也是目的基因同管家基因的比值。但是此方法以靶基因和管家基因的擴增效率基本一致為前提，效率的偏移將影響實際拷貝數的估計。以參照基因為標準的相對定量該法能準確的量化初始材料的載量，檢測的結果是目的基因與參照基因的比值，只要參照基因恒定，比值的變化也就反映了目的基因的變化。由于結果是一個相對值，所以只需知道標準品的稀釋梯度即可。此法的關鍵是選取參照基因，由于管家基因通常恒定表達且表達水平不易受外界實驗條件影響，所以常作為參照基因，來衡量不同來源基因的表達量。常用的管家基因有B-actin、B2-微球蛋白、3-磷酸甘油醛脫氫酶等(GAPDH)、18SrRNA等。該管家基因主要是用于核苷酸的拷貝數的比較、顯示反應體系內是否存影響PCR擴增的因素以及彌補樣本組織量的差異。目前有2-A△CT(Livak)方法、用參照基因的△CT法進行相對定量的方法。4Real-timePCR技術在水產養(yǎng)殖研究中的應用病原體定量檢測Real-timePCR技術最有價值的應用領域就是臨床診斷。該技術可以快速、準確檢測出高至101低至100個拷貝的病原體，定量檢測范圍極寬。目前該技術已廣泛應用于水產養(yǎng)殖疾病(包括細菌、病毒等)的診斷，為預防和控制水產養(yǎng)殖動物的疾病提供了重要的技術支持。王忠發(fā)等［13］應用TaqMan探針技術建立了一種快速、特異、靈敏的實時熒光定量PCR檢測對蝦WSSV的方法。其靈敏度超過標準方法的101-105倍，特異性與標準方法100%吻合。檢測時間為標準方法的1/24。張利峰等［14］運用探針技術建立了快速檢測鯉春病病毒癥(SpringViraemiaofCarp,SVC)的熒光實時定量RT-PCR技術，并應用該技術對病魚的組織臟器中的病毒分布和病毒量進行了分析。結果發(fā)現，該病毒在腸、腎和鰓組織的含量最高，肌肉、腦組織次之?；虮磉_研究Real-timePCR技術在水產養(yǎng)殖領域的另一個重要的應用就是特定基因表達水平的研究，即水產養(yǎng)殖動物生理變化相關的細胞因子的轉錄水平的評估。目前檢測細胞因子表達變化的方法很多，但是由于傳統的蛋白質檢測方法（如ELISA）靈敏度較低，常規(guī)PCR方法檢測mRNA無法定量的缺點，Real-timePCR技術以其敏感、準確定量等優(yōu)點在檢測各組織細胞mRNA表達水平，特定基因在不同組織中的表達水平及特定基因在不同時期的表達差異、比較正常組織與病理組織中各種mRNA表達量差異等方面具有廣闊的應用前景［15］。Johansen等［16］利用實時定量PCR技術定量檢測彩虹鮭魚新陳代謝相關的基因及肌肉特異性基因的表達水平的變化，研究了其在經歷長時間的饑餓再恢復喂食過程中的新陳代謝情況，及恢復喂食后鯉魚肌肉的生長速度。藥物及疫苗功效考核針對水產養(yǎng)殖動物感染性疾?。ú《静　⒓毦〉龋┖推渌囟ㄉ矸矫娴男枰兄频囊呙绾退幬?，在開發(fā)過程中，快速了解疫苗和藥物的功效，可以為其開發(fā)節(jié)約大量的人力、時間和資金。因此對于藥物及疫苗的療效的評估就顯得很重要。Real-timePCR技術可以快速、準確定量、靈敏地測定特定免疫蛋白的基因表達水平來間接的評價疫苗和藥物的功效。宋艷等［17］運用TaqMan探針為基礎的實時熒光定量PCR技術，研究了GnRH-A及其配伍對魚卵成熟、受精相關基因ZP3的調控。研究結果顯示，LHRH-A2+DOM組合既能使ZP3基因表達達峰時間顯著提前，又能顯著提高表達峰值，可能是較好的魚類催產藥物配伍。水產品的快速商檢江河、湖泊、近海等水源的污染是導致水產品不安全的一個重要因素。而利用這樣的水源生產的水產品常常會受到細菌、病毒等病原微生物的污染，嚴重影響到了水產品的安全性，給人體造成潛在的威脅。如軟體類、蝦類、魚類等是重要的水產品，同時也是多種人類病原微生物的中間宿主。Real-timePCR技術在水產品快速商檢上的應用無疑為水產品安全提供了關鍵技術。蔡潭溪等［18］應用TaqMan探針的Real-timePCR方法，定量檢測海產品中副溶性弧菌（Vibrioparahaemolyticus），與傳統的細菌培養(yǎng)方法和生化鑒定相比，具有更加省時、操作簡便和定量準確等優(yōu)點，對水產品中存在的副溶性弧菌的監(jiān)控有著重要的實際意義。4.5養(yǎng)殖水環(huán)境的實時監(jiān)測生物標志物Biomarker作為指示污染物危害效應的早期生物信號，對其研究有助于早期識別外來污染物對水產養(yǎng)殖動物的影響，從而有利于水產養(yǎng)殖環(huán)境的危險度評估。目前國內外已經有很多學者報道了實時定量RT-PCR技術應用于定量檢測生物標記物。CYP450基因的表達可受許多因素的影響，體外許多化學物質（如氟甲氧氟烷、二乙醚、三氯乙烯、氯仿等）對CYP450基因表達有誘導作用，上調CYP450基因的表達［19］。因此，可以把CYP450基因作為三氯乙烯、氯仿、苯、對乙酰氨基酚等有機物污染的生物標記物。Rees等建立了SYBRgreen實時定量PCR技術直接定量檢測經B-萘黃銅誘導后大西洋鮭魚Salmosalar各組織CYP1A基因的表達水平，并應用于評估米羅河中多氯化聯苯的含量［20］。5展望Real-timePCR技術是核酸檢測和定量技術的一次飛躍，對現代分子生物學的研究過程中起到了重要的作用。隨著Real-timePCR技術的不斷改進與完善以及新的熒光化學物質的不斷開發(fā)，Real-timePCR技術在水產養(yǎng)殖領域的應用越來越廣泛，已逐漸成為科研的重要工具。隨著Real-timePCR技術與微解剖技術、肽核酸技術和生物芯片技術等先進技術的整合，水產養(yǎng)殖中遇到的一些技術難題很容易得到解決，其未來的應用前景是令人鼓舞的，對水產分子生物學的發(fā)展有著深遠的影響，必將在水產養(yǎng)殖的研究中發(fā)揮巨大的作用。參考文獻：RajeevanMS,RanamukhaarachchiDG,VernonSD,etal.Useofreal-timequantitativePCRtovalidatetheresultsofcDNAarrayanddifferentialdisplayPCRtechnologies[J].Methods,2001,25:443-451.KeLD,ChenZ,YungWK.Areliabilitytestofstandard-basedquantitativePCR:Exogenousvsendogenousstandards[J].MolecularandCellularProbes,2000,14(2):127-135.⑶李文濤，王俊東，楊利峰，等.實時熒光定量PCR技術及其應用J].生物技術通訊,2006,17(1):112-114.MarisaL,WongandJuanF.Medrano.Real-timePCRformRNAquantitation[J].BioTechniques,2005,39:75-85.[5]蔣春燕，王泰健，王琴等.實時熒光定量PCR技術[J].動物醫(yī)學進展,2005,26(12):97-101.⑹趙煥英，包金風.實時熒光定量PCR技術的原理及其應用研究進展J].中國組織化學與細胞化學雜志.2007,16(4):90-93.[7]鄧文星，張映.實時熒光定量PCR技術綜述J].生物技術通報,2007(5):94-95.⑻胡騎，程安春，汪銘書.熒光定量技術的研究進展及應用J].HeilongjiangAnimalScienceandVeterinaryMedicine,2006(11):32-34.[9]郭楊，陳世界，郭萬柱，等.熒光定量PCR技術及其應用研究進展J].動物醫(yī)學進展,2009,30(2):78-82.[10]袁媛，陳強，陳思祗，等.實時熒光定量PCR技術及其在生命科學領域中的應用J].海峽預防醫(yī)學雜志,2006,12(5):18-20.[11]葛忠源，熊東艷，張啟勇.實時熒光定量PCR技術及應用J].中國牧業(yè)通訊，2008(13):12-14.ThomasDSchmittgen1&KennethJLivak,Analyzingreal-timePCRdatabythecomparativeCTmethod[J]