動物細(xì)胞與組織培養(yǎng)

動物細(xì)胞與組織培養(yǎng)第一頁，共九十八頁，2022年，8月28日本章主要內(nèi)容4.1動物細(xì)胞的特點(diǎn)4.2動物細(xì)胞與組織培養(yǎng)的定義與分類4.3發(fā)展簡史4.4動物細(xì)胞的體外培養(yǎng)生長特性4.5動物細(xì)胞、組織培養(yǎng)的基本技術(shù)4.6干細(xì)胞第二頁，共九十八頁，2022年，8月28日4.1動物細(xì)胞的特點(diǎn)動物細(xì)胞屬于真核細(xì)胞，與細(xì)菌等原核細(xì)胞比進(jìn)化程度高，結(jié)構(gòu)、成分更復(fù)雜，功能更全面。

白血球巨噬細(xì)胞Ｔ細(xì)胞與Ｂ細(xì)胞癌細(xì)胞膠質(zhì)細(xì)胞上皮細(xì)胞第三頁，共九十八頁，2022年，8月28日4.1動物細(xì)胞的特點(diǎn)動物細(xì)胞與微生物細(xì)胞的比較（1）細(xì)胞大，無細(xì)胞壁；（2）倍增時間長，生長緩慢，易受污染；（3）需氧量少，對機(jī)械攪拌或剪切力敏感；（4）以聚集體形式存在；（5）原代細(xì)胞一般繁殖50代左右就退化死亡。動物細(xì)胞與植物細(xì)胞比較共同點(diǎn)：動植物細(xì)胞中都有細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。區(qū)別：動物細(xì)胞中無細(xì)胞壁、葉綠體和液泡，但是有的植物細(xì)胞中無葉綠體。第四頁，共九十八頁，2022年，8月28日4.1動物細(xì)胞的特點(diǎn)動物細(xì)胞連接的5種形式：（1）緊密連接（常見）（2）間隙連接（常見）（3）隔壁連接（無脊椎動物細(xì)胞）（4）中間連接（脊椎動物細(xì)胞）（5）橋粒連接（常見）Anchoringjunction第五頁，共九十八頁，2022年，8月28日動物細(xì)胞有三種類型的細(xì)胞連接∶◆

封閉連接

緊密連接◆

錨定連接

橋粒、粘著帶◆

通訊連接

間隙連接、化學(xué)突觸、胞間連絲細(xì)胞連接（celljunction）：

細(xì)胞間的聯(lián)系結(jié)構(gòu)，是細(xì)胞質(zhì)膜局部區(qū)域特化形成的，在結(jié)構(gòu)上包括膜特化部分、質(zhì)膜下的胞質(zhì)部分及質(zhì)膜外細(xì)胞間的部分。細(xì)胞連接是多細(xì)胞有機(jī)體中相鄰細(xì)胞之間通過細(xì)胞質(zhì)膜相互聯(lián)系,協(xié)同作用的重要基礎(chǔ)。第六頁，共九十八頁，2022年，8月28日1、封閉連接（occludingjunctions)：細(xì)胞質(zhì)膜細(xì)胞間隙

嵴線細(xì)胞A細(xì)胞B◆緊密連接是封閉連接的主要形式。將相鄰細(xì)胞的質(zhì)膜密切的連接在一起。緊密連接的存在部位和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：◆又叫不通透連接,它不僅連接相鄰的細(xì)胞,而且封閉細(xì)胞間隙,使大多數(shù)分子難以在細(xì)胞間通透。

◆這種連接方式普遍存在于腔道上皮細(xì)胞靠近管腔端的相鄰細(xì)胞膜間。

◆從結(jié)構(gòu)上看,通過連接蛋白形成焊接線（嵴線），封閉相鄰細(xì)胞間的空隙。第七頁，共九十八頁，2022年，8月28日緊密連接的功能：

形成滲漏屏障，起重要的封閉作用；

◆連接作用

隔離作用，使游離端與基底面質(zhì)膜上的膜蛋白行使各自不同的膜功能

支持功能第八頁，共九十八頁，2022年，8月28日2、錨定連接（Anchorjunctions)：

通過細(xì)胞骨架系統(tǒng)將細(xì)胞與相鄰細(xì)胞或細(xì)胞與基質(zhì)之間連接起來。包括橋粒與半橋粒連接和粘合帶與粘合斑連接橋粒與半橋粒連接：與中間纖維相關(guān)的錨定連接。粘合帶與粘合斑連接：與肌動蛋白纖維相關(guān)的錨定連接。

◆錨定連接在組織內(nèi)分布很廣泛，在上皮組織,心肌和子宮頸等組織中含量尤為豐富?！糁饕筐ぶ鞍?、整聯(lián)蛋白和細(xì)胞骨架體系將相鄰兩細(xì)胞或細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)連接在一起。第九頁，共九十八頁，2022年，8月28日錨定連接的類型、結(jié)構(gòu)與功能與中間纖維相連的錨定連接 橋粒：鉚接相鄰細(xì)胞，提供細(xì)胞內(nèi)中間纖維的錨定位點(diǎn)，形成整體網(wǎng)絡(luò)，起支持和抵抗外界壓力與張力的作用。 半橋粒：半橋粒與橋粒形態(tài)類似,但功能和化學(xué)組成不同。它通過細(xì)胞質(zhì)膜上的膜蛋白整合素將上皮細(xì)胞固著在基底膜上,在半橋粒中，中間纖維不是穿過而是終止于半橋粒的致密斑內(nèi)。與肌動蛋白纖維相連的錨定連接

粘著帶：位于緊密連接下方,相鄰細(xì)胞間形成一個連續(xù)的帶狀 結(jié)構(gòu)。間隙約15～20nm,也稱帶狀橋粒。粘著斑：細(xì)胞通過肌動蛋白纖維與細(xì)胞外基質(zhì)之間的連接方式。第十頁，共九十八頁，2022年，8月28日橋粒連接第十一頁，共九十八頁，2022年，8月28日◆一種特殊的細(xì)胞連接，位于特化的具有細(xì)胞間通訊作用的細(xì)胞?！艟邫C(jī)械的細(xì)胞連接作用◆

通訊連接的方式：

●間隙連接

●化學(xué)突觸

●胞間連絲3、通訊連接（communicatingjunctions)：第十二頁，共九十八頁，2022年，8月28日間隙連接◆

間隙連接處相鄰細(xì)胞質(zhì)膜間的間隙為2～3nm◆基本單位是連接子

●

一種跨膜蛋白

●每個連接子由6個相同或相似跨膜蛋白亞單位環(huán)繞中央形成孔徑為1.5-2nm的水性通道

●

相鄰兩細(xì)胞分別用各自的連接子相互對接形成分子間的通道，允許分子量在1000道爾頓以下的分子通過。第十三頁，共九十八頁，2022年，8月28日間隙連接第十四頁，共九十八頁，2022年，8月28日胞間連絲●是相鄰植物細(xì)胞壁上的一個穿過細(xì)胞壁的狹窄通道?！裼泄軤畹膬?nèi)質(zhì)網(wǎng)通過。因此，通過胞間連絲，使得相鄰細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)膜、細(xì)胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)交融在一起。●胞間連絲直徑約30-60nm，允許1000道爾頓以下的分子滲透。第十五頁，共九十八頁，2022年，8月28日●是存在于可興奮細(xì)胞間的一種連接方式，其作用是通過釋放神經(jīng)遞質(zhì)來傳導(dǎo)興奮?！袷巧窠?jīng)遞質(zhì)用以傳遞電信號的通道。將電信號轉(zhuǎn)化為化學(xué)信號或?qū)⒒瘜W(xué)信號轉(zhuǎn)化為電信號的過程?！裼赏挥|前膜、突觸后膜、突觸間隙三部分組成?！裢挥|前神經(jīng)元的突起末梢膨大呈球形，稱突觸小體?！裢挥|小體內(nèi)有突觸小泡，內(nèi)含神經(jīng)遞質(zhì)。化學(xué)突觸第十六頁，共九十八頁，2022年，8月28日細(xì)胞連接的不同方式第十七頁，共九十八頁，2022年，8月28日各類連接的比較第十八頁，共九十八頁，2022年，8月28日4.2動物細(xì)胞與組織培養(yǎng)的定義與分類1、定義動物細(xì)胞與組織培養(yǎng)（animalcellandtissueculture)

是從動物體內(nèi)取出細(xì)胞或組織，模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，在無菌、適溫和豐富的營養(yǎng)條件下，使離體細(xì)胞或組織生存、生長并維持結(jié)構(gòu)和功能的一門技術(shù)。2、分類

動物細(xì)胞與組織培養(yǎng)可分為細(xì)胞培養(yǎng)、組織培養(yǎng)和器官培養(yǎng)。

第十九頁，共九十八頁，2022年，8月28日

細(xì)胞培養(yǎng)(cellculture):細(xì)胞培養(yǎng)是指細(xì)胞的體外培養(yǎng),這是在無菌條件下,將機(jī)體內(nèi)的組織取出,分散(機(jī)械或酶消化)成單個細(xì)胞,在模擬體內(nèi)的環(huán)境中,給以營養(yǎng)物質(zhì),使細(xì)胞不斷生長、繁殖或傳代,借以觀察細(xì)胞的生長、分裂、接觸抑制以及衰老、死亡等生命現(xiàn)象。細(xì)胞培養(yǎng)也包括單個細(xì)胞的培養(yǎng)。器官培養(yǎng)(organculture):器官培養(yǎng)是指器官的原基(芽胚基)、整個器官或器官的一部分,在體外條件下保存(維持)或生長,并能分化和保持結(jié)構(gòu)和/或功能。第二十頁，共九十八頁，2022年，8月28日

組織培養(yǎng)(tissueculture):組織培養(yǎng)是指組織在體外條件下的維持或生長。此種方法可有組織分化及保特組織的結(jié)構(gòu)和/或功能的特點(diǎn)。這里需要說明的是,當(dāng)我們做組織培養(yǎng)時,不論用什么方法和條件,組織培養(yǎng)中的主要成分仍然是細(xì)胞;細(xì)胞在生長過程中總有移動(運(yùn)動)和其他變化,這樣就使得被培養(yǎng)的組織難以長期維持其原有的結(jié)構(gòu)和功能。培養(yǎng)時間越長,發(fā)生變動的可能性越大。結(jié)果常使單一類型的細(xì)胞易保存下來,最終也成了細(xì)胞培養(yǎng)。所謂細(xì)胞培養(yǎng),并不意味著細(xì)胞彼此之間是獨(dú)立的。細(xì)胞在培養(yǎng)中的生命活動和體內(nèi)細(xì)胞一樣,仍然是相互依存的,呈現(xiàn)一定組織的特征。所以組織培養(yǎng)和細(xì)胞培養(yǎng)并無嚴(yán)格區(qū)別,兩者在一定程度上可看作是同義語。第二十一頁，共九十八頁，2022年，8月28日細(xì)胞體外培養(yǎng)可分為原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)原代培養(yǎng)(primaryculture):是指將機(jī)體取出的細(xì)胞或組織進(jìn)行實(shí)效培養(yǎng)的過程。實(shí)效培養(yǎng)的細(xì)胞大約增殖10代左右，這樣的細(xì)胞稱為原代細(xì)胞。

傳代培養(yǎng)(subculture)：從原代培養(yǎng)的細(xì)胞繼續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)的過程。

細(xì)胞系（cellline）：原代細(xì)胞經(jīng)第一次傳代后，形成的細(xì)胞群體，即具有增殖能力，類型均勻的培養(yǎng)細(xì)胞，一般為有限細(xì)胞系。細(xì)胞株：通過選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中獲得的具有特殊性質(zhì)或標(biāo)記的單一類型的細(xì)胞群體。

體外動物細(xì)胞在形態(tài)結(jié)構(gòu)上均程度不同的與原來的細(xì)胞有所差異。第二十二頁，共九十八頁，2022年，8月28日第二十三頁，共九十八頁，2022年，8月28日

4.3發(fā)展簡史第1次成功地培養(yǎng)脊椎動物細(xì)胞是在1907年,美國科學(xué)家Harrison首先利用蛙淋巴液來培養(yǎng)蛙胚神經(jīng)管,并觀察到神經(jīng)纖維是由細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行阿米巴運(yùn)動所形成,解決了當(dāng)時爭論不休的神經(jīng)纖維起源問題。是動物細(xì)胞組織培養(yǎng)的奠基人。1912年德國科學(xué)家Carrel采用更換培養(yǎng)基和傳代的方法解決了組織塊長期存活的問題；設(shè)計了卡氏瓶培養(yǎng)法，擴(kuò)大了組織生存空間。1943年,Earle首先培養(yǎng)C3H小鼠的結(jié)締組織并用致癌物20-甲基膽蒽處理,獲得了能回種于小鼠體內(nèi)并生長肉瘤的長期培養(yǎng)的細(xì)胞系,定名為L細(xì)胞系。

5年之后,Sanfold使用預(yù)先處理的條件培養(yǎng)基(conditionmedium)成功地使L細(xì)胞系的一個單細(xì)胞在體外發(fā)展成“克隆”(clone)并繁殖成克隆株。

1951年Gey成功地用人的宮頸癌組織建立起能在體外連續(xù)培養(yǎng)的人的腫瘤細(xì)胞并定名為HeLa細(xì)胞系。這些細(xì)胞至今仍在世界各國廣為應(yīng)用。L與HeLa細(xì)胞系就成為最早建成的動物與人的細(xì)胞系。第二十四頁，共九十八頁，2022年，8月28日1955年Eagle研制成人工合成的培養(yǎng)基,使組織培養(yǎng)工作的勞動量大大減輕。

20世紀(jì)70年代Sato等人發(fā)展了無血清培養(yǎng),解決了血清中存在的一系列問題,使細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)得到長足的發(fā)展,并推動了基因工程產(chǎn)品及其產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

20世紀(jì)70年代以來,我國組織培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展更快,它已不再是個別研究室所擁有的技術(shù),而是已成為生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中普遍應(yīng)用的手段。近20年建立的各種細(xì)胞系已不可勝數(shù)。最近我國科學(xué)家對干細(xì)胞的研究已走在世界前列,特別是治療性克隆研究已達(dá)到世界先進(jìn)水平。第二十五頁，共九十八頁，2022年，8月28日4.4動物細(xì)胞的生長特性

1、在活體內(nèi)的生長特性

，動物細(xì)胞:分化的動物細(xì)胞在功能上具有明確的分工，并具有明顯的形態(tài)學(xué)特征。

例如：肌肉細(xì)胞為紡錘形，以便于行使收縮伸展功能；神經(jīng)細(xì)胞具有很長的分支，很多的纖維，以便接受和傳遞刺激；紅細(xì)胞呈園盤狀，有利于和周圍環(huán)境交換氣體和在血管內(nèi)流動；上皮細(xì)胞由于它要覆蓋于表面，常常相互擠壓成不規(guī)則形狀。增殖分化第二十六頁，共九十八頁，2022年，8月28日活體內(nèi)的動物細(xì)胞按照分裂能力可以分為三大類：第一類是能保持繼續(xù)分裂能力的細(xì)胞，可以繼續(xù)不斷地分裂，如骨髓干細(xì)胞、各類前體細(xì)胞；第二類細(xì)胞群是永久失去分裂能力的細(xì)胞，如各類高度特化的細(xì)胞；第三類是靜止細(xì)胞群，即所謂的G0細(xì)胞，在正常情況下，它們不分裂，也不合成DNA，但在受到刺激后，則重新進(jìn)入細(xì)胞分裂。如人的肝臟細(xì)胞等。

第一類和第三類細(xì)胞在適當(dāng)條件下可進(jìn)行離體培養(yǎng)。

第二十七頁，共九十八頁，2022年，8月28日2、動物細(xì)胞的體外培養(yǎng)生長特性離體培養(yǎng)的動物細(xì)胞可分為：

（1）貼附依賴型(anchorage-dependent)（2）非貼附依賴型(anchorage-independent)（3）兼性貼附細(xì)胞第二十八頁，共九十八頁，2022年，8月28日（1）貼附型細(xì)胞簡稱為貼壁細(xì)胞，包括成纖維細(xì)胞型細(xì)胞、上皮型細(xì)胞、游走型細(xì)胞、多形型細(xì)胞。第二十九頁，共九十八頁，2022年，8月28日貼附型細(xì)胞：大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞貼附生長，屬于貼壁依賴性細(xì)胞。貼附:是大多數(shù)有機(jī)體細(xì)胞在體內(nèi)生存和生長發(fā)育的基本存在方式。結(jié)果:

基于貼附特性，使細(xì)胞與細(xì)胞之間相互結(jié)合形成組織，有機(jī)體的絕大多數(shù)細(xì)胞必須貼附于一固相表面才能生存和生長。體外培養(yǎng)時：這些細(xì)胞被放到體外環(huán)境中以后,同樣需要貼附于某一固相表面才能生存和生長，因而屬于貼附型細(xì)胞貼附(錨定或錨著)依賴型(性)細(xì)胞：唯有貼附于固相表面才能生存的細(xì)胞。第三十頁，共九十八頁，2022年，8月28日細(xì)胞在體內(nèi)、外的貼附方式：存在差異。體內(nèi)：貼附是全方位,外形具有復(fù)雜的立體特征。體外：多數(shù)情況，細(xì)胞只有一個附著平面，外形一般與體內(nèi)時明顯不同。貼附的固相表面：玻璃、聚苯乙烯塑料按照培養(yǎng)細(xì)胞的主要形態(tài)，可分為以下幾大類型：成纖維細(xì)胞型細(xì)胞、上皮型細(xì)胞、游走型細(xì)胞、多形型細(xì)胞。

第三十一頁，共九十八頁，2022年，8月28日名稱：凡在培養(yǎng)中形態(tài)與成纖維細(xì)胞類似的。來源：由中胚層間充質(zhì)組織起源的組織如：真正的成纖維細(xì)胞，心肌，平滑肌，成骨細(xì)胞，血管內(nèi)皮。形態(tài)：似體內(nèi)成纖維細(xì)胞的形態(tài)，胞體梭形或不規(guī)則三角形，胞質(zhì)向外伸出2—3個長短不等的突起，中有卵圓形核。生長特點(diǎn)：排列成放射狀，漩渦狀，并不緊靠連成片，細(xì)胞—細(xì)胞接觸易斷開而單獨(dú)行動，游離的單獨(dú)的成纖維樣細(xì)胞，常有幾個伸長的細(xì)胞突起。成纖維細(xì)胞型細(xì)胞第三十二頁，共九十八頁，2022年，8月28日成纖維細(xì)胞型細(xì)胞第三十三頁，共九十八頁，2022年，8月28日名稱：僅形態(tài)上似體內(nèi)，實(shí)際上不完全相同。來源：來源于外胚層、內(nèi)胚層細(xì)胞,如：皮膚及其衍生物,消化道，乳腺，肺泡,上皮性腫瘤。形態(tài)：類似體內(nèi)的上皮細(xì)胞，扁平，不規(guī)則多角形，中有圓形核。生長特點(diǎn)：易相連成片，相靠—緊密相連—成薄層—鋪石狀生長時呈膜狀移動，很少脫離細(xì)胞群而單個活動。上皮型細(xì)胞第三十四頁，共九十八頁，2022年，8月28日上皮型細(xì)胞第三十五頁，共九十八頁，2022年，8月28日游走型細(xì)胞特點(diǎn)：分散生長，細(xì)胞胞質(zhì)常伸出偽足和突起，生長位置不固定，呈活躍的游走和變形運(yùn)動，速度快且方向不規(guī)則，當(dāng)細(xì)胞密度增大、連接成片時，形狀類似于成纖維樣細(xì)胞型或上皮細(xì)胞型。如淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等。此型細(xì)胞不很穩(wěn)定，有時亦難和其它型細(xì)胞區(qū)別。在一定的條件下，由于細(xì)胞密度增大聯(lián)成片后，可呈類似多角型或成纖維細(xì)胞形態(tài)。巨噬細(xì)胞第三十六頁，共九十八頁，2022年，8月28日多形型細(xì)胞特點(diǎn)：有一些細(xì)胞，如神經(jīng)細(xì)胞難以確定其規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài)，可統(tǒng)歸于此類。如神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。第三十七頁，共九十八頁，2022年，8月28日（2）非貼附型細(xì)胞（也叫懸浮型細(xì)胞）特點(diǎn)：細(xì)胞體外生長不貼壁，可在培養(yǎng)液中懸浮生長，胞體始終為球形。如血液白細(xì)胞、淋巴組織細(xì)胞、某些腫瘤細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞系等。這類細(xì)胞一般呈圓形，密度較大，培養(yǎng)效率高，可進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，易于大規(guī)模生產(chǎn)，便于過程的控制。

（3）兼性貼壁細(xì)胞

動物細(xì)胞培養(yǎng)中，有些細(xì)胞呈現(xiàn)雙重性，既可以貼壁生長，也可以懸浮培養(yǎng)，如中國地鼠卵巢細(xì)胞、小鼠L929細(xì)胞等。第三十八頁，共九十八頁，2022年，8月28日3、影響細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征的主要因素：

血清成分、培養(yǎng)基的酸堿度、氣相環(huán)境、培養(yǎng)基成分及添加成分、溫度等。如Hela細(xì)胞原本是上皮型癌細(xì)胞，但若在過酸或過堿的條件下培養(yǎng)，可呈梭形，當(dāng)酸堿度適中時又可恢復(fù)上皮型特征。

因此，細(xì)胞形態(tài)學(xué)僅是對培養(yǎng)物判斷或識別的一種參考價值指標(biāo)。若想明確某一培養(yǎng)物的確切類型，必須借助于更為特異性的鑒定方法。第三十九頁，共九十八頁，2022年，8月28日

4.5動物細(xì)胞、組織培養(yǎng)的基本技術(shù)1、培養(yǎng)細(xì)胞的生長特點(diǎn)2、培養(yǎng)細(xì)胞的生長過程3、動物細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件4、動物細(xì)胞培養(yǎng)的傳統(tǒng)方法5、原代培養(yǎng)技術(shù)6、傳代培養(yǎng)技術(shù)7、貼壁技術(shù)8、細(xì)胞系與克隆株9、細(xì)胞的常規(guī)檢查10、細(xì)胞保存技術(shù)第四十頁，共九十八頁，2022年，8月28日1、培養(yǎng)細(xì)胞的生長特點(diǎn)

細(xì)胞在體外培養(yǎng)生長時其基本生物學(xué)規(guī)律與在體內(nèi)時相同。但由于生活環(huán)境條件的改變，有些方面如增殖的規(guī)律等，與體內(nèi)不完全相同，而有其自身的規(guī)律。

體外培養(yǎng)細(xì)胞重要的生長特點(diǎn)有：貼附和伸展以及接觸抑制和生長的密度限制。接觸抑制(contactinhibition)現(xiàn)象：除少數(shù)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞外，大多數(shù)正常二倍體細(xì)胞的生長都需要在一定的基質(zhì)（如玻璃、塑料等）上貼附，伸展后才能增殖。當(dāng)細(xì)胞在基質(zhì)上分裂增殖，逐漸匯合成片即每個細(xì)胞與其周圍的細(xì)胞相互接觸時，細(xì)胞就停止增殖，即細(xì)胞密度不再增加，這一現(xiàn)象稱之為接觸抑制或密度依賴抑制現(xiàn)象。第四十一頁，共九十八頁，2022年，8月28日有限細(xì)胞系和永久細(xì)胞系動物細(xì)胞離體培養(yǎng)起始物，我們稱之為原代培養(yǎng)（primaryculture）。經(jīng)繼代培養(yǎng)后即成為有限細(xì)胞系(finitecellline)。有限細(xì)胞系即使培養(yǎng)條件均能滿足細(xì)胞繁殖生長，它們也只能在有限的時間內(nèi)生存，一般經(jīng)過30~50世代后細(xì)胞將逐漸死亡。第四十二頁，共九十八頁，2022年，8月28日“代”：繼代次數(shù)和存活時間的長短因細(xì)胞來源的年齡和種族不同而有差異。年齡越大繼代次數(shù)越少。人胚成纖維細(xì)胞約可以培養(yǎng)50代，而成年人的成纖維細(xì)胞則不能繼代50次，同樣是成纖維細(xì)胞，取自雞胚的成纖維細(xì)胞可繼代培養(yǎng)30代，而小鼠的只能培養(yǎng)8代。

大多數(shù)細(xì)胞系在有限的代數(shù)內(nèi)以不變的形式增殖，當(dāng)超過有限世代后，它們可能有兩種情況：一是衰老死亡，二是發(fā)育成永久細(xì)胞系或稱連續(xù)細(xì)胞系。有限細(xì)胞系轉(zhuǎn)換成永久細(xì)胞系的過度期稱為轉(zhuǎn)換期(crisis)，其轉(zhuǎn)換過程在動物細(xì)胞培養(yǎng)中稱為體外轉(zhuǎn)化(invitrotransformation)。

永久細(xì)胞系有如下特征：細(xì)胞形態(tài)變化，如細(xì)胞變小，黏附性減少，具有較高的核質(zhì)比；生長速率增加，倍增時間縮短；對血清的依賴性減?。毁N壁依賴性降低；細(xì)胞異倍體和非整倍體增加，細(xì)胞接種到體內(nèi)后，生癌率上升。永久細(xì)胞系的建立是動物細(xì)胞規(guī)?；囵B(yǎng)的前提。第四十三頁，共九十八頁，2022年，8月28日2、培養(yǎng)細(xì)胞的生長過程

單個細(xì)胞生長過程：細(xì)胞周期動物細(xì)胞分裂周期一般為12～48小時，它不僅隨細(xì)胞種屬的不同而有差異，即使是同一種屬，不同部位的細(xì)胞所需的時間也不同。此外，培養(yǎng)條件如溫度、pH、培養(yǎng)基的成分等，也會影響分裂周期的長短。細(xì)胞系的生長過程第四十四頁，共九十八頁，2022年，8月28日3、動物細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件

在體外培養(yǎng)細(xì)胞必須要能夠維持和模擬細(xì)胞在體內(nèi)生存的良好環(huán)境和物質(zhì)代謝過程。為此必須提供必要的營養(yǎng)、嚴(yán)格的無菌條件、適宜的pH、滲透壓、培養(yǎng)器皿、溫度和CO2等條件。顯著污染的標(biāo)志是培養(yǎng)基pH迅速改變，細(xì)胞外形模糊，甚至出現(xiàn)飄浮的集落。

第四十五頁，共九十八頁，2022年，8月28日（1）動物細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境要求

1）無污染環(huán)境2）溫度溫度是細(xì)胞體外生存的基本條件之一，來源不同的細(xì)胞，其最適生長溫度不盡相同。如昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)溫度一般是25～28℃哺乳動物細(xì)胞的培養(yǎng)溫度一般是37℃。

總體上講，動物細(xì)胞忍受低溫的能力比忍受高溫的能力強(qiáng)。如哺乳動物細(xì)胞在45℃下只能存活1小時，但在25℃條件下仍然能慢速生長，并維持長時間不死，甚至在4℃下數(shù)小時后，再置于適宜溫度下細(xì)胞仍然可以正常生長。液氮凍存。第四十六頁，共九十八頁，2022年，8月28日3）pH動物細(xì)胞培養(yǎng)適宜的pH一般在，低于6.8或高于7.6都不利于細(xì)胞生長，嚴(yán)重時會導(dǎo)致細(xì)胞死亡。培養(yǎng)細(xì)胞對pH的要求因培養(yǎng)時間長短有關(guān)，一般原代細(xì)胞要求較嚴(yán)格，而永久細(xì)胞系對pH具有較強(qiáng)的忍耐性。4）氣體環(huán)境及溶氧一般細(xì)胞在培養(yǎng)初期要求較低的溶氧水平，而在對數(shù)生長期或培養(yǎng)后期，對溶氧水平要求增加，如果供氧不足，將導(dǎo)致細(xì)胞缺氧而死亡。除了氧氣供應(yīng)外，還應(yīng)注意培養(yǎng)基的氧氣和CO2的平衡。開放培養(yǎng)時一般把細(xì)胞置于95%空氣加5%二氧化碳混合氣體環(huán)境中。第四十七頁，共九十八頁，2022年，8月28日5）滲透壓動物細(xì)胞培養(yǎng)滲透壓包括兩個方面的問題：一是培養(yǎng)基的滲透壓維持；二細(xì)胞體內(nèi)的滲透壓維持。

大多數(shù)動物細(xì)胞對滲透壓的忍耐程度較強(qiáng)，只要培養(yǎng)基的滲透壓變化不是很劇烈，一般對培養(yǎng)物不會造成致命傷害。動物細(xì)胞滲透壓的維持一般采用平衡鹽溶液。

第四十八頁，共九十八頁，2022年，8月28日（2）動物細(xì)胞培養(yǎng)的營養(yǎng)要求1）天然培養(yǎng)基直接采用取自動物體液或從組織中提取的成分作培養(yǎng)液，主要有血清、組織提取液、雞胚汁等。血清是天然培養(yǎng)基中最有效和最常用的培養(yǎng)成分。它含有許多維持細(xì)胞生長繁殖和保持細(xì)胞生物學(xué)性狀不可缺少的未知成分。使用最普遍的天然培養(yǎng)基是血清，基本以小牛血清最普遍。血清由于含有多種細(xì)胞生長因子、促貼附因子及其多活性物質(zhì)。與合成培養(yǎng)基合用，能使細(xì)胞碩利增殖生長。血清中已知的成分主要有蛋白質(zhì)、氨基酸、葡萄糖、激素等。蛋白質(zhì)主要是白蛋白和球蛋白。第四十九頁，共九十八頁，2022年，8月28日2）合成培養(yǎng)基

目前用于動物細(xì)胞培養(yǎng)的合成培養(yǎng)基種類很多，一般均包含氨基酸、維生素、糖類、無機(jī)離子和其它輔助成分（激素、生長因子）。

盡管各種合成培養(yǎng)基給細(xì)胞培養(yǎng)帶來極大方便，但許多實(shí)驗(yàn)表明，單純使用合成培養(yǎng)基細(xì)胞的貼壁、增殖效果常常不理想。因此，在使用時通常仍然需要加入一定量的動物血清，常用的動物血清有小牛血清、雞血清等。常用的人工培養(yǎng)基MEM，DMEM，RPMI-1640第五十頁，共九十八頁，2022年，8月28日3）無血清培養(yǎng)基

動物血清成分復(fù)雜，各種生物大小分子混合在一起，有些成分至今尚未搞清楚。血清對細(xì)胞生長很有效，但后期對培養(yǎng)產(chǎn)物的分離、提純以及檢測造會成一定困難。另外高質(zhì)量的動物血清來源有限，成本高，限制了它的大量使用。無血清培養(yǎng)基不加動物血清，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入細(xì)胞生長有效因子，激素等。第五十一頁，共九十八頁，2022年，8月28日1、平衡鹽溶液（BSS）2、消化液：胰蛋白酶液、Na2-

EDTA液、膠原蛋白酶液3、pH調(diào)整液：NaHCO3溶液、10%醋酸溶液、HEPEs液4、抗菌素液：青霉素、鏈霉素（雙抗）液、卡那霉素液、制霉菌素液5、肝素抗凝劑6、200mmol/L谷氨酰胺4)細(xì)胞培養(yǎng)溶液第五十二頁，共九十八頁，2022年，8月28日（3）培養(yǎng)工具

根據(jù)不同性質(zhì)的培養(yǎng)可采用不同的培養(yǎng)器皿:固體單層培養(yǎng)可生長在塑料或玻璃瓶壁上,半固體培養(yǎng)可采用膠原或瓊脂等凝膠培養(yǎng),懸浮培養(yǎng)則可用培養(yǎng)基直接培養(yǎng)。我們現(xiàn)在通常使用優(yōu)質(zhì)中性玻璃制成的長方形玻璃培養(yǎng)瓶,規(guī)格有100mL、25mL和15mL等。有時還用扁圓形的卡氏瓶。它們的優(yōu)點(diǎn)是可以清洗、消毒、反復(fù)使用。細(xì)胞培養(yǎng)所用的器皿必須干凈,器械的清洗是十分重要的,它直接影響到細(xì)胞培養(yǎng)的成敗。

第五十三頁，共九十八頁，2022年，8月28日（1）懸滴培養(yǎng)法（2）旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法（3）灌注小室培養(yǎng)法（4）卡氏瓶培養(yǎng)法（5）培養(yǎng)板培養(yǎng)法4、動物細(xì)胞培養(yǎng)的傳統(tǒng)方法第五十四頁，共九十八頁，2022年，8月28日（1）懸滴培養(yǎng)法(dropculture)——最簡單、最原始的培養(yǎng)法

懸滴培養(yǎng)法缺點(diǎn)：細(xì)胞生長空間狹小氣體不足，不能持續(xù)長時間生長培養(yǎng)基易液化，需要常更新培養(yǎng)基凹玻片折光，不便于觀察。第五十五頁，共九十八頁，2022年，8月28日（2）旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法(rotatetubeculture)①組織塊或細(xì)胞可交替地接觸營養(yǎng)液和空氣，利于細(xì)胞生長；②培養(yǎng)管緩慢轉(zhuǎn)動，使整個管內(nèi)壁全部長滿細(xì)胞，提高了細(xì)胞產(chǎn)量，適于較大量的組織培養(yǎng)和各種長期傳代細(xì)胞①組織塊或細(xì)胞可交替的培養(yǎng)。缺點(diǎn)：不易在顯微鏡下觀察。（3）灌注小室培養(yǎng)法(dabbleboothcultivation)為大規(guī)模培養(yǎng)系統(tǒng)提供了參考原理。第五十六頁，共九十八頁，2022年，8月28日（4）卡氏瓶培養(yǎng)法卡氏瓶(carlsberg'sflask)（如下圖）：①將組織塊剪碎，BSS漂洗。②轉(zhuǎn)移到另一只培養(yǎng)皿，在解剖顯微鏡下去掉不需要的組織如脂肪、壞死組織等。將組織塊切成1mm3小塊。③用預(yù)先潤濕的滴管轉(zhuǎn)移到消毒離心管，靜置使組織小塊下沉，吸去上清。以新鮮BSS漂洗。重復(fù)2~3次。第五十七頁，共九十八頁，2022年，8月28日④轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶（每個25ml的培養(yǎng)瓶可放置20~30塊組織小塊），吸去液體。加入1ml生長培養(yǎng)液，輕斜擺動培養(yǎng)皿，使組織小塊均勻分布。蓋好瓶蓋，36.5℃培養(yǎng)18~24h。⑤待組織塊粘附瓶壁后3~5天，加入5ml培養(yǎng)液；然后每周更新培養(yǎng)液一次。培養(yǎng)3~5周，細(xì)胞不斷增長，肉眼或低倍鏡下觀察可見圍繞組織周圍生長猶如日暈，稱“生長暈”。⑥取出中央組織塊，用預(yù)先濕潤的滴管移到另一新的培養(yǎng)瓶。重復(fù)④~⑥操作。⑦在原生長暈培養(yǎng)瓶內(nèi)換入新鮮培養(yǎng)液。待生長暈細(xì)胞擴(kuò)展至約50%培養(yǎng)瓶底表面時，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。第五十八頁，共九十八頁，2022年，8月28日5、原代培養(yǎng)技術(shù)一般經(jīng)過組織獲得、組織消化、接種、培養(yǎng)、傳代等過程。動物細(xì)胞培養(yǎng)的基本步驟包括：先對動物體的器官組織進(jìn)行切割、酶解消化，分離出單個細(xì)胞，再將單個細(xì)胞轉(zhuǎn)入含有葡萄糖、氨基酸和無機(jī)鹽的動物細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞培養(yǎng)液中，在二氧化碳培養(yǎng)箱中溫育培養(yǎng)，在將原代細(xì)胞傳代，擴(kuò)大進(jìn)行繼代培養(yǎng)。

第五十九頁，共九十八頁，2022年，8月28日（1）組織塊培養(yǎng)步驟如下：1、培養(yǎng)用品消毒后，安放在超凈工作臺內(nèi)，紫外線消毒，做好洗手等準(zhǔn)備工作.2、點(diǎn)燃酒精燈，用品按布局放置，安裝吸管等。3、取材：第六十頁，共九十八頁，2022年，8月28日第六十一頁，共九十八頁，2022年，8月28日（2）組織消化培養(yǎng)第六十二頁，共九十八頁，2022年，8月28日6、傳代培養(yǎng)技術(shù)傳代的理想時期：對數(shù)生長期，細(xì)胞80~90%或剛剛?cè)繀R合。方法：①消化：加入胰蛋白酶或胰蛋白酶與EDTA混合液，蓋滿瓶底，作用2~5min；②檢查：如細(xì)胞間隙變大，細(xì)胞質(zhì)回縮，則終止消化。③終止消化：吸出消化液；加入Hanks液，輕輕轉(zhuǎn)動，洗去殘留的消化液。如單用胰蛋白酶，可直接加入培養(yǎng)液。③細(xì)胞計數(shù)：用吸管輕輕吹打瓶壁，使細(xì)胞脫落，制成懸液，計數(shù)并記錄其濃度；④重新稀釋接種培養(yǎng)。第六十三頁，共九十八頁，2022年，8月28日根據(jù)細(xì)胞特點(diǎn)，掌握細(xì)胞消化時間和選擇消化方法。第六十四頁，共九十八頁，2022年，8月28日7、貼壁技術(shù)貼壁培養(yǎng)的材料與系統(tǒng)（1）主要材料：玻璃塑料金屬微載體（2）系統(tǒng)：微載體培養(yǎng)系統(tǒng)多孔載體培養(yǎng)系統(tǒng)中空纖維培養(yǎng)系統(tǒng)第六十五頁，共九十八頁，2022年，8月28日

微載體培養(yǎng)法(microcarrierculture)載體：DEAE-交聯(lián)葡聚糖微粒、DEAE-纖維素、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、無機(jī)玻璃基質(zhì)微載體等。微載體培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)細(xì)胞步驟：1、選擇合適的微載體類型——獲得最大量的細(xì)胞，以微載體能全部懸浮在培養(yǎng)液內(nèi)為最好。2、浸泡水化及消毒 用無Ca2+、Mg2+離子的磷酸緩沖液浸泡3h以上。3、接種（根據(jù)細(xì)胞類型決定接種濃度）4、培養(yǎng)觀察與細(xì)胞計數(shù)5、消化6、分離細(xì)胞或傳代培養(yǎng)第六十六頁，共九十八頁，2022年，8月28日多孔載體培養(yǎng)(porositycarrierculture)優(yōu)點(diǎn)：增加細(xì)胞固定化穩(wěn)定性，比表面積大，保證細(xì)胞充分的生長空間，細(xì)胞生長在載體內(nèi)部，免受機(jī)械損傷。多孔載體被證明是用于大規(guī)模高密度細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)秀細(xì)胞生長支持物，具有逐步取代傳統(tǒng)的實(shí)心微載體的趨勢。中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)法(hollowfibercellculture)

模擬細(xì)胞在體內(nèi)生長的三維狀態(tài)，利用人工的“毛細(xì)血管”——中空纖維來供給細(xì)胞生長的營養(yǎng)等條件。細(xì)胞向三維空間生長繁殖，形成類似組織的多層細(xì)胞群體，細(xì)胞密度可達(dá)109個/ml。適用于細(xì)胞代謝產(chǎn)物和分泌物的生產(chǎn)。第六十七頁，共九十八頁，2022年，8月28日8、細(xì)胞系與細(xì)胞株（celllineandclone）（1）細(xì)胞系的建立

原代培養(yǎng)的培養(yǎng)物中所含的細(xì)胞類型多而復(fù)雜，培養(yǎng)初期，生長的細(xì)胞類型多種多樣隨培養(yǎng)時間延長：一些細(xì)胞退化、死亡；另一些細(xì)胞適應(yīng)環(huán)境而生長繁殖培養(yǎng)物逐步變均勻。傳代培養(yǎng)意義：不僅在于維持細(xì)胞不斷地生長，而且使培養(yǎng)物逐步演變?yōu)榫哂性鲋衬芰?、特征專一、類型均勻的培養(yǎng)細(xì)胞，即細(xì)胞系。細(xì)胞系：指從原代培養(yǎng)物經(jīng)傳代培養(yǎng)后得來的一群特征專一、類型均勻的細(xì)胞，可以長期連續(xù)傳代。限定細(xì)胞系（有限細(xì)胞系）：壽命有限，一般為20~80代。連續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞系（無限細(xì)胞系）：細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化，可連續(xù)培養(yǎng)和生長，壽命變?yōu)椤盁o限”。第六十八頁，共九十八頁，2022年，8月28日（2）細(xì)胞株（克隆株） 分離單一細(xì)胞并使其繁殖形成的細(xì)胞群稱為細(xì)胞株。單個細(xì)胞的生活能力很弱，必須采取特殊的培養(yǎng)措施。適應(yīng)和同化過程：在細(xì)胞接種到新培養(yǎng)液的初期，細(xì)胞既從培養(yǎng)液中攝取營養(yǎng)，也要向培養(yǎng)液排出一定物質(zhì)，其結(jié)果使得培養(yǎng)液更易被吸收和利用。

適應(yīng)培養(yǎng)液:制備：選擇生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細(xì)胞，無死細(xì)胞和碎片，所用細(xì)胞的種類應(yīng)與要克隆的細(xì)胞相同。吸出培養(yǎng)液，用G6濾器過濾貯于冰箱中備用。 制備適應(yīng)性培養(yǎng)基時注意：選用成分齊全的合成培養(yǎng)基，可不加抗生素。第六十九頁，共九十八頁，2022年，8月28日細(xì)胞株的制備方法（3種）：（1）集落形成分離法平皿中接種稀釋細(xì)胞細(xì)胞貼壁繁殖成許多小群選擇一個最好的細(xì)胞群做標(biāo)記機(jī)械法刮除所有其他細(xì)胞群培養(yǎng)保留下來的細(xì)胞群.克隆成功的關(guān)鍵：①接種細(xì)胞數(shù)量要合適、細(xì)胞要分散得好。太多則使細(xì)胞操作不便，以每個平皿50~100個細(xì)胞為宜。②選擇細(xì)胞克隆時，應(yīng)逐日觀察，能證明被選留的細(xì)胞群確系來自于單個細(xì)胞。刮除和洗滌一定要徹底。第七十頁，共九十八頁，2022年，8月28日（2）瓊脂分離法（agarSeparation）瓊脂培養(yǎng)基的制備：

選擇質(zhì)量好的瓊脂，用三蒸水配成3%的溶液，分裝，滅菌。培養(yǎng)方法：向瓊脂平皿中接種稀釋細(xì)胞懸液（適應(yīng)培養(yǎng)基），培養(yǎng)后，標(biāo)記出保留細(xì)胞，在顯微鏡下切下保留細(xì)胞處瓊脂小塊，在BSS中輕輕漂洗后，用適應(yīng)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。第七十一頁，共九十八頁，2022年，8月28日（3）多孔塑料板分離法（foamedplasticsSeparation）

將1ml含有7~8個細(xì)胞的懸液接種到多孔無毒塑料板中，每一塊板上有數(shù)十個圓形小穴。選擇僅有單個細(xì)胞的小孔觀察，待單細(xì)胞繁殖成克隆充滿小孔后，用胰酶消化分離細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。第七十二頁，共九十八頁，2022年，8月28日9、細(xì)胞的常規(guī)檢查（corpuscularroutineexamination）檢查內(nèi)容：細(xì)胞的生長狀態(tài)、培養(yǎng)液pH、污染、細(xì)胞活力。細(xì)胞生長 潛伏期：不同組織和細(xì)胞潛伏期不同。 胚胎組織——次日可見生長，1周內(nèi)即連接成片。 老年組織、癌組織——潛伏期長。⑴游離期 細(xì)胞呈懸浮狀態(tài)。細(xì)胞質(zhì)回縮，胞體呈圓形。⑵吸附期：與細(xì)胞種類、培養(yǎng)環(huán)境有關(guān)。大多數(shù)在24h內(nèi)貼壁。細(xì)胞機(jī)能狀態(tài)不良或?yàn)l死細(xì)胞不貼壁。培養(yǎng)基偏酸或偏堿、污染、膠基有毒、培養(yǎng)瓶洗刷不潔等均不利于細(xì)胞貼壁。支持物表面帶正電荷利于貼壁。第七十三頁，共九十八頁，2022年，8月28日⑶繁殖期（idiophase）細(xì)胞由圓形變成延展細(xì)胞，進(jìn)而過渡成極性細(xì)胞；繼之出現(xiàn)細(xì)胞分裂，細(xì)胞數(shù)目不斷增多；同時有一定的移動現(xiàn)象。⑷退化期（catagen）

細(xì)胞長滿瓶壁后，如不及時做再培養(yǎng)，由于營養(yǎng)物消耗和代謝物積累，細(xì)胞變得粗糙（輪廓分明、胞內(nèi)顆粒狀物堆積），嚴(yán)重時甚至從瓶壁脫落。第七十四頁，共九十八頁，2022年，8月28日細(xì)胞形態(tài)（cellularshape）

生長良好細(xì)胞：倒置顯微鏡下觀察透明度大，輪廓不清。

機(jī)能不良細(xì)胞：輪廓鮮明，胞質(zhì)中常出現(xiàn)空泡、脂滴和其他顆粒狀物；細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，失去原有特點(diǎn)；細(xì)胞間隙加大。培養(yǎng)液pH正常情況下，培養(yǎng)液呈桃紅色。隨細(xì)胞生長時間延長，CO2積累增多，超出緩沖范圍后酸化變黃，須及時更換。第七十五頁，共九十八頁，2022年，8月28日

微生物污染(microbialcontamination)常見來源：培養(yǎng)液、培養(yǎng)塞、血清、操作時空氣污染。常見病菌：霉菌、細(xì)菌、支原體。⑴霉菌：培養(yǎng)基中出現(xiàn)相應(yīng)的菌落。⑵細(xì)菌：培養(yǎng)液混濁，鏡下可見大量細(xì)菌；如懷疑污染而培養(yǎng)液無明顯改變時，可將培養(yǎng)物進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)以驗(yàn)證。⑶支原體污染：經(jīng)常發(fā)生而難以發(fā)現(xiàn)。污染后的細(xì)胞仍能生存，甚至無明顯變化；有時可發(fā)生不同程度的病理改變。預(yù)防方法：嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作。并針對不同污染采取相應(yīng)措施。第七十六頁，共九十八頁，2022年，8月28日細(xì)胞活性(cytoactive)原理：細(xì)胞對色素的吸附性方法：常用的是染色排除法，即死細(xì)胞著色法⑴臺盼藍(lán)染色：0.4g臺盼藍(lán)，溶于100mlHanks液，調(diào)pH至7.0~7.2。按細(xì)胞懸液：染液=9：1比例混合，4min后計數(shù)。注意時間過長，活細(xì)胞亦可受損而著色。⑵苯胺黑染色：0.05%苯胺黑（溶于Hanks液）同上比例染色，稍放置后鏡檢。注意苯胺黑溶解性較差，用前應(yīng)先過濾。⑶藻紅B染色：0.02%藻紅B（溶于Hanks液）染色，2h內(nèi)鏡檢。注意藻紅B易同蛋白質(zhì)結(jié)合，須把血清洗凈。另：活細(xì)胞著色法：結(jié)晶紫染色：0.1%結(jié)晶紫（溶于Hanks液）染色，混合后立即鏡檢。第七十七頁，共九十八頁，2022年，8月28日10、細(xì)胞保存技術(shù)（1）細(xì)胞的凍存細(xì)胞系和細(xì)胞株的保存：超低溫冰箱、液氮罐冷凍保護(hù)劑的作用：結(jié)合細(xì)胞中水分子，降溫時減少細(xì)胞內(nèi)冰晶分子的形成，以免對細(xì)胞造成傷害。常用冷凍保護(hù)劑：DMSO、甘油。（2）細(xì)胞的復(fù)蘇：慢凍快融，迅速投入37℃水浴中。第七十八頁，共九十八頁，2022年，8月28日4.6干細(xì)胞4.6.1定義

干細(xì)胞（StemCell)是具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能的未分化細(xì)胞群體，即這些細(xì)胞可以通過細(xì)胞分裂維持自身細(xì)胞群的大小，同時又可以進(jìn)一步分化成為各種不同的組織細(xì)胞，從而構(gòu)成機(jī)體各種復(fù)雜的組織器官。

第七十九頁，共九十八頁，2022年，8月28日干細(xì)胞發(fā)展史1878：出現(xiàn)第一篇哺乳類的體外受精卵報導(dǎo)。1959：完成第一例兔子的體外受精卵。1960：展開畸胚瘤的研究。1968：愛得華（R.G.Edwards）和貝敏思特（B.D.Bavister）進(jìn)行人類的體外受精研究。第八十頁，共九十八頁，2022年，8月28日從1970年MartinEvans首次從小鼠胚囊中分離出小鼠胚胎干細(xì)胞，到原被誤認(rèn)為功能單一的干細(xì)胞后被證實(shí)具有自我復(fù)制能力，且可分化為人體206種組織器官的原始細(xì)胞。1978：世界第一個試管寶寶路易絲．布朗（LouiseBrown）在英國誕生。1980：肯蒂絲．瑞得（CandaceReed）成為澳洲的第一個試管寶寶。1981：艾凡斯等（M.J.Evans,etal.）體外培養(yǎng)老鼠的胚胎干細(xì)胞；伊莉莎白．卡爾（ElizabethCarr）成為美國的第一個試管寶寶。1984～1988：安德魯?shù)龋≒.W.Andrews,etal.）在體外培養(yǎng)人類畸胚瘤細(xì)胞。1989：佩拉等（M.F.Pera,etal.）制造人類畸胚瘤細(xì)胞株。1994：首次使用人類人工受精的囊胚進(jìn)行干細(xì)胞的研究。1995～1996：從恒河猴取得胚胎干細(xì)胞，并在體外培養(yǎng)分化成三種胚層。第八十一頁，共九十八頁，2022年，8月28日1998：詹姆士．湯姆生（JamesThomson）從人類體外受精卵取得胚胎干細(xì)胞，并能穩(wěn)定地在體外培養(yǎng)；吉爾哈特（J.Gearhart）從妊娠中止的胎兒內(nèi)取出其卵巢或睪丸組織，得到一種具有干細(xì)胞特性的原始生殖細(xì)胞，稱為人類生殖干細(xì)胞。1999：《科學(xué)》（Science）雜志公布干細(xì)胞為世界十大科技進(jìn)展榜首。從小鼠肌肉組織取得的成體干細(xì)胞可以「橫向分化為血液細(xì)胞」。此后，科學(xué)家相繼證實(shí)成體干細(xì)胞具有可塑性。2000：美國61名諾貝爾獎得主及其它科學(xué)家聯(lián)名要求美國政府對干細(xì)胞研究給予全面支持，同年美國總統(tǒng)柯林頓宣布美國政府準(zhǔn)許用政府經(jīng)費(fèi)進(jìn)行人體胚胎干細(xì)胞研究。2001：胚胎干細(xì)胞株可以培養(yǎng)出神經(jīng)、胰島等更多種類的細(xì)胞。美國總統(tǒng)布什宣布聯(lián)邦政府將有限資助胚胎干細(xì)胞研究。2002：《自然》（Nature）雜志評選「干細(xì)胞的爭議」為2002年科學(xué)界年度重大新聞。第八十二頁，共九十八頁，2022年，8月28日4.6.2干細(xì)胞的特性4.6.2.1形態(tài)和生化特征1、干細(xì)胞形態(tài)上通常呈圓形或橢圓形、體積小、核質(zhì)比例較大。2、干細(xì)胞具有較高的端粒酶活性，因此具有較強(qiáng)的增殖能力。4.6.2.2干細(xì)胞增殖特性1、緩慢性：有利于干細(xì)胞對特定的外界信號做出反應(yīng)，以決定進(jìn)行增殖還是進(jìn)入特定分化程序。另外，還可以減少基因發(fā)生突變的可能性，使干細(xì)胞有足夠時間發(fā)現(xiàn)和糾正復(fù)制錯誤，從而避免產(chǎn)生自身突變。2、自穩(wěn)性：即干細(xì)胞會自我更新維持自身數(shù)目的恒定。這是干細(xì)胞區(qū)別于腫瘤細(xì)胞的一個本質(zhì)特征。第八十三頁，共九十八頁，2022年，8月28日干細(xì)胞的形態(tài)胚胎干細(xì)胞克隆第八十四頁，共九十八頁，2022年，8月28日4.6.2.3干細(xì)胞巢及其微環(huán)境

干細(xì)胞在機(jī)體內(nèi)的居所稱為干細(xì)胞巢。在干細(xì)胞巢中所有控制干細(xì)胞增殖與分化的外部信號構(gòu)成了干細(xì)胞生存的微環(huán)境。如：分泌因子、受體介導(dǎo)的細(xì)胞間的相互作用、整和素和胞間基質(zhì)等。第八十五頁，共九十八頁，2022年，8月28日

正常胚胎發(fā)育過程是按嚴(yán)格的時空程序進(jìn)行一系列細(xì)胞與細(xì)胞之間、核質(zhì)之間相互作用的結(jié)果。從全能配套干細(xì)胞或組織譜系干細(xì)胞最終分化為體細(xì)胞，主要取決于哪些基因被激活和在什么時間與位點(diǎn)被激活。細(xì)胞環(huán)境中的各種因子的類型和濃度則是基因選擇性激活的重要因素。

細(xì)胞分化是部分基因選擇性地被激活或差異表達(dá)、從而控制專一性蛋白的合成和排布的結(jié)果。對細(xì)胞分化來說，最重要的是多個基因表達(dá)過程在數(shù)