基因工程復習資料

實用第一章 緒 論基因工程（geneticengineering）按照人們預先設計的藍圖，將一種生物的遺傳物質繞過有性生殖導入另一種生物中去，使其獲得新的遺傳性狀，形成新的生物類型的基因操作（ geneticmanipulation ）?；蚬こ陶Q生的基礎理論上的三大發(fā)現 ：DNA是遺傳物質 、 DNA雙螺旋模型和半保留復制機理、遺傳密碼的破譯和遺傳信息傳遞方式的確定。技術上的三大發(fā)明：限制性核酸內切酶的發(fā)現與 DNA的切割 、 DNA連接酶的發(fā)現與 DNA片段的連接 、基因工程載體的研究和應用基因工程研究的主要內容基礎研究：基礎研究、克隆載體研究 、受體系統(tǒng)的研究、目的基因的研究、生物基因組學的研究、應用研究基因工程的基本操作程序分離獲得目的基因限制性核酸內切酶將切割源 DNA和載體DNA連接酶將外源 DNA和載體連接，組成重組 DNA分子。將重組DNA分子引入受體細胞帶有重組體的細胞培養(yǎng)擴增，獲得大量的細胞繁殖群體篩選和鑒定轉化細胞進一步研究分析，實現功能蛋白的表達第二章 工具酶根據工具酶催化的反應類型分為四大類：①核酸酶，用于切割或降解核酸分子：②連接酶，可以把核酸分子連接起來：③聚合酶，用于核酸分子的擴增或拷貝：④修飾酶，能夠給核酸分子添增或除去核甘酸或某些化學基團。常用基因工程工具酶：限制性內切酶、甲基化酶、DNA連接酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶、磷酸激酶和磷酸酶、核酸酶、核酶。一、限制性內切酶1.R-M 系統(tǒng)：細菌中存在位點特異性限制酶和特異性甲基化酶，構成了寄主控制的限制—修飾系統(tǒng) (R-MRestriction-modificationsystem) 。細菌R-M系統(tǒng)的限制酶可以降解 DNA，為避免自身 DNA的降解，細菌可以修飾（甲基化酶）自身 DNA，未被修飾的外來 DNA則會被降解。2. 限制性核酸內切酶（限制酶） ：在細胞內能夠識別雙鏈 DNA分子中的特定核苷酸序列，并對 DNA分子進行切割的一種酶。 有3種限制性核酸內切酶，主要應用限制性核酸內切酶Ⅱ：是具有單一功能的酶，無甲基化作用，輔助因子2+為Mg, 識別特異性序列，在識別序列內或附近特異切割。限制性核酸內切酶的切割特點①在DNA分子雙鏈的特異性識別序列部位，切割DNA分子，產生鏈的斷裂。識別序列有連續(xù)的（如GATC）和間斷的(如GANTC)兩種，它們都呈回文結構②2個單鏈斷裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相對。斷裂結果形成的DNA片段，具有互補的單鏈延伸末端。三種酶切末端:平齊末端、5’粘性末端（如RⅠ）、3’粘性末端（如PstⅠ）Eco同裂酶：來源不同的限制酶識別相同的核苷酸靶序列。產生同樣的切割，形成同樣的末端。同尾酶：來源不同，識別的核苷酸靶序列也不相同，但切割后DNA分子產生的粘性末端相同的限制性核酸內切酶。限制性核酸內切酶的活性影響因素a底物DNA：DNA純度、DNA濃度（[DNA]過大，抑制酶活，影響酶分子擴散 ）、識別位點及鄰近位點特異性序列 、DNA二級/三級結構（超螺旋 DNA比線狀DNA需酶多）、提取時混入雜質可改變識別特異性b反應系統(tǒng)因素：緩沖液（無菌、無污染） 、金屬離子（Mg2+）、牛血清蛋白 (BSA是酶穩(wěn)定劑，可避免熱、表面張力、化學品導致的酶變性。過量 BSA會引起電泳拖尾。 )c星活性(可造成位點切割機率不等，降解不完全 )5.限制性核酸內切酶的應用 : 重組DNA前的切割 、構建新質粒 、構建物理圖譜 、DNA分子雜交、用限制性內切酶消化受體DNA、制備DNA探針 、亞克隆以用作序列分析 、基因定位，DNA同源性研究文檔實用6.甲基化酶分兩類： 維持性甲基化酶：用于在新合成的 DNA鏈上進行甲基化的酶，甲基化位置與模板鏈上的相同。構建性甲基化酶：用于在非甲基化的 DNA鏈上進行甲基化的酶。作用：封閉 DNA鏈中的某些識別位點，保護多余的限制性酶切位點。構建新的酶切位點7.核酸酶S1核酸酶 ：降解單鏈核酸。用于把具粘性末端的 DNA變?yōu)槠烬R末端的 DNA。在DNA部分變性條件下，能在富含 AT區(qū)切斷DNA。切除單鏈中的突出末端和雙鏈中的發(fā)夾結構核酶：具有酶活性的RNA片段，限制性內切酶二、DNA連接酶（ligase）能夠催化DNA中相鄰的3’-羥基和5’-磷酸基末端之間形成3′，5′-磷酸二酯鍵的酶+NMN）；②激活的機理：①有ATP（或NAD）提供AMP，形成酶-AMP復合物，同時釋放出焦磷酸基團或煙酰胺單核甘酸（AMP結合在DNA鏈5`端的磷酸基團上，產生含高能磷酸鍵的焦磷酸脂鍵；③與相鄰DNA鏈3`端羥基相連，形成磷酸二脂鍵，并釋放出AMP。DNA連接酶所連接的是DNA分子上相鄰核苷酸之間的切口，能將兩條獨立的DNA片段連接起來，無法連接缺少核苷酸的裂口和單鏈DNA。TDNA連接酶：可連接帶匹配粘性末端的DNA分子，也可使平端的雙鏈DNA分子相互連接。以ATP作為輔助因子4大腸桿菌DNA連接酶：只能連接帶匹配粘末端的DNA分子和帶有切口的雙鏈DNA分子。以+NAD作為輔助因子三、DNA聚合酶（DNApolymerase）指在DNA(或RNA)模板指導下，以4種脫氧核糖核苷酸（dNTP）為底物，在引物3’–OH末端聚合DNA鏈的一類酶。分類：①依賴于DNA的DNA聚合酶，包括聚合酶Ⅰ、Klenow、T4DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、TaqDNA聚合酶；②依賴于RNA的DNA聚合酶，逆轉錄酶。特點：①需模板(DNA或RNA)；②需引物；③具有三種酶活性，即5′→3′聚合酶活性；5′→3′外切酶活性和3′→5′外切外切酶活性。1.DNA雜交探針的制備雙鏈的DNA分子DNA酶Ⅰ處理使雙鏈的DNA分子的一條鏈帶有3’-OH末端的單鏈缺口polⅠ的5’-3’核酸外切酶活性從5‘-P移去一個核苷酸polⅠ（5’-3’聚合酶活性）將32P標記的核苷酸參入取代被移去的核苷酸(e) 重復(c)(d) 的步驟，缺口沿 5’-3‘方向移動，形成 32P標記的核苷酸合成的 DNA鏈探針：用來探知被測物存在的小 DNA或RNA叫做探針。標記物：探針上結合有易被檢測的化合物稱為標記物。分子雜交：探 DNA或RNA與被測物的互補結合叫做分子雜交（ molecularhybridization ）切口平移：5′端核苷酸不斷去除，而 3’端核苷酸同時加入，導致斷裂形成的切口沿著 DNA鏈按合成的方向移動。2.DNA聚合酶Ⅰ：5′→3′聚合，3′→5′和5′→3′外切活性Klenow（E.coliDNAPolymeraseⅠ經蛋白酶水解的大片段）無引物時3′→5′外切活性，有引物時5′→3′聚合活性用途：填補限制酶的 5′-粘性末端為平齊末端 、3′-末端標記.4. T4DNA聚合酶活性：5′→3′聚合活性；3′→5′外切活性，對單鏈活性大于雙鏈 DNA，外切酶活性比 Klenow 大200 倍。無引物時3′→5′外切活性，有引物時 5′→3′聚合活性用途： 填補或標記限制酶切后產生的 5′- 粘性末端的 3′-凹缺末端。（同Klenow）；3′-粘性末端的標記制備 DNA探針,同Klenow 末端標記。5.T7DNA聚合酶（測序酶）活性：5′→3′聚合，持續(xù)反應時間最長， 所以合成的 DNA鏈長。故在DNA測序中很優(yōu)越。 3′→5′外切，是DNA聚合酶Ⅰ的 1000倍。用途：復制較長的模板，在測序中可讀出較長的序列文檔實用用填補或交換反應快速進行末端標記。與T４DNApol一樣，平齊粘性末端。定點突變中互補鏈的合成。修飾的T7DNA聚合酶(測序酶)：5′→3′聚合6.TaqDNA：聚合最適溫度為 75-80℃，不具 3′→5′外切酶活性，聚合酶具 5′→3′外切活性 。用途：PCR反應。 測序，高溫下進行 DNA合成可減少模板二級結構。7.反轉錄酶：5’-3’聚合活性， RNAseH用途：對RNA:DNA雜交體中的 RNA特異性地降解，免除了在反轉錄完成后再用 NaOH降解RNA模板的步驟。以mRNA為模板合成其互補 DNA.8. RNA聚合酶（RNApolymerase）活性：在DNA指導下合成 RNA，結合于啟動子部位，轉錄無意義鏈 (一) 產生與有意義鏈相似 (以U代替模板中 T) 的鏈。四、修飾酶1.末端轉移酶 :催化dNTP摻入DNA3′-OH末端，形成同聚物末端；反應不需模板 DNA，需Co2+用途： 克隆DNA片段時加上互補同聚物末端，便于與載體連接。 末端標記2.磷酸激酶和磷酸酶磷酸激酶催化 5’-OH加P （標記）磷酸酶去除 5’-P （防止自身環(huán)化）第三章基因工程載體載體：這種能與目的基因結合，且有完整的復制和轉錄功能的 DNA大分子稱之為載體（ vector）。條件：（1）能夠在宿主細胞中存在并繁殖，有功能良好的復制子和啟動子，使插入基因復制和表達；（2）具有多種限制性內切酶的切點，且切點是單一的，這樣可將多個外源 DNA片段插入其中；（3）具有容易檢測的篩選標記；（4）載體DNA的分子量適當，可容納較大的外源 DNA片段，又可在受體細胞內擴增較多的拷貝；5）在細胞內穩(wěn)定性高，這樣可以使重組體可以穩(wěn)定傳代而不易丟失。基因工程載體克隆載體（clonevector）：主要是對目的基因克隆，建立DNA文庫和cDNA文庫，其上有復制子即可；表達載體（expressionvector）：能使目的基因在宿主細胞中表達的一類載體。這類載體既有復制子，更要有強啟動子；穿梭載體（shottlevector）：這類載體可以在原核細胞中復制，也可在真核細胞中擴增和表達。一、質粒載體共同組成部分：復制必須區(qū)、選擇標記基因、限制性核酸內切酶的酶切位點構型：閉合環(huán)狀DNA、開環(huán)DNA、線形DNA。電泳移率依次減少嚴緊型質粒：在宿主細胞中的拷貝數較少，一般只有1～3個。松馳型質粒：其拷貝數較多，一般20～60個，多的可達200～300個。轉移型，結合型粒（conjugativeplasmid）：是指一些質粒在不同的菌株中可以相互轉移。非轉移型質粒(non-conjugativeplasmid)：則只能在一種寄主中生存。理想質粒載體的必備條件：①具有較小的分子質量和較高的拷貝數。②具有若干限制性核酸內切酶的單一酶切位點③具有兩種以上的選擇標記基因（四環(huán)素抗性基因Tetr、氨芐青霉素抗性基因r基因⑤具有復制起始點Amp）④缺失mob克隆質粒載體：專用于基因或DNA片段無性繁殖的質粒載體pBR322組成：來自 pSCl01的四環(huán)素抗性基因 Tetr來自ColEl的衍生物 pMBl的松弛復制起點 orir來自RSF2124的氨芐青霉素抗性基因 Amp。文檔實用特點：具有多個單一的限制性內切酶位點。Tetr 中有BamH1切點（G↓GATCC）和SalⅠ切點（G↓AATTC），Ampr中有 PstⅠ切點（CTGCA↓G）。利用ColEl 的復制子，所以在細胞中是多拷貝的，可通過氯霉素使質?？截悢颠M一步擴增。篩選方法—重組克隆的 “插入失活”在一個基因位點中插入外源 DNA片段，從而使該基因活性喪失的現象叫插入失活。rr插入在Amp中，在含有氨卞青霉素培養(yǎng)基上不生長，在在含有四環(huán)素培養(yǎng)基可生長而在兩種抗生素培養(yǎng)基上都生長的是非重組型。2.pUC系列質粒載體組成：pBR322質粒的復制起點氨芐青霉素抗性基因 Ampr大腸桿菌 LacZ′基因多克隆位點鑒別方法LacZ′基因編碼β-半乳糖苷酶氨基端 146個氨基酸 ，可以和β-半乳糖苷酶缺陷型的大腸桿菌實現基因內互補，即α—互補 ，產生β-半乳糖苷酶能力。 X-gal 也是β-半乳糖苷酶的一種底物， 經降解后可生成溴氯吲哚，使大腸桿菌菌落呈藍色。當無β -半乳糖苷酶時， X-gal 不被分解，菌落呈白色。 當外源基因插入到 pUC質粒的LacZ′基因內部，則LacZ′基因受到破壞，便不能再和缺陷型受體菌中生成有活性的β -半乳糖苷酶，因此，菌落呈白色。反之，非重組體為藍色菌落。含Ampr抗性基因，可通過插入失活和顏色反應進行雙重篩選。表達載體：專用于宿主細胞中高水平表達外源蛋白質的質粒載體。細胞中高水平表達外源蛋白質的質粒載體。應含有：（1）強啟動子（2）在啟動子下游區(qū)和ATG上游區(qū)有一個好的SD序列。（3）在外源基因插入序列下游區(qū)要有一個強的轉錄終止序列，保證外源基因有效轉錄和質粒的穩(wěn)定性。二、噬菌體載體λ噬菌體顆粒中DNA為線狀雙鏈DNA分子，全長48502bp，兩端各有一段長度為12個核苷酸的互補單鏈（粘端），稱為cos位點。三個片段組成：左臂（含噬菌體頭、尾蛋白質編碼基因）、中央片段為非必需區(qū)（外源基因插入）、右臂（調節(jié)、復制、裂解基因）λ噬菌體的缺陷：⑴基因組太大（49kb）；⑵酶切點太多，⑶野生型只能接納一定長度的DNA。λ噬菌體的改造：⑴切去非必須區(qū)段，在切去的同時，加載目的基因（2.5kb或更大）；⑵去處太多的酶位點，每種酶只留1-2個切口；⑶增加標記基因（remarkegene）。1.插入型載體（只有1～2種限制性核酸內切酶的單一切割位點）①失去了非必需區(qū)②僅保留了EcoRⅠ的單一切點③切點又位于報告基因上，故在切開DNA并插入外源基因后，報告基因失活，即可依此進行重組體的篩選④可插入長度為10kb的外源DNA有免疫功能失活、大腸桿菌β-半乳糖苷酶失活插入型載體2.替換型載體：在其中央部位有一個可以被外源插入的DNA分子取代的DNA片段的克隆載體選擇標記：只有λDNA的長度大于野生型λ噬菌體DNA長度的75％而不超過其105％時，才能被包裝成噬菌體顆粒重組子被包裝、非重組子不被包裝λ噬菌體載體是主要用于cDNA文庫構建，也經常用于外源目的基因的克隆。λ噬菌載體作為載體，其重組噬菌體DNA大小只能：38kb~52kb。三、單鏈DNA噬菌體載體M13噬菌體載體產生單雙鏈DNA的機制a以（+）鏈DNA為摸板，合成互補（－）鏈，該雙鏈稱復制型DNA（RFDNA）。bRFDNA在宿主細胞內能快速增殖，可增加到每個細胞約200個拷貝。文檔實用c單鏈特異的 DNA結合蛋白結合在（ +）鏈上，從而阻斷了其互補鏈，即（－）鏈的合成，這樣，細胞就會不斷的合成+）鏈DNA。d游離出來的（ +）鏈DNA先與基因 V的編碼產物形成特異的 DNA-蛋白質復合物，然后轉移到寄主細胞膜，同時基因V的蛋白質從（+）DNA鏈上脫落下來，余下的 M13（+）鏈DNA則是從其感染的寄主細胞的細胞膜溢出的過程中，被外殼蛋白包裝成病毒顆粒的。四、植物基因工程載體Ti質粒是農桿菌非染色體的環(huán)狀雙鏈DNA分子結構1）T－DNA區(qū)（transferred-DNAregions ）：T-DNA是農桿菌侵染植物細胞時，從 Ti 質粒上切割下來轉移到植物細胞的一段 DNA，故稱之為轉移 DNA。該DNA片段上的基因與腫瘤的形成有關。致瘤基因、冠癭堿合成酶及其分解基因（2）Vir 區(qū)（virulenceregion ）：該區(qū)段上的基因能激活 T-DNA轉移，使農桿菌表現出毒性，故稱之為毒性區(qū)。T-DNA區(qū)與Vir 區(qū)在質粒 DNA上彼此相鄰，合起來約占 Ti 質粒DNA的三分之一。3）Con區(qū)（regionsencodingconjugations ）：該區(qū)段上存在著與細菌間接合轉移相關基因（ tra），調控Ti 質粒在農桿菌之間的轉移。冠癭堿能激活 tra 基因，誘導 Ti 質粒轉移，因此稱之為接合轉移編碼區(qū)。（4）Ori 區(qū)（originofreplication ）：該區(qū)段基因調控 Ti 質粒的自我復制起始?！半p元載體” ，也稱反式載體，是指由兩個分別含 T-DNA和Vir 相容性Ti質粒構成的雙質粒系統(tǒng)。五、動物基因工程載體SV40第四章：核酸操作的基本技術1、核酸的提取與純化：提取的方法有很多，其中最常用的是化學試劑提取法和離心分離法。在核酸提取中，應去除蛋白質和多糖等的污染，在RNA提取中，還要嚴格防止RNA酶的污染。細胞裂解1） 酶法：利用某些細胞壁裂解酶使細胞變?yōu)樵|體，然后加去垢劑使原生質體裂解。酶法裂解時要注意細胞的生長條件和生長時間，反應時盡可能滿足酶的最佳反應條件。2）機械法：壓力剪切法射擊破碎法固體研磨法反復凍融法RNA的分離與純化1） 制備RNA的關鍵—防止內外源 RNase的作用2） 總RNA的制備2、核酸的檢測與保存核酸檢測常用的方法有： 紫外光譜分析法 熒光分析法 瓊脂糖凝膠電泳法核酸的保存：酸性條件下保存、堿性條件下保存 低溫條件下保存3、核酸的凝膠電泳： 瓊脂糖凝膠電泳 聚丙烯酰胺凝膠電泳 脈沖電場凝膠電泳電泳的原理：將某種分子放到特定的電場中，它就會以一定的速度向適當的電極移動。某物質在電場作用下的遷移速度叫作電泳的速率，它與電場強度成正比，與該分子所攜帶的凈電荷數成正比，而與分子的磨擦系數成反比（分子大小、極性、介質的粘度系數等） 。染色：在凝膠電泳中，一般加入溴化乙錠（ EB）--ethidium bromide 染色，此時，核酸分子在紫外光下發(fā)出熒光，肉眼能看到約 50ngDNA所形成的條帶。4、核酸分子雜交1）探針的制備： 探針（probe）：用來探知被測物存在的小分子 DNA或RNA。標記物：探針上結合的易被檢測的化合物。分子雜交：探針DNA或RNA與被測物的互補結合叫分子雜交。2）核酸雜交： 原理是，帶有互補的特定核苷酸序列的單鏈 DNA或RNA，當它們混合在一起時，其相應的同源區(qū)段將會退火形成雙鏈的結構。（1）、SouthernDNA 印跡轉移技術： 根據毛細管作用的原理，使在電泳凝膠中分離的 DNA片段轉移并結合在適當的文檔實用濾膜上，然后通過同標記的單鏈DNA或RNA探針的雜交作用檢測這些被轉移的DNA片段（2）、NorthernRNA印跡雜交：將RNA分子從電泳凝膠轉移到硝酸纖維素濾膜或其他化學修飾的活性濾紙上，進行核酸雜交的一種實驗方法（a）基因組DNA3）、斑點印跡雜交：是在Southern印跡轉移技術的基礎上發(fā)展而成的快速檢測特異核酸分子的核酸雜交技術適用于核酸樣品的定量檢測，而不是定性檢測DNA限制片段菌落雜交（b）（c）（d）硝酸纖維素濾膜同探針同源雜交的基因DNA片段第五章聚合酶鏈式反應式（e）1、聚合酶鏈式反應擴增原理X光底片1）、PCR：用于在體外酶促擴增特定DNA片段的快速方法2）、原理：PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成類似于DNA的體內復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。①模板DNA變性：模板 DNA經94℃左右加熱一定時間后，雙鏈 DNA模板或經 PCR擴增形成的雙鏈 DNA解離成為單鏈。②模板DNA與引物的退火 (復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至 55℃左右，引物與模板 DNA單鏈的互補序列配對結合。③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在 TaqDNA聚合酶的作用下， 以dNTP為反應原料，靶序列為模板， 按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板 DNA鏈互補的單鏈。變性--退火--延伸三步驟的重復循環(huán)，就可獲得更多的“模板互補鏈” ，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。多次循環(huán)后目的基因擴增放大幾百萬倍。2、聚合酶鏈式反應體系（一）PCR反應體系：參與 PCR反應的主要成份 :模板、引物、dNTP、TaqDNA聚合酶和緩沖液等。（1）、模板：包括基因組 DNA、RNA、質粒DNA、線粒體 DNA等，模板 DNA需較高的濃度 RNA作為模板時，須先將 RNA逆轉錄為cDNA，再以cDNA作為擴增的模板2）、引物：引物決定PCR擴增產物的特異性和長度，是化學合成的寡核苷酸片段3）、脫氧核苷三磷酸（dNTP）：是dATP、dCTP、dGTP和dTTP4種脫氧核苷三磷酸的混合物4）、DNA聚合酶：比較常用的酶有：大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow片段），具5′→3′DNA聚合酶活性，3′→5′外切酶活性TaqDNA聚合酶：有很高的耐熱穩(wěn)定性。功能：具5′→3′DNA聚合酶活性，5′→3′外切酶活性；特點：高度耐熱，最佳溫度75℃—80℃;在序列分析和PCR中應用廣泛.T4DNA聚合酶功能：A、具5′-凸端補平效果B、5′→3′外切酶活性C、3′→5′外切酶活性D、用與制備探針和加減法DNA序列分析Taq酶的作用:模板指導下，以dNTP為原料，在引物3’-OH末端加上脫氧單核苷酸，形成3’,5’-磷酸二酯鍵，使DNA鏈沿5’→3’方向延伸，催化DNA合成。文檔實用（5）、鎂離子濃度： Taq酶的活性只與游離的 Mg2+濃度有關， 但PCR反應體系中 dNTP、引物、模板 DNA及鰲合劑的存在均可與 Mg2+結合而降低游離 Mg2+的濃度從而影響酶的活性。（6）、其它反應因素 ：pH 鹽 基質（二）PCR的反應條件 ：反應溫度（變性、退火、延伸）反應時間（變性、退火、延伸）循環(huán)次數（PCR效率及產物量）溫度：變性溫度：94~97 ℃退火溫度：低于引物 Tm5℃左右，溫度過高：降低擴增效率； 溫度過低：增加非特異性擴增延伸溫度：72度，此時Taq酶具有較高的酶促活性時間：第一次變性應給予足夠時間（ 5~7 分鐘）每一個步驟所需時間取決于擴增片段的長度，一般為 30秒~1分鐘，時間過長易導致非特異性擴增循環(huán)次數：重復次數一般設為 25～35個循環(huán)（三）引物設計的一般原則（1）引物長度應為 15~30個核苷酸，Tm可按下列簡單公式計算： Tm=（G+C）x4+（A+T）x22）引物中堿基的分布應當是隨機的，避免出現一連串的單一堿基或產生二級結構。3）G+C堿基的含量在45%~55%左右。4）兩個引物在3端均必須與模板互補，5端可以不互補。（5）引物自身連續(xù)互補堿基小于4個。（6）引物之間連續(xù)互補堿基亦應小于4。3、聚合酶鏈式反應技術類型一、已知DNA序列的聚合酶鏈式反應擴增（一）巢式PCR巢式PCR是為了增加擴增的靈敏度，對已知序列設計出第一對引物，擴增25個循環(huán)。然后根據序列設計出第二對引物，它和已擴增出序列內部兩條鏈序列互補，繼續(xù)再擴增25個循環(huán)。（二）熱巢式PCR：是巢式PCR的改進技術。（三）半巢式PCR：為了節(jié)省材料，往往在設計巢式引物時，利用第一對引物中的一個引物，再從靶序列內部設計出另一個引物，效果與巢式PCR相同。（四）不對稱PCR：不對稱PCR多用于序列分析。（五）等位特異性PCR：等位特異性PCR，即AS-PCR，又稱擴增受阻突變體系是為檢測點突變而設計的。（六）PCR-單鏈構象多態(tài)1、原理和方法：PCR-單鏈構象多態(tài)(singlestrandconformtionpolymorphism,SSCP)2、特點：PCR-單鏈構象多態(tài)(PCR-SSCP)的優(yōu)點是簡單、快速、靈敏度高，可同時處理多個樣本。（七）競爭引物PCR：競爭引物PCR（COP-PCR）針對靶DNA一個測點突變設計出兩個等位特異性寡核苷酸（allelespecificoligonucleotide,ASO），一個為正常引物，另一個為突變引物。（八）降落PCR：降落（TD）PCR代表了一種完全不同的PCR優(yōu)化方法，它不是用許多反應管和每管用不同的試劑濃度和（或）循環(huán)參數，而是一個反應管或一小組反應管，在適合于擴增目的產物而的不到人為產物或引物二聚體的循環(huán)條件下反應。二、逆轉錄聚合酶鏈式反應先用逆轉錄酶作用于 mRNA，以寡聚dT為引物合成 cDNA第一鏈，然后用已知一對引物，擴增嵌合分子， 這種方法稱為逆轉錄（reversetranscription,RT ）PCR，即RT-PCR。逆轉錄反應 ：用于該反應的引物可以是隨即六聚體核苷酸，也可以是 oligo(dT)n 。三、已知cDNA一端序列獲得全長 cDNA的聚合酶鏈式反應（一）快速擴增 cDNA末端技術PCR用于擴增代表 mRNA轉錄物某單一位點與 3‘或5’末端之間的部分 cDNA稱為快速擴增 cDNA末端技術（rapidanplificationcDNAend,RACE ）。（二）新RACE5 ’RACE是通過反轉錄酶將目的 mRNA完整地變成第一鏈 cDNA。因為過早終止的第一鏈 cDNA，其有效性文檔實用像全長cDNA一樣，可用末端轉移酶同樣有效地加尾。四、已知側翼序列聚合酶鏈式反應擴增（一）染色體步移-反向PCR已知側翼序列可以擴增靶序列，稱為染色體步移-反向PCR（inversePCR）。PCR通常用于擴增位于兩寡核苷酸引物之間的DNA區(qū)段，但是經特殊設計的PCR也可以擴增那些位于已知序列外側的序列，這就是反向PCR。（二）鍋餅PCR五、未知序列聚合酶鏈式反應擴增：1、島嶼獲救PCR的原理六、定量聚合酶鏈式反應（一）競爭性聚合酶鏈式反應用于定量測定mRNA（二）熒光定量聚合酶鏈式反應七、免疫相關聚合酶鏈式反應（一）免疫聚合酶鏈式反應（immunePCR,免疫PCR）（二）酶聯免疫吸附分析-聚合酶鏈式反應（ELISA-PCR）八、聚合酶鏈式反應技術衍生的分子標記4、聚合酶鏈式反映技術應用一、核酸的基礎研究二、序列分析三、檢測基因表達四、從cDNA庫中放大特定序列五、研究已知片段鄰近基因或未知DNA片段六、進化分析七、醫(yī)學應用八、分析生物學證據九、性別控制十、轉基因檢測第六章DNA文庫的構建和目的基因的篩選外源基因：插入到載體內的那個特定的片段基因。目的基因：那些已被或者準備要分離、改造、擴增或表達的特定基因或DNA片段?；蛭膸?genelibrary)又稱DNA文庫，是指某個生物的基因組DNA或cDNA片段與適當的載體在體外重組后，轉化宿主細胞，并通過一定的選擇機制篩選后得到大量的陽性菌落(或噬菌體)，所有菌落或噬菌體的集合即為該生物的基因文庫?；蛭膸煊赏庠碊NA片段、載體和宿主組成。構建基因文庫的基本程序：1)提取研究對象基因組DNA，制備合適大小的DNA片段，或提取組織或器官的mRNA并反轉錄成cDNA；2)DNA片段或cDNA片段與經特殊處理的載體連接形成重組DNA；3)重組DNA轉化宿主細胞或體外包裝后侵染受體菌；4)陽性重組菌落或噬菌斑的選擇。一、基因組DNA文庫的構建載體可以分為：質粒文庫、噬菌體文庫、粘粒文庫、人工染色體文庫（細菌人工染色體文庫、酵母人工染色體文庫）。構建的程序：①載體DNA的制備；②高純度大相對分子質量基因組DNA的提取和大片段的制備；③高純度大相對分子質量基因組DNA的部分酶切與脈沖電泳分級分離；④載體與外源片段的連接與轉化或侵染宿主細胞；⑤重組克隆的挑選和保存。1.λ噬菌體載體文庫（9~22kb）：先以限制性內切酶酶切基因組DNA和λ噬菌體，切除λ噬菌體DNA的非必需區(qū)，目的基因與λ噬菌體載體連接，再經過體外包裝重組λ噬菌體顆粒，感染大腸桿菌，通過噬菌體空斑篩選。粘粒文庫（33~46kb）：粘粒組成：噬菌體DNA包裝序列（cos）、復制原點、藥物抗性基因和多克隆位點。DNA插入片段的兩端分別與一個粘粒相連，其它構建過程與λ噬菌體文庫相似。重組的的粘粒可以通過體外包裝以噬菌體的形式感染大腸桿菌，也可以用標準的質粒轉化方法直接導入大腸桿菌中進行增殖。以抗生素培養(yǎng)基、噬菌斑選擇重組子。3.酵母人工染色體文庫（ 100~200kb）：用兩種限制性內切酶酶切酵母菌 DNA為2個末端片段，與目的基因片段連接組成完整的YAC載體導入酵母細胞中。用不含色氨酸的培養(yǎng)基選擇 YAC重組子。4.基因組DNA文庫克隆子的保存與篩選：保存：影印膜濾保存法、文庫在液體培養(yǎng)基中擴增保存、保存單個克隆子于含有甘油的培養(yǎng)基中篩選：表型篩選法：表達性狀易于鑒別，如互補篩選抗性篩選法：如二氫葉酸還原酶可以使三甲芐二氨嘧啶降解，而該化學物可抑制大腸桿菌生長分子雜交法：利用分子探針對文庫進行篩選免疫篩選法：利用多肽等作為抗原進行原位雜交篩選文檔實用PCR篩選法：根據保守序列合成引物，擴增特異性片段二、cDNA文庫構建構建的步驟：細胞總RNA的提取和 mRNA的分離；第一條 cDNA合成；第二條 cDNA合成；雙鏈 cDNA克隆進質?；蚴删w載體并導入宿主中繁殖；鑒定和保存。1細胞總RNA的提取和 mRNA的分離纖維素柱層析法：纖維素上的poly(dT)與mRNA的poly(A)尾結合。慈珠分離法：慈珠上的oligo(dT)與mRNA的poly(A)尾結合2第一鏈cDNA的合成：oligo(dT) 引導的 DNA合成法：利用真核 mRNA分子所具有的 poly(A) 尾巴的特性，加入 12-20個脫氧胸腺嘧啶核苷組成的oligo(dT) 短片段，由反轉錄酶合成 cDNA的第一鏈。缺陷：因為逆轉錄酶無法到達 mRNA分子的5’－末端，必須從 3’－末端開始合成 cDNA。對于大分子量的較長的mRNA分子而言，特別麻煩。隨機引物引導的 cDNA合成法(randomlyprimedcDNAsynthesis) ：根據許多可能的序列，合成出 6-10個核苷酸長的寡核苷酸短片段（混合物） ，作為合成第一鏈 cDNA的引物。在應用這種混合引物的情況下， cDNA的合成可以從 mRNA模板的許多位點同時發(fā)生，而不僅僅從 3’-末端的oligo(dT) 引物一處開始。3第二鏈cDNA的合成將上一步形成的 mRNA-cDNA雜合雙鏈變成互補雙鏈 cDNA的過程。1）自身引導合成法： 用加熱或堿處理 mRNA-cDNA變性，降解 RNA，獲得的單鏈 cDNA3’端會形成發(fā)夾結構的能力，以此作為第二鏈合成的引物，在大腸桿菌聚合酶 IKlenow或反轉錄酶的作用下，合成 cDNA的第二鏈，再用 S1核酸酶切割cDNA的發(fā)夾狀結構。缺點： 在以S1核酸酶切割 cDNA的發(fā)夾狀結構時，會導致對應于 mRNA5’端的地方的序列出現缺失和重排。 S1核酸酶的純度不夠時，會偶爾破壞合成的雙鏈 cDNA分子。2）置換合成法 ：以第一鏈合成產物 cDNA：mRNA雜交體作為切口平移的模板， RNA酶H在雜交體的 mRNA鏈上造成切口和缺口，產生一系列 RNA引物，在大腸桿菌 DNA聚合酶I 的作用下合成 cDNA的第二鏈。T4噬菌體DNA聚合酶填補平口末端。獲得的雙鏈 cDNA5’端也會有幾對堿基缺失優(yōu)點：a）合成cDNA的效率高 b）直接利用第一鏈的反應產物，不需純化 c）避免使用 S1核酸酶來切割雙鏈 cDNA3）引導合成法（PCR）：以cDNA第一鏈為模版，設計并合成一組引物，通過PCR擴增獲得的雙鏈cDNA能保留完整的5’端序列4）引物-銜接頭法文檔實用4雙鏈cDNA克隆進質?；蚴删w載體并導入宿主中繁殖cDNA末端的處理：添加特異性核酸接頭以形成適合于克隆的黏性末端末端轉移酶—可以向cDNA末端加上與克隆載體末端互補的尾部雙鏈cDNA的克?。弘p鏈平頭的cDNA通?？梢允褂孟铝腥N方法克隆入載體中：1>平頭末端直接與載體連接，但插入的片段無法回收2>平頭兩端分別接同聚物尾，最好是 AT同聚物尾，這樣重組分子可通過加熱局部變性和 S1核酸酶處理回收插入片段3>加裝人工接頭引入酶切口，以便插入片段回收三、基因文庫的篩選與鑒定重組體（轉化子）：就是摻入或導入外源 DNA后獲得了新遺傳標志的細菌細胞或其他受體細胞。篩選表型篩選法抗藥性篩選:這是利用載體DNA分子上的抗藥性選擇標記進行的篩選方法。插入失活篩選法顯色反應選擇法(α-互補法)2.PCR篩選法：利用合適的引物，以從初選出來的陽性克隆中提出的質粒為模板進行PCR，通過對PCR產物的電泳分析，確定目的基因是否插入到載體中。菌落原位雜交法（右圖）免疫篩選法基因文庫的鑒定限制性核酸內切酶分析：當載體與外源基因進行連接時，都需要對其進行酶切，而且這些內切酶都是已知的，因此可以從初步篩選出來的陽性重組菌中提取質粒 DNA，然后用已知的內切酶進行酶切，酶切進行瓊脂糖凝膠電泳，如果出現與預知的大小一致的電泳片段，就證明已經有目的基因插入到載體中。2Southern Blotting ：①將DNA的限制性核酸內切酶的酶切片段從瓊脂糖凝膠上轉移到硝酸纖維素膜或尼龍膜上；②用各種標記的DNA探針同固定在膜上的DNA片段雜交，經放射自顯影或其它顯色方法確定出與探針互補的電泳帶。DNA序列測定第七章 DNA體外重組與基因轉移目的基因與載體的連接：一、粘末端 DNA片段的連接文檔實用（一）具有相同粘末端的 DNA分子之間的連接使用堿性磷酸酶處理載體 DNA，去掉其 5’末端的磷酸基，以防質粒 DNA的自身環(huán)化 。（二）具有不同粘性末端的 DNA分子之間的連接用兩種不同的限制性內切酶對載體和外源 DNA進行切割后，在它們兩端會產生非互補的突出端，經 DNA連接酶連接后即產生定向重組體。二、平末端 DNA片段的連接1、直接用 T4連接酶連接 2、同聚物加尾法 3 、銜接物連接法：銜接物是指用化學方法合成的一段由 10～12個核苷酸組成，具有一個或數個限制酶識別位點的平末端的雙鏈寡核苷酸片段4、DNA接頭連接法 ：接頭的一端是齊平的，而另一端是某種內切酶的粘性末端，先利用齊平末端連接方法將它與平端的外源DNA連接起來，造成人工粘性末端，即可再與之互補的粘性末端的載體 DNA相連接。三、載體與 DNA片段酶切位點不匹配的連接所謂載體與DNA片段酶切位點不匹配，指載體與待克隆的DNA片段上的酶切位點不相同，因而用一種或兩種酶切制造不出可互補的粘性末端。1、按照平末端連接方法加上接頭。2、將凹端變?yōu)槠蕉?）使用Klenow 酶在4 種dNTP存在下，將 3′凹端完全補平。2）用S1 核酸酶去除 3′突出末端產生平端 DNA分子。3、使用大腸桿菌 DNA聚合酶IKlenow 片段部分補平 3′凹端轉變成粘端。四、cDNA與載體的連接基因轉移：向原核細胞的基因導入可采用化學轉化法和電擊轉化法。真核細胞的基因轉移有借助于載體的基因轉移和不需載體的基因轉移，前者主要是靠動植物病毒的感染來完成；后者有磷酸鈣沉淀法、脂質體介導法、血影細胞介導法、電穿孔轉移法等。第八章 重組DNA分子的篩選與鑒定一、遺傳檢測法：（一）根據載體表型特征選擇重組體分子1、抗藥性標記插入失活篩選法： 例：pBR322如果外源基因插入到 tetr 基因內部，tetr 抗性消失，表型為不抗四環(huán)素（ tets）、而仍抗氨芐青霉素（ ampr），這樣的轉化細胞在含有 amp的培養(yǎng)基仍可生長，但在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上不能再生長；反之，如果 ampr 基因由于外源基因插入其內部而失活，帶有重組 DNA分子的轉化細胞在含有 tet 的培養(yǎng)基平板上生長，在含有 amp的培養(yǎng)基不能生長。2、α—互補 ：例；pUC質粒在LacZ—的大腸桿菌中，在平板培養(yǎng)中，菌落是白色的。若在該細胞中引入 pUC質粒，其上有 LacZ′，質粒和大腸桿菌DNA可實現α—互補，菌落呈藍色。如果在質粒的多克隆位點的某個酶切點上克隆了外源基因，則 LacZ′基因受到破壞，便不能再和缺陷型受體菌中生成有活性的β -半乳糖苷酶，因此，菌落呈白色。（二）根據插入序列的表型特征選擇重組體二、物理檢測法 ：1、凝膠電泳檢測法 2、R-環(huán)法三、核酸雜交檢測法1.菌落印跡原位雜交 2. 斑點印跡雜交 3.Southern 印跡雜交四、免疫化學檢測法免疫化學檢測法是利用抗體與抗原結合的高度特異性來鑒別基因的。如果某個重組克隆中的外源基因能夠表達，在這個克隆中就存在著這個基因的特定蛋白，即可用特異性抗體來檢測。常用的有標記抗體測定法和免疫沉淀測定法兩種。五、DNA-蛋白質篩選法六、轉譯篩選法第九章 基因表達文檔實用基因表達是指結構基因在生物體中的轉錄、翻譯以及所有加工過程。宿主細胞分為兩大類：第一類為原核細胞： 常用有大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、鏈霉菌等；第二類為真核細胞： 常用有酵母、絲狀真菌、哺乳動物細胞等。⒈真核基因在原核細胞中表達載體必須具備條件：⑴載體能夠獨立復制。載體本身是 一個復制子，具有復制起點。⑵應具有靈活的克隆位點和方便的篩選標記，以利于外源基因的克隆鑒定和篩選。⑶應具有很強的啟動子，能為大腸桿菌 RNA聚合酶所識別。⑷應具有阻遏子，使啟動子受到控制，只有當誘導時才能進行轉錄。⑸應具有很強的終止子，只轉錄克隆的基因，所產生的mRNA較為穩(wěn)定。⑹所產生的mRNA必須具有翻譯的起始信號AUG和SD序列，以便轉錄后順利翻譯。一、大腸桿菌中的基因表達大腸桿菌表達載體的組成：選擇標記基因、載體的復制起點、供外源基因正確插入的多克隆位點、啟動子、轉錄終止子、翻譯起始序列、翻譯增強子、翻譯終止子等。啟動子1)Lac啟動子：包括啟動子、活化蛋白（ CAP）結合位點、操作子及 lacZ。野生型Lac啟動子要啟動轉錄條件：有活化蛋白及cAMP等正調控因子和乳糖或IPTG等解除負調控的物質同時存在LacUV5僅有乳糖或IPTG存在就能啟動轉錄。2）Trp啟動子：包括啟動子、衰減子、操縱子及 trpR的部分結構基因。由阻遏蛋白和衰減子調控。 trpR基因產生的阻遏蛋白只有與色氨酸結合時才能轉化為活性蛋白與操縱子結合阻止轉錄起始。當色氨酸濃度高時，在衰減子的作用下，操縱子 DNA可以形成類似終止子的莖環(huán)結構?？梢酝ㄟ^除去色氨酸或增加 IAA。3）Tac啟動子：Lac啟動子和 Trp啟動子的雜合啟動子。4）PL啟動子：受cI所編碼的阻遏蛋白的調控，阻遏蛋白與 PL啟動子結合，阻止基因的轉錄。 cI編碼阻遏蛋白受溫度控制，當在 28~30℃下，cI所編碼的阻遏蛋白具有活性；當溫度升高到 42℃時，阻遏蛋白失活。轉錄終止子:轉錄終止，增強mRNA分子的穩(wěn)定性。3.翻譯起始序列：決定mRNA的翻譯起始效率。增強方法：①在核糖體結合位點（PBS）的序列結構中，增加腺嘌呤和胸腺嘧啶脫氧核苷殘基含量的比例，誘發(fā)特異堿基發(fā)生點突變。②使用翻譯偶聯系統(tǒng)進行克隆基因表達等。4.翻譯增強子：增強異源基因表達的特殊序列元件，如大腸桿菌mRNA分子5`-UTR中富含U的區(qū)段。5.翻譯終止子：UAA6常用的表達載體⑴pBV220系統(tǒng)：①來源于pUC8多克隆位點②核糖體 rrnB基因終止信號 ③pBR322第4225～3735位 ④pUC18第2066～680位 ⑤λ噬菌體 cIts857 抑制子基因及 PR啟動子 ⑥pRC23的PL啟動子及SD序列2）融合表達質粒 pBG-2：含有啟動子 Lac和操縱子Lac、S-D序列、lacI阻遏蛋白基因3）分融合表現型蛋白載體 Pkk223-3：啟動子由 Trp啟動子的-35區(qū)、LacUV5啟動子的-10區(qū)、操縱子及 S-D序列組成。7.外源蛋白表達部位1）在胞內直接表達重組蛋白（包涵體：胞內不溶性蛋白聚集成的晶體） 2）重組蛋白分泌到周質3）重組蛋白分泌到胞外培養(yǎng)基中 4 ）以融合形式表達重組蛋白影響目的基因在大腸桿菌中表達的因素⑴外源基因的拷貝數 ⑵外源基因的表達效率：①啟動子的強弱 ②核糖體接合位點的有效性 ③SD序列和起始密文檔實用碼ATG的間距 ④密碼子組成 ⑶表達產物的穩(wěn)定性 ⑷細胞代謝負荷 ⑸工程菌的培養(yǎng)條件第十章 微生物基因工程一、實現外源基因表達的基本操作原核細胞表達真核基因存在困難①原核細胞 RNA聚合酶不能識別真核基因的啟動子。② 由于真核基因為不連續(xù)基因，因而必須將內含子切除后才能成為成熟的 mRNA，但原核細胞中缺乏真核細胞的轉錄后加工系統(tǒng)。③ 在原核細胞中， mRNA必須含有SD序列才能和核糖核蛋白體結合，從而指導蛋白質的合成。而真核基因轉錄的 mRNA缺少SD序列。④ 真核基因在原核細胞表達產生的外源蛋白很不穩(wěn)定，容易被細胞蛋白酶所破壞。1、啟動子的選擇： 基因要進行有效的表達，最基本的要求是要有一個強有力、可調控的啟動子。強有力的啟動子課余RNA聚合酶緊密結合，帶動下游的基因進行高效轉錄；啟動子的可調控性，是為了精確地控制基因的轉錄速度及開始轉錄的時間。2、大腸桿菌的密碼子偏愛性及密碼子的正確選擇獲得最佳表達：（1）更換同義密碼子法。（2）外源基因和相關tRNA同步克隆法二、大腸桿菌工程菌的構建策略（一）包涵體型異源蛋白的表達1、包涵體的組成和特點：以包涵體形式表達重組異源蛋白的優(yōu)點：①外源基因表達的蛋白質分離易達到高純度和高濃度。②異源重組在大腸桿菌細胞內的穩(wěn)定性主要取決于形成包涵體的速度。③以包涵體形式存在的外源基因表達產物沒有活性，對于那些有毒性的表達蛋白來說，以包涵體形式存在則使宿主細胞免受傷害。2、重組異源蛋白包涵體表達系統(tǒng)的構建：方法：將外源基因插入到原核表達載體強啟動子和有效的S-D序列的下游，表達產物位于胞內，氨基端和羧基端不含有其他蛋白或多肽序列。（二）分泌型異源蛋白的表達：1、分泌型異源蛋白的表達2、蛋白傳輸分泌機制3、分泌型異源蛋白的表達系統(tǒng)的構建（三）融合型異源蛋白的表達特點：①穩(wěn)定性大大增加。②分離純化程序簡單。③表達效率較高。異源蛋白從融合蛋白中的回收：化學法和酶解法（四）提高大腸桿菌中外源基因表達效率的策略1、寡聚型異源蛋白的表達：（1）多表達單元型重組（2）多順反子型重組（3）多編碼序列型重組2、整合型異源蛋白的表達整合型外源基因表達系統(tǒng)的構建步驟：①以外源DNA片段插入后不影響細胞的正常生理功能為前提，探測并鑒定受體菌染色體DNA的整合位點。②克隆分離選定的染色體整合位點，并進行序列分析。③將外源基因以及必要的可控性表達元件連接到已克隆的染色體整合位點中間或鄰近區(qū)域。④將上述重組質粒轉入受體細胞中。⑤篩選和擴增整合了外源基因的受體細胞。3、蛋白酶抗性或缺陷型表達系統(tǒng)的構建： （1）細胞內蛋白降解的基本特征（ 2）蛋白酶缺陷型受體細胞的改造3）抗蛋白酶的重組異源蛋白序列設計三、基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性及其對策（一）工程菌遺傳不穩(wěn)定性的表現與機制；不穩(wěn)定性的主要形式：（1）重組DNA分子某一區(qū)域發(fā)生缺失、重排或修飾。（2）整個重組 DNA分子不穩(wěn)定，從而使部分重組 DNA分子子代細胞不帶質粒。（二）改善工程菌不穩(wěn)定性的對策： 1、改善載體宿主系統(tǒng) 2、施加選擇壓力 3 、控制外源基因過量表達4、優(yōu)化培養(yǎng)條件 5 、固定化四、酵母菌的載體系統(tǒng)： 一般分為質粒載體、酵母整合載體（ YIP）、酵母人工染色體（YAC）。質粒載體分為酵母附加型質粒（ YEP）、酵母復制質粒（ YRP）酵母著絲粒質粒（ YCP）（一）酵母載體的基本結構 ：1、DNA復制起始區(qū) 2、選擇標記一類是酵母宿主為營養(yǎng)缺陷型、一類是顯性標記； 3、整合介導 4、有絲分裂穩(wěn)定區(qū) 5、表達盒它主要由轉錄啟動子和終止子組成（二）酵母質粒載體及其構建：文檔實用1、釀酒酵母中的 2um環(huán)狀質粒，他在宿主細胞核內的拷貝數可維持在 50-100之間，其復制的控制模式與染色體 DNA完全相同2、YEP質粒，廣泛應用于外譯蛋白質胞外表達，是在 2um質?；A上，加入了酵母核DNA序列以及 E.coli 質粒pMB9的部分序列構建而成3、ycp質粒：著絲粒區(qū)域染色體均勻分配的重要順式作用元件。將該區(qū)域 DNA片段插入到ASR型質粒中，能明顯改善質粒復制拷貝在子代細胞中的均勻分配，同時提高質粒在宿主細胞增殖過程的穩(wěn)定性4、yrp質粒：是酵母自主復制型載體，含有酵母基因組的 DNA復制起始區(qū)的 ARS序列，能在酵母染色體外自主復制。五、微生物基因工程的應用（一）、重組微生物工程菌與人類藥物生產： 1、重組人胰島素生產 2、重組人生長激素生產 3、重組人干擾素生產4、重組人抗體及其片段的生產（二）、重組微生物工程菌與疫苗生產1、基因工程疫苗是 指用重組DNA技術克隆并表達保護性抗原基因，利用表達的產物或重組體本身制成疫苗。2、核酸疫苗：指使用能夠表達抗原的基因本身（即核酸）制成的疫苗。 3、蛋白工程疫苗（三）、重組微生物工程菌與食品、飼料工業(yè)：重組工程菌與干酪、單細胞蛋白質、釀酒工業(yè)、氨基酸、維生素生產(四)、重組微生物工程菌與環(huán)境保護(五)、重組微生物工程菌與農業(yè)生產第十一章植物基因工程1、Ti質粒：Ti質粒是根癌農桿菌染色體外的遺傳物質，為雙股共價閉合環(huán)狀DNA分子，其分子量為95～156×106D，約有200kb2、不同的Ti質粒有二個同源區(qū)：①Vir區(qū)（轉化所必須）②T－DNA是Ti質粒的轉化植物的DNA，3、Ti質粒的基因位點及其功能區(qū)域（1）T－DNA區(qū)：T-DNA是農桿菌侵染植物細胞時，從Ti質粒上切割下來轉移到植物細胞的一段DNA，故稱之為轉移DNA。該DNA片段上的基因與腫瘤的形成有關。（2）Vir區(qū)：區(qū)段上的基因能激活T-DNA轉移，使農桿菌表現出毒性，故稱之為毒性區(qū)。T-DNA區(qū)與Vir區(qū)在質粒DNA上彼此相鄰，合起來約占Ti質粒DNA的三分之一。（3）Con區(qū)：段上存在著與細菌間接合轉移相關基因（tra），調控Ti質粒在農桿菌之間的轉移。冠癭堿能激活tra基因，誘導Ti質粒轉移，因此稱之為接合轉移編碼區(qū)。（4）Ori區(qū)（originofreplication）：區(qū)段基因調控Ti質粒的自我復制起始。4、T－DNA結構：胭脂堿型的T-DNA是15kb長的DNA連續(xù)片段，占Ti的7-15％，兩邊有23bp的定向重復序列。章魚堿型的T-DNA區(qū)分為兩部分，左區(qū)（TL-DNA）為13kb的單拷貝序列，是誘發(fā)和維持腫瘤所必需的。右區(qū)（TR-DNA）為7