重組質(zhì)粒鑒定方法解析

重組DNA轉(zhuǎn)變受體細(xì)胞后，須在不一樣樣樣水平進(jìn)步行優(yōu)選，以差別轉(zhuǎn)變子與非轉(zhuǎn)變子、重組子與非重組子以及判斷所需的特異性重組子。在轉(zhuǎn)變過(guò)程中，其實(shí)不是每個(gè)受體細(xì)胞都被轉(zhuǎn)變；即便獲取轉(zhuǎn)變細(xì)胞，也其實(shí)不是都含有目的基因，所以需采納有效方法進(jìn)行優(yōu)選。優(yōu)選的方法包含依據(jù)遺傳表型優(yōu)選、限制性?xún)?nèi)切酶分析優(yōu)選、核酸探針優(yōu)選、PCR優(yōu)選等。本實(shí)驗(yàn)采納遺傳表型優(yōu)選中的抗生素平板優(yōu)選或α互補(bǔ)優(yōu)選的方法。一、抗生素平板優(yōu)選【實(shí)驗(yàn)原理】目標(biāo)基因是

Kan的抗性基因，而載體含

Amp

的抗性基因，所以在含有

Amp

和Kan的培育基中生

長(zhǎng)

的

菌

落

即

為

陽(yáng)

性

菌

落

?！静僮鞑襟E】1．制備含有Amp和Kan的LB瓊脂培育板2．將

100μl

轉(zhuǎn)變菌液用無(wú)菌涂布器平均涂布于含有

Amp

和

Kan

培育板上，

37℃培育

12-16h

。3．在含有體

Amp和培

Kan培育板上能生長(zhǎng)的菌落即為陽(yáng)性重組質(zhì)粒。并將其接種于含養(yǎng)基2ml中培育

Kan的8-16h

LB液。4．小量制備質(zhì)粒，限制性酶切分析進(jìn)一步判斷。二、α互補(bǔ)優(yōu)選【實(shí)驗(yàn)原理】合用于含有半乳糖苷酶基因（LacZ）的載體，如pUC系列等，其原理是：載體含有LacZ的調(diào)控序列和N端146個(gè)氨基酸的編碼信息。在這個(gè)編碼區(qū)中插入了一個(gè)多克隆位點(diǎn)。當(dāng)這類(lèi)載體進(jìn)入可編碼

β-半乳糖苷酶

C端部分序列的宿主細(xì)胞后（質(zhì)粒和宿主細(xì)胞編碼的片段各自都沒(méi)有酶活性），它們可以融為一體，形成擁有酶學(xué)活性的蛋白質(zhì)，這類(lèi)現(xiàn)象叫

α互補(bǔ)。由

α互補(bǔ)而產(chǎn)生的

Lac+

細(xì)菌在呈色底物

5-溴-4-

氯-3-

吲哚-β-半乳糖苷（

X-gal

）和引誘劑異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）存在下形成藍(lán)色菌落。當(dāng)外源DNA插入到質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)后，以致產(chǎn)生無(wú)α互補(bǔ)能力的氨基端片段。所以，帶有重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落。經(jīng)過(guò)呈色反應(yīng)即可初步鑒別可能帶有重組質(zhì)粒的菌落。經(jīng)過(guò)小量制備質(zhì)粒DNA進(jìn)行限制酶切分析，即可確立這些質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)。【試劑】1．X-gal（20mg／ml）：將20mgX-gal溶于lml二甲基甲酰胺中，-20℃避光保留。2．IPTG（200mg／ml）：將1gIPTG溶于4ml去離子雙蒸水中，定容至5ml，用0.22μm過(guò)濾器除菌，-20℃保存?zhèn)溆??！静僮鞑襟E】1．制備含相應(yīng)抗生素的瓊脂平板。2．于平板表面加X(jué)-gal40μl和IPTG4μl，并用無(wú)菌玻璃涂布器將試劑平均涂布于整個(gè)平板表面。37℃靜置lh。3．將100μl轉(zhuǎn)變的菌液涂布于平板表面，置37℃培育箱20min后，倒置平板連續(xù)培育12～16h。4．中斷培育后，將平板靜置4℃4h，使藍(lán)色充分顯現(xiàn)，平皿上顯示藍(lán)色和白色兩種菌落。5．挑取白色菌落置2mlLB（含相應(yīng)抗生素）液體培育基中，37℃搖床培育8～12h。6．提取質(zhì)粒，以限制性酶切分析進(jìn)一步判斷。3．重組質(zhì)粒的判斷方案一菌落PCR(1制備PCR混雜液：(2用經(jīng)滅菌的10μl槍頭（不用牙簽）挑去白色菌落，迅速地使挑取物溶在上述混雜液中。(3蓋上離心管得蓋子，在開(kāi)水上溫育10min。(4將步驟⑶的樣品冷卻至室溫，離心數(shù)秒，此后于管中加入TaKaRarTaq酶0.25ul。(5按以下條件進(jìn)行PCR反應(yīng)：94℃預(yù)變性3min；此后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)反應(yīng)，其溫度循環(huán)條件為：94℃變性1min，57℃退火1min，72℃延長(zhǎng)1min；循環(huán)結(jié)束后72℃再延長(zhǎng)5min。(6取5μlPCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠進(jìn)步行電泳檢測(cè)。方案二質(zhì)粒PCR1.堿裂解法少許制備質(zhì)粒DNA(1用離心管采集4ml在LB培育基（含Amp）中培育過(guò)夜的菌液，14000rpm離心30秒，棄盡上清。(2用250μl已加入RNaseA1的BufferS1充分懸浮細(xì)菌積淀。(3加入250μlBufferS2，平和但充分地上下翻轉(zhuǎn)混雜4-6次，此步驟不宜超出5min。*BufferS2使用后應(yīng)馬上蓋緊瓶蓋，省得空氣中的CO2中和BufferS2中的NaOH，降低溶菌效率。(4加入400μlBufferS3，平和地上下翻轉(zhuǎn)8-10次，室溫靜置2min，14000rpm離心10min。*若離心后凝結(jié)塊未積淀到離心管底部，應(yīng)再上下翻轉(zhuǎn)數(shù)次，12000g離心3min。(5將DNA-prepTube置于2-mlMicrofugeTube中，將步⑷中的混雜液移入DNA-prepTube中，5500rpm離心1min。(6棄濾液，將DNA-prepTube置回到原2-mlMicrofugeTube中，加入500μlBufferW1，5500rpm離心1min。(7棄濾液，將W2，5500rpm

DNA-prepTube置回到原2-mlMicrofugeTube中，加入700μl已加無(wú)水乙醇的離心1min，以相同的方法再用700μl已加無(wú)水乙醇的Buffer

BufferW2沖刷一次。一般有三種判斷方法

:1陽(yáng)性克隆培育