免疫組化技術(shù)常見問題及處理方法優(yōu)秀課件

免疫組化技術(shù)常見問題及處理方法第一頁，共六十頁，2022年，8月28日免疫組織化學(xué)的定義用標(biāo)記的特異性抗體對(duì)組織切片或細(xì)胞標(biāo)本中某些化學(xué)成分的分布和含量進(jìn)行組織和細(xì)胞原位定性、定位或定量研究，這種技術(shù)稱為免疫組織化學(xué)技術(shù)或免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)第二頁，共六十頁，2022年，8月28日免疫組織化學(xué)的原理根據(jù)抗原抗體反應(yīng)和化學(xué)顯色原理組織切片或細(xì)胞標(biāo)本中的抗原和一抗結(jié)合利用一抗與標(biāo)記生物素（HRP、AKP）、熒光素等的二抗進(jìn)行反應(yīng)通過呈色反應(yīng)或熒光顯示細(xì)胞或組織中化學(xué)成分，在光學(xué)顯微鏡或熒光顯微鏡觀察確定某些化學(xué)成分的分布和含量第三頁，共六十頁，2022年，8月28日第四頁，共六十頁，2022年，8月28日免疫組織化學(xué)的分類按標(biāo)記物質(zhì)的種類，可分為酶標(biāo)記、膠體金標(biāo)記、熒光標(biāo)記和放射性標(biāo)記等按染色步驟可分為直接法（又稱一步法）和間接法（二步、三步或多步法）。與直接法相比，間接法的靈敏度提高了許多第五頁，共六十頁，2022年，8月28日按結(jié)合方式可分為抗原-抗體結(jié)合，如過氧化物酶-抗過氧化物酶（PAP）法；親和連接，如卵白素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物（ABC）法、鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)（SP）法等SP法是比較常用的方法；聚合物鏈接，如即用型二步法，此方法尤其適合于內(nèi)源性生物素含量高的組織抗原檢測(cè)第六頁，共六十頁，2022年，8月28日可被檢測(cè)的物質(zhì)組織或細(xì)胞中凡是能作為抗原或半抗原，如蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受體、酶、激素、核酸及病原體等都可用相應(yīng)的特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)第七頁，共六十頁，2022年，8月28日免疫組織化學(xué)的特點(diǎn)1）特異性強(qiáng)2）敏感性高3）定位準(zhǔn)確、形態(tài)與功能相結(jié)合第八頁，共六十頁，2022年，8月28日Westernblotting、ELISA

與免疫組化的異同Westernblotting：蛋白質(zhì)免疫印跡，檢查組織或細(xì)胞樣品內(nèi)蛋白含量的檢測(cè)方法，與免疫組化技術(shù)相比，定量可能更加準(zhǔn)確；也可定性和定位，但敏感性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于免疫組化技術(shù)ELISA：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，檢查體液或組織勻漿中蛋白含量的檢測(cè)，與免疫組化技術(shù)相比，定量最準(zhǔn)確，是分泌性蛋白檢測(cè)首選方法之一第九頁，共六十頁，2022年，8月28日免疫組織化學(xué)方法的基本步驟組織和細(xì)胞的處理抗原修復(fù)染色第十頁，共六十頁，2022年，8月28日鼠單克隆抗體或多克隆抗體（兔抗血清）鼠單克隆抗體特異性較高背景較干凈有多種潛在用途但敏感性、親和力低兔多克隆抗體（兔抗血清）高敏感性、親和力可能有較多的交叉反應(yīng)更多的潛在用途第十一頁，共六十頁，2022年，8月28日SP法1.石蠟切片脫蠟和水化后，用PBS(pH7.4)沖洗3次，每次3分鐘。2.根據(jù)每一種抗體的要求，對(duì)組織抗原進(jìn)行相應(yīng)的修復(fù)。3.每張切片加1滴或50μl過氧化酶阻斷溶液(試劑A)，室溫下孵育10分鐘，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性。PBS沖洗3次，每次3分鐘。4.除去PBS液，每張切片加1滴或50μl正常非免疫動(dòng)物血清(試劑B)，室溫下孵育10分鐘。5.除去血清，每張切片加1滴或50μl的第一抗體(用戶自選)，室溫下孵育60分鐘或4℃過夜，建議參見每種抗體的說明書。4度過夜和從冰箱拿出后37度復(fù)溫45min，PBS沖洗3次，每次3分鐘。第十二頁，共六十頁，2022年，8月28日6.除去PBS液，每張切片加1滴或50μl生物素標(biāo)記的第二抗體(試劑C)，室溫下孵育10分鐘。PBS沖洗3次，每次3分鐘。7.除去PBS液，每張切片加1滴或50μl鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液(試劑D)，室溫下孵育10分鐘。PBS沖洗3次，每次3分鐘。8.除去PBS液，每張切片加2滴或100μl新鮮配制的DAB或AEC溶液，顯微鏡下觀察3-10分鐘。9.自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，PBS或自來水沖洗返藍(lán)。10.如果用DAB顯色，則切片經(jīng)過梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固；如果用AEC顯色，則切片不能經(jīng)酒精脫水，而直接用水性封片劑封片。第十三頁，共六十頁，2022年，8月28日二步法(Envision系統(tǒng))1）脫蠟、水化組織切片。2）根據(jù)所應(yīng)用的一抗的特殊要求，對(duì)組織切片進(jìn)行預(yù)處理。3）0.3%或3%H2O2去離子水孵育5分鐘-30分鐘，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS或TBS沖洗。4）滴加一抗，室溫或37℃孵育30-60分鐘，或4℃過夜，PBS或TBS浸洗3分鐘×5次。5）滴加enhangcer增強(qiáng)劑（試劑A），37度30min，PBS或TBS浸洗3分鐘×5次。6）滴加通用型IgG抗體-Fab段-HRP多聚體（試劑B），室溫37℃孵育30分鐘-1h，PBS/TBS沖洗3分鐘×5次。7）應(yīng)用DAB溶液顯色。8）蒸餾水沖洗、復(fù)染、脫水、透明、封片。第十四頁，共六十頁，2022年，8月28日Envision系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)敏感性高背景干凈（消除內(nèi)源性生物素的干擾）步驟簡(jiǎn)單第十五頁，共六十頁，2022年，8月28日石蠟切片標(biāo)本的固定1、組織離體后盡快固定，切開固定效果好2、固定液以10％中性福爾馬林緩沖液為佳3、固定時(shí)間在4h-24h之間，長時(shí)間固定會(huì)影響抗原決定簇的暴露，產(chǎn)生陰性結(jié)果4、固定液的量要超過組織體積5倍以上如果組織固定不及時(shí)或不完全固定,HE染色細(xì)胞核發(fā)灰模糊，對(duì)比不鮮明；免疫組化染色結(jié)果不理想，通常組織離體2h后抗原完全丟失第十六頁，共六十頁，2022年，8月28日固定不充分第十七頁，共六十頁，2022年，8月28日第十八頁，共六十頁，2022年，8月28日第十九頁，共六十頁，2022年，8月28日第二十頁，共六十頁，2022年，8月28日第二十一頁，共六十頁，2022年，8月28日第二十二頁，共六十頁，2022年，8月28日第二十三頁，共六十頁，2022年，8月28日第二十四頁，共六十頁，2022年，8月28日標(biāo)本的取材、脫水、浸蠟標(biāo)本的取材厚度以2mm為宜梯度酒精脫水盡量徹底充分二甲苯透明時(shí)間不宜長，1～3h為佳，透明過度會(huì)導(dǎo)致組織發(fā)硬發(fā)脆浸蠟應(yīng)選擇低熔點(diǎn)的石蠟，浸蠟應(yīng)充分如果組織脫水、浸蠟不充分，蠟塊會(huì)出現(xiàn)組織收縮凹陷，而且在免疫組化熱抗原修復(fù)操作時(shí)會(huì)容易脫片第二十五頁，共六十頁，2022年，8月28日標(biāo)本的切片、撈片、烤片切片通常以3～4um的厚度為宜,太厚易掉片，細(xì)胞重疊，對(duì)細(xì)胞膜陽性結(jié)果觀察不理想撈片要求達(dá)到無皺折、無氣泡，水溫宜在（48～50℃）80℃烘烤1～2h玻片用防脫片或多聚賴氨酸處理，以增強(qiáng)粘附性第二十六頁，共六十頁，2022年，8月28日冰凍切片的處理冰凍切片的組織抗原保存好通常以5um的厚度為佳冷風(fēng)吹干后用純丙酮固定2遍,干燥置入4℃冰箱短期保存，－20℃冰箱長期干燥保存缺點(diǎn)是不易做出好的冰凍切片，易出現(xiàn)冰晶、細(xì)胞腫脹等現(xiàn)象第二十七頁，共六十頁，2022年，8月28日細(xì)胞涂片的處理培養(yǎng)細(xì)胞或細(xì)胞涂片，應(yīng)自然晾干后用純丙酮固定2遍，4℃或－20℃冰箱保存第二十八頁，共六十頁，2022年，8月28日抗原修復(fù)概念:應(yīng)用物理或化學(xué)的方法將組織固定過程中封閉的抗原決定簇修復(fù)暴露的過程稱為抗原修復(fù)原因：甲醛固定過程中形成醛鍵和羧甲基而封閉部分抗原決定簇，固定時(shí)，蛋白與蛋白之間發(fā)生交聯(lián),可能會(huì)封閉抗原決定簇第二十九頁，共六十頁，2022年，8月28日抗原修復(fù)的方法酶消化：

如胰蛋白酶、蛋白水解酶熱抗原修復(fù)（HIER）：水?。晃⒉t；高壓鍋；高壓消毒鍋；蒸汽室超聲波以上綜合運(yùn)用修復(fù)方法從強(qiáng)到弱為：高壓修復(fù)、微波修復(fù)、胰酶修復(fù)第三十頁，共六十頁，2022年，8月28日熱抗原修復(fù)更有效：染色結(jié)果更一致，操作更單一事先確定的熱修復(fù)時(shí)間可適用于幾乎所有的組織

一抗可以進(jìn)一步稀釋（節(jié)省費(fèi)用）有些抗體只有采用熱抗原修復(fù)才有效第三十一頁，共六十頁，2022年，8月28日高壓鍋熱抗原修復(fù)比微波更有效能處理大批量的切片達(dá)到更高的溫度

加熱均勻（不像微波爐有熱點(diǎn)和冷點(diǎn)）和節(jié)省時(shí)間第三十二頁，共六十頁，2022年，8月28日高壓鍋熱抗原修復(fù)將高壓鍋中的緩沖液煮開（不加蓋）將切片放入沸騰的緩沖液蓋緊蓋子和高壓閥，加熱至全壓力達(dá)到全壓力后才能計(jì)時(shí)，最佳時(shí)間由各個(gè)實(shí)驗(yàn)室自行確定----通常在2-4分鐘

第三十三頁，共六十頁，2022年，8月28日熱抗原修復(fù)：注意事項(xiàng)無論哪一步都不要讓切片干涸（抗原可完全丟失）加熱后需要冷卻15～30分鐘（個(gè)別未折疊的蛋白鏈恢復(fù)到原來的構(gòu)型）第三十四頁，共六十頁，2022年，8月28日熱抗原修復(fù)存在的問題過度的熱修復(fù)會(huì)導(dǎo)致組織形態(tài)的破壞或組織完全消化，免疫染色變?nèi)趸蚨ㄎ徊粶?zhǔn)確有一個(gè)時(shí)間點(diǎn)，超過這個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)一步熱修復(fù)也不會(huì)獲得更強(qiáng)的染色效果解決方法：采用較短時(shí)間熱修復(fù)或酶消化重復(fù)實(shí)驗(yàn)第三十五頁，共六十頁，2022年，8月28日修復(fù)過度的實(shí)驗(yàn)組第三十六頁，共六十頁，2022年，8月28日修復(fù)過度的實(shí)驗(yàn)組第三十七頁，共六十頁，2022年，8月28日修復(fù)過度的對(duì)照組第三十八頁，共六十頁，2022年，8月28日修復(fù)過度的對(duì)照組第三十九頁，共六十頁，2022年，8月28日酶消化修復(fù)第四十頁，共六十頁，2022年，8月28日縮短修復(fù)時(shí)間第四十一頁，共六十頁，2022年，8月28日

熱修復(fù)抗原會(huì)導(dǎo)致內(nèi)源性生物素反應(yīng)增強(qiáng)，應(yīng)用卵白素抗生物素系統(tǒng)會(huì)產(chǎn)生假陽性

富含內(nèi)源性生物素的組織：

—肝細(xì)胞

—線抗體豐富的組織如腎臟、甲狀腺、嗜酸細(xì)胞等

—胞漿豐富的腫瘤細(xì)胞熱抗原修復(fù)的問題：內(nèi)源性生物素第四十二頁，共六十頁，2022年，8月28日組織在熱修復(fù)之后，用3％的新鮮H2O2進(jìn)行封閉，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，室溫下孵育10min，再用10％雞（鴨）蛋清阻斷10～15分鐘，清洗后滴加一抗應(yīng)用非生物素系統(tǒng)的檢測(cè)試劑盒，如EnVision系統(tǒng)阻斷內(nèi)源性生物素的方法第四十三頁，共六十頁，2022年，8月28日熱抗原修復(fù)的緩沖液pH6.0檸檬酸緩沖液（最常用）、尿素、Tris-HCl、商品化修復(fù)液等堿性

pH修復(fù)液常對(duì)絕大多數(shù)抗體的效果更好推薦使用：EDTA緩沖液

pH8.0或Tris-EDTA緩沖液pH9.0是較好的常規(guī)修復(fù)液，可用于大多數(shù)熱修復(fù)有效的抗體第四十四頁，共六十頁，2022年，8月28日抗體孵育條件主要抗體濃度、溫度、時(shí)間，三者一般是相互成反比的（相對(duì)）濃度是最重要的先決條件，溫度決定反應(yīng)的速度，時(shí)間決定反應(yīng)的量溫度有4度、室溫、37度，其中4度最佳，反應(yīng)最溫和，背景較淺；而37度反應(yīng)速度較快，時(shí)間較短；室溫不太提倡4度過夜和從冰箱拿出后需37度復(fù)溫45min第四十五頁，共六十頁，2022年，8月28日復(fù)溫的必要性防止切片從4度直接放入PBS易脫片使抗原抗體結(jié)合更穩(wěn)定4度和37度時(shí)分子運(yùn)動(dòng)方式不同,前者分子碰撞機(jī)率和運(yùn)動(dòng)速度小于后者,后者結(jié)合更快,但敏感性也提高了并易造成非特異染色第四十六頁，共六十頁，2022年，8月28日脫片產(chǎn)生的原因和如何防止脫片多聚賴氨酸玻片的質(zhì)量問題切片問題：切片較厚或者不均勻組織本身的問題：癌癥組織中壞死組織越多越容易脫片烤片的時(shí)間短、溫度不夠操作的時(shí)候甩的過猛，有脫片嫌疑的片子最好不甩或輕輕甩，用吸水紙從邊緣上慢慢吸水修復(fù)的問題：抗原修復(fù)的時(shí)候高壓時(shí)間過長，玻片架放進(jìn)沸騰的修復(fù)液時(shí)需輕柔第四十七頁，共六十頁，2022年，8月28日背景染色較深的原因（1）抗體濃度過高：一抗?jié)舛冗^高是常見的原因之一。解決辦法是，每次使用新抗體前應(yīng)當(dāng)對(duì)其工作濃度進(jìn)行測(cè)試，使每一抗體個(gè)體化，找到適合自己實(shí)驗(yàn)室的理想工作濃度（2）抗體孵育時(shí)間過長或溫度較高：解決辦法是，嚴(yán)格執(zhí)行操作規(guī)程，避免因遺忘而造成時(shí)間延長。時(shí)間和溫度要根據(jù)染色結(jié)果進(jìn)行調(diào)整第四十八頁，共六十頁，2022年，8月28日（3）DAB變質(zhì)和顯色時(shí)間太長：DAB最好現(xiàn)用現(xiàn)配，如有沉渣應(yīng)進(jìn)行過濾后再用。配制好的DAB不應(yīng)存放時(shí)間太長，DAB的顯色最好在顯微鏡下監(jiān)控，達(dá)到理想的染色程度時(shí)立即終止反應(yīng)（4）組織變干（5）切片在緩沖液或修復(fù)液中浸泡時(shí)間太長（大于24小時(shí)）（6）一抗變質(zhì)、質(zhì)量差的多克隆抗體第四十九頁，共六十頁，2022年，8月28日DAB染色后切片著色呈陰性結(jié)果抗體濃度和質(zhì)量問題以及抗體來源選擇錯(cuò)誤抗原修復(fù)不全或者不充分組織切片本身這種抗原含量低血清封閉時(shí)間過長DAB孵育時(shí)間過短細(xì)胞通透不全，抗體未能充分進(jìn)入胞內(nèi)參與反應(yīng)第五十頁，共六十頁，2022年，8月28日DAB顯色時(shí)間的把握（1）DAB顯色時(shí)間不是固定的，主要由顯微鏡下控制顯色時(shí)間，到出現(xiàn)淺棕色本底時(shí)即可沖洗（2）顯色時(shí)間很短（如幾秒或幾十秒）就出現(xiàn)很深的棕褐色，說明抗體濃度過高或抗體孵育時(shí)間過長，需要下調(diào)抗體濃度或縮短抗體孵育時(shí)間；或前面的封閉非特異性蛋白不全，需要延長封閉時(shí)間（3）顯色時(shí)間很長（如超過十幾分鐘）才出現(xiàn)陽性染色，說明抗體濃度過低或孵育時(shí)間過短（最好一抗4度過夜）；或封閉時(shí)間過長第五十一頁，共六十頁，2