免疫學(xué)實驗血清學(xué)反應(yīng)

免疫學(xué)實驗血清學(xué)反應(yīng)第一頁，共六十三頁，2022年，8月28日

指抗原Ag與相應(yīng)抗體Ab之間所發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)?？砂l(fā)生于體內(nèi)，也可發(fā)生于體外。

解離Ag+AbAg·Ab一定條件（動態(tài)平衡）一、抗原抗體反應(yīng)的定義及用途2第二頁，共六十三頁，2022年，8月28日體內(nèi)反應(yīng)可介導(dǎo)殺菌、溶菌、調(diào)理、中和毒素等作用

免疫病理損傷—超敏反應(yīng)、免疫性疾病等

3第三頁，共六十三頁，2022年，8月28日3D模型IgG1IgＧ：存在于血清（占血清免疫球蛋白總量的80%）和組織液中。IgAIgM4第四頁，共六十三頁，2022年，8月28日二、血清學(xué)反應(yīng)的特點：

1、特異性：抗原抗體在體外的結(jié)合與在體內(nèi)一樣，也具有專一性，即特異性。分子基礎(chǔ)：Ag-ADHVR-Ab空間結(jié)構(gòu)高度互補VH和VL各具三個HVR與AD互補應(yīng)用：由于抗原抗體反應(yīng)具有高度特異性，故可用已知的抗原（抗體）來檢測相應(yīng)未知的抗體（或抗原）。5第五頁，共六十三頁，2022年，8月28日2、可逆性：抗原與抗體的結(jié)合是非共價鍵結(jié)合，在一定條件下又可解離為游離狀態(tài)，反應(yīng)具有可逆性。靜電引力（electrostaticforces）范德華引力:作用最小（vanderWaalsinteractions）氫鍵:最具特異性（hydrogenbond）疏水作用力:作用最大（hydrophobicinteractions）

6第六頁，共六十三頁，2022年，8月28日3、可見性：反應(yīng)體系中抗原抗體的比例適當(dāng)，就能形成較大的抗原抗體復(fù)合物，在有一定量電解質(zhì)或適宜pH等條件下，出現(xiàn)肉眼可見的凝集、沉淀等可見反應(yīng)。7第七頁，共六十三頁，2022年，8月28日親水膠體疏水膠體轉(zhuǎn)化NaCl可見反應(yīng)血清學(xué)反應(yīng)條件下，抗原抗體均帶負電荷，使極化的水分子在其周圍形成水化層，成為親水膠體。

當(dāng)抗原與抗體結(jié)合使表面電荷減少，水化層變薄，失去親水性能，抗原抗體復(fù)合物成為疏水膠體在電解質(zhì)作用下，中和膠體粒子表面的電荷，使各疏水膠體之間靠攏，形成可見的抗原抗體復(fù)合物親水膠體轉(zhuǎn)化為疏水膠體8第八頁，共六十三頁，2022年，8月28日4、階段性：抗原抗體反應(yīng)分兩個階段：抗原抗體發(fā)生特異性結(jié)合的階段，反應(yīng)快，幾秒或幾分鐘，不可見可見階段，短至數(shù)分、數(shù)小時，長至數(shù)日，出現(xiàn)凝集、沉淀和細胞溶解等現(xiàn)象9第九頁，共六十三頁，2022年，8月28日概念：兩種不同的抗原分子具有部分相同或類似結(jié)構(gòu)的抗原表位，可與彼此相應(yīng)的抗血清發(fā)生反應(yīng)。交叉反應(yīng)（crossreactions）抗原抗體交叉反應(yīng)示意圖B親緣關(guān)系越近，交叉反應(yīng)的程度也越高10第十頁，共六十三頁，2022年，8月28日三、血清學(xué)反應(yīng)的影響因素1、反應(yīng)物自身因素*抗原：理化特性、Ag決定簇數(shù)量和種類。

*抗體：1、來源2、特異性與親和力3、濃度比例要合適11第十一頁，共六十三頁，2022年，8月28日（1）電解質(zhì)作用：中和膠體表面電荷，破壞水化層，使Ag·Ab聚集。常用：0.85%NaCl溶液、緩沖液、Ca2+、Mg2+等。

注意：鹽析（salting）即電解質(zhì)濃度過高引起的非特異性蛋白質(zhì)沉淀。2、環(huán)境因素：12第十二頁，共六十三頁，2022年，8月28日（2）酸堿度Ag、Ab多為蛋白質(zhì)，具兩性電離特性，有其故有的PI,pH過高或過低均可影響Ag、Ab反應(yīng)。一般：pH6～8為宜，補體參與時pH7.2～7.4。注意：自凝現(xiàn)象------即pH達到或接近顆粒性抗原的PI時，引起的抗原非特異性自身凝集現(xiàn)象。第十三頁，共六十三頁，2022年，8月28日（3）溫度—影響反應(yīng)速度一般：15～40℃為宜，最適溫度：37℃過高（>56）:Ag-Ab解離，Ag、Ab變性，補體失活。冷凝集實驗：4℃凝集，>20解離。（4）其他適當(dāng)?shù)恼袷?、攪拌等可加速反?yīng)第十四頁，共六十三頁，2022年，8月28日抗體的兩個Fab段分別結(jié)合兩個Ag分子，相互交叉結(jié)合連接成巨大的網(wǎng)格狀立體聚合物，（可見）。Ab/Ag過剩過剩方的結(jié)合價得不到飽和，大多數(shù)游離存在，只形成小分子復(fù)合物（不可見）。只有抗原與抗體呈適當(dāng)比例時，才可出現(xiàn)可見的結(jié)合反應(yīng)。第十五頁，共六十三頁，2022年，8月28日四、傳統(tǒng)的血清學(xué)反應(yīng)1、凝集反應(yīng)2、沉淀反應(yīng)3、補體參與的溶血反應(yīng)4、中和試驗16第十六頁，共六十三頁，2022年，8月28日（一）凝集反應(yīng)1、定義：顆粒性抗原（如細菌、紅血球等）+抗體→凝集現(xiàn)象。顆粒性抗原與相應(yīng)的抗體在體外結(jié)合，在電解質(zhì)存在的條件下，形成肉眼可見凝集塊，為凝集反應(yīng)，反應(yīng)中的抗原稱為凝集原，抗體稱為凝集素。17第十七頁，共六十三頁，2022年，8月28日2、分類（1）直接凝集反應(yīng)①概念：天然的凝集原與相應(yīng)抗體直接結(jié)合呈現(xiàn)的細菌凝集或紅細胞凝集現(xiàn)象稱為直接凝集反應(yīng)。②應(yīng)用：定性檢測—ABO血型鑒定、細菌鑒定定量檢測—診斷傷寒病的肥達試驗等18第十八頁，共六十三頁，2022年，8月28日血型鑒定19第十九頁，共六十三頁，2022年，8月28日（2）間接凝集反應(yīng)（3）間接凝集抑制試驗20第二十頁，共六十三頁，2022年，8月28日（二）沉淀反應(yīng)

1、概念：可溶性抗原+抗體→沉淀現(xiàn)象。

可溶性抗原（如細菌的外毒素、內(nèi)毒素、菌體裂解液、病毒的可溶性抗原、血清、組織浸出液等）與相應(yīng)的抗體結(jié)合，在適量電解質(zhì)存在下，形成肉眼可見的細微的白色沉淀。21第二十一頁，共六十三頁，2022年，8月28日2、分類

（1）液相中的沉淀反應(yīng)：

環(huán)狀沉淀、絮狀沉淀（2）凝膠擴散：①單向擴散：22第二十二頁，共六十三頁，2022年，8月28日1%瓊脂凝膠的孔徑約85納米，可允許各種Ag或Ab自由擴散，由近及遠形成濃度梯度。通過標(biāo)準品繪制標(biāo)準曲線

不同病人抗原濃度測定1.測定沉淀環(huán)直徑2.在標(biāo)準曲線上查找相應(yīng)抗原濃度23第二十三頁，共六十三頁，2022年，8月28日②火箭免疫電泳火箭免疫電泳是單向單擴散和電泳技術(shù)相結(jié)合的一種血清學(xué)試驗，是讓抗原在電場的作用下，在含有抗體的瓊脂中定向泳動，二者比例合適時形成類似火箭樣的沉淀峰。沉淀峰的高度與抗原的濃度成正比。電泳完畢后，觀察瓊脂板上沉淀峰，并測量從孔中心到峰尖的高度。以峰高為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)(對數(shù)坐標(biāo))，繪制標(biāo)準曲線，求出待檢樣品內(nèi)抗原濃度24第二十四頁，共六十三頁，2022年，8月28日

可溶性抗原與相應(yīng)抗體在含適量電解質(zhì)的瓊脂糖凝膠板的對應(yīng)孔中各自向四周自由擴散,若兩者分子比例適當(dāng),則在擴散的一定時間后在兩孔之間相遇并生成白色沉淀線.③雙向擴散：25第二十五頁，共六十三頁，2022年，8月28日(1)沉淀線吻合：待檢抗原與標(biāo)準抗原完全相同。(2)沉淀線相切：待檢抗原中含有與標(biāo)準抗原相同的抗原，還含有另外的抗原與抗血清相對應(yīng)。(3)沉淀線相交：待檢抗原有與抗血清對應(yīng)的抗原，但和標(biāo)準抗原不同。(4)沉淀線部分吻合：待測抗原和標(biāo)準抗原性質(zhì)相同，但含量較低。A1：待檢抗原；A2：標(biāo)準抗原26第二十六頁，共六十三頁，2022年，8月28日④免疫電泳

⑤對流免疫電泳在pH8.6的瓊脂凝膠中，抗體球蛋白泳向負極；而一般抗原蛋白質(zhì)泳向正極抗原和抗體將在兩孔之間相遇，27第二十七頁，共六十三頁，2022年，8月28日（三）中和反應(yīng)：特異性抗體抑制多種抗原的生物學(xué)活性（細菌外毒素的毒性、酶的活性、病毒的感染性等）的反應(yīng)。主要用于毒素的鑒定、病毒感染性疾病的診斷以及病毒的鑒定。例如在臨床實驗診斷中測定風(fēng)濕病患者體內(nèi)的抗鏈球菌O抗體的反應(yīng)。28第二十八頁，共六十三頁，2022年，8月28日（四）補體溶血：紅細胞與相應(yīng)抗體結(jié)合，可激活補體使紅細胞溶解，稱為補體溶血反應(yīng)或免疫溶血反應(yīng)。原理：補體激活的經(jīng)典途徑（補體的動畫）補體特點：補體可與任何抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，但不能單獨與抗原或抗體結(jié)合。在有特異抗體存在時可以溶解細胞（溶菌或溶血）。29第二十九頁，共六十三頁，2022年，8月28日溶血反應(yīng)RBC+

RBC抗體(溶血素)新鮮血清（補體）溶血30第三十頁，共六十三頁，2022年，8月28日由抗原抗體復(fù)合物結(jié)合C1q啟動的途徑1.激活劑Ag-Ab復(fù)合物(IgG1,IgG2,IgG3,IgM)2.參與成分C1～C93.激活過程（三個階段）識別階段活化階段膜攻擊階段第三十一頁，共六十三頁，2022年，8月28日第三十二頁，共六十三頁，2022年，8月28日第三十三頁，共六十三頁，2022年，8月28日五、現(xiàn)代免疫標(biāo)記技術(shù)

免疫標(biāo)記技術(shù)(Immuno-labellingtechnique)是指將抗原或抗體用熒光素、酶、放射性同位素和電子致密物質(zhì)等加以標(biāo)記，借以提高其靈敏度的一類新技術(shù)。優(yōu)點：特異性強、靈敏度高、應(yīng)用范圍廣、反應(yīng)速度快、容易觀察、能定位、定量甚至定位。34第三十四頁，共六十三頁，2022年，8月28日1、酶免疫測定（Enzymeimmunoassay,EIA)用酶標(biāo)記的抗體或抗抗體來進行的抗原抗體反應(yīng)。用酶作標(biāo)記物由于酶的催化作用可使原來無色的底物通過水解、氧化或還原反應(yīng)而顯示顏色。第三十五頁，共六十三頁，2022年，8月28日原理（以間接性ELISA為例）：顯色36第三十六頁，共六十三頁，2022年，8月28日2、放射免疫測定法（RIA）：37第三十七頁，共六十三頁，2022年，8月28日3、免疫熒光技術(shù)38第三十八頁，共六十三頁，2022年，8月28日直接凝集試驗雙向擴散試驗補體溶血試驗觀看細胞免疫的示教片實驗內(nèi)容39第三十九頁，共六十三頁，2022年，8月28日

一、直接凝集試驗——試管法（1份/人）試管法凝集試驗是一種半定量的試驗方法，是在試管內(nèi)將抗原或抗體稀釋不同倍數(shù)后加入等量的待檢抗體或抗原，根據(jù)每管內(nèi)的凝集程度，判定待檢樣品中相應(yīng)抗原或抗體的有無及其效價。試驗中可能由于電解質(zhì)濃度或pH值不適宜等原因，而引起抗原非特異性凝集，出現(xiàn)假陽性反應(yīng)，所以應(yīng)設(shè)立陰性對照管。教材P29940第四十頁，共六十三頁，2022年，8月28日材料：1%新鮮綿羊紅細胞懸液、羊紅細胞凝集素（兔抗綿羊紅細胞免疫血清）等方法：（理解對倍稀釋法）1.取小試管7支，置于試管架上，編號。2.用1ml刻度吸管吸生理鹽水，第一管加0.9ml，其余管各加0.5ml。3.用1ml刻度吸管吸取兔抗羊紅細胞血清0.1ml加入第一管中，反復(fù)吹吸三次，使之與鹽水混勻，吸出0.5ml注入第二管。同樣混勻后吸取0.5ml注入第三管，依此類推。自第6管吸出0.5ml棄掉。第八管不加血清作為對照。此時自第一管至第七管血清的稀釋倍數(shù)分別是1:10，1:20，1:40……1:320，具體稀釋方法可參閱下圖。41第四十一頁，共六十三頁，2022年，8月28日血清稀釋度1：10

1：20

1：40

1：801：160

1：320棄之生理鹽水０.５血清０.１ml０.９０.５０.５０.５０.５０.５０.５4.各管加入綿羊紅細胞懸液0.5ml，于是各管血清稀釋倍數(shù)又增加了一倍。5.將各管震蕩均勻，放入37℃溫箱中過夜，次日觀察結(jié)果。０.５０.５０.５０.５０.５42第四十二頁，共六十三頁，2022年，8月28日二、雙向擴散試驗——檢測血清中的AFP（1份/2人）【操作方法】1.雙向瓊脂擴散試驗抗原抗體孔位置如下圖所示2.用微量加樣器孔中分別加抗甲胎蛋白診斷血清，周圍孔中分別加入待測血清和陽性對照血清，每孔加入25-30μl。3.將瓊脂板放入密閉的盒內(nèi)（內(nèi)放浸有5%石炭酸的紗布以保持濕度），置37℃溫箱中，于24小時后觀察結(jié)果。

注意：加樣量力求準確，勿使樣品外溢或在孔緣上殘存小汽泡，以免影響擴散結(jié)果。原則：滿而不溢43待測1AFP-AgAFP-Ab待測2定位標(biāo)記孔43第四十三頁，共六十三頁，2022年，8月28日免疫學(xué)實驗二

———————續(xù)血清學(xué)反應(yīng)微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室44第四十四頁，共六十三頁，2022年，8月28日一、分析上次結(jié)果

（一）血球凝集（直接凝集試管法）：觀察結(jié)果并分析1、從溫箱中輕輕取出試管架，不要搖動試管。先觀察對照管（第7管），此管血球不出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，紅細胞在管底自然沉降呈現(xiàn)點狀結(jié)構(gòu)，上層液基本清澈透亮，管底可見紅細胞沉積物，呈圓形，邊緣整齊，輕輕振搖試管后，可見紅細胞浮起又分散仍呈懸液。45第四十五頁，共六十三頁，2022年，8月28日2、試驗管從第一管看起，管底有凝集塊，邊緣不整或卷起等現(xiàn)象，均為陽性反應(yīng)，分別用（++++）、（+++）、（++）、（+）表示凝集程度。（++++）表示血球100%凝集，紅細胞形成片層凝集，均勻布滿管底或邊緣皺縮如花環(huán)狀；（+++）表示血球75%凝集，紅細胞形成片層凝集，面積略多于（++）；（++）表示血球50%凝集，紅細胞形成片層凝集，面積較小，邊緣較松散；（+）表示血球25%凝集，紅細胞沉于管底，周圍有散在的少量凝集。46第四十六頁，共六十三頁，2022年，8月28日3.按下列標(biāo)準判定，記錄結(jié)果。++++：凝集特別顯著，紅細胞均勻地鋪于管底，呈一薄層邊緣有折迭狀。+++：凝集顯著，紅細胞均勻地鋪于管底呈一薄層，但周邊紅細胞凝集較疏松。++：凝集清楚可見，紅細胞平鋪于管底呈一薄層，中央可明顯見到一疏松的紅點。+：紅細胞大部分沉集于管底成圓點狀，周圍有少量凝集的紅細胞。—：紅細胞全部沉集于管底呈圓點狀，四周液體清晰。4.判斷效價：能見到明顯凝集現(xiàn)象（++）的血清最高稀釋度為該血清對1%綿羊紅細胞的凝集效價（或滴度）。一般以出現(xiàn)++凝集反應(yīng)的最高血清稀釋倍數(shù)作為血清中所含凝集抗體的效價。47第四十七頁，共六十三頁，2022年，8月28日（二）雙向擴散（沉淀反應(yīng)）：觀察結(jié)果并分析觀察各孔之間有無白色沉淀線，根據(jù)他們的關(guān)系判斷結(jié)果。在兩孔之間出現(xiàn)一清晰致密白色的沉淀線（抗原抗體復(fù)合物）為陽性反應(yīng)。若72小時后仍未出現(xiàn)沉淀線則為陰性反應(yīng)。試驗時陽性對照與待測血清兩者沉淀線發(fā)生吻合時，才能確定待測血清中含有甲胎蛋白。48第四十八頁，共六十三頁，2022年，8月28日三、實驗內(nèi)容（一）補體溶血試驗（1份/4人）試劑：2%綿羊紅細胞、溶血素（兔抗綿羊紅細胞免疫血清）、補體（新鮮豚鼠血清）綿羊紅細胞用前應(yīng)輕晃混勻，不可劇烈震蕩49第四十九頁，共六十三頁，2022年，8月28日成分管號1%SRBC羊溶血素(2單位)補體(2單位)生理鹽水結(jié)果10.50.50.50.520.50.5—1.030.5—0.51.040.50.5(人溶血素)0.50.550.5——1.5實驗步驟混勻，37℃，30min50第五十頁，共六十三頁，2022年，8月28日溶血素，即兔抗綿羊紅細胞抗體，是以SRBC作為抗原免疫家兔所得的兔血清，一般實驗前56℃、30min滅活補體。以溶血素最高稀釋度能產(chǎn)生完全溶血者確定為一個單位，正式試驗中一般使用兩個單位溶血素。51第五十一頁，共六十三頁，2022年，8月28日結(jié)果成分管號1%SRBC羊溶血素(2單位)補體(2單位)生理鹽水結(jié)果10.50.50.50.5溶血20.50.5—1.0不溶30.5—0.51.0不溶40.50.5(人溶血素)0.50.5不溶50.5——1.5不溶52第五十二頁，共六十三頁，2022年，8月28日觀看細胞免疫的示教片53第五十三頁，共六十三頁，2022年，8月28日用Hank’s液配成1×106細胞/ml的淋巴細胞懸液。提取外周血單個核細胞（PBMC）54第五十四頁，共六十三頁，2022年，8月28日T細胞、B細胞表面具有抗原識別受體和有絲分裂原受體★植物血凝素（PHA）、刀豆蛋白A（ConA）選擇性刺激T細胞增殖