免疫沉淀類試驗雙擴免疫比濁

免疫沉淀類試驗雙擴免疫比濁第一頁，共四十一頁，2022年，8月28日沉淀反應(yīng)（precipitation）

是可溶性抗原與相應(yīng)抗體在適當條件下發(fā)生特異性結(jié)合所出現(xiàn)的沉淀現(xiàn)象。第二頁，共四十一頁，2022年，8月28日分類液體內(nèi)沉淀試驗絮狀沉淀試驗環(huán)狀沉淀試驗免疫濁度測定凝膠內(nèi)沉淀試驗免疫擴散免疫電泳單向免疫擴散試驗雙向免疫擴散試驗火箭免疫電泳對流免疫電泳沉淀反應(yīng)第三頁，共四十一頁，2022年，8月28日沉淀反應(yīng)的特點抗原為可溶性物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、多糖沉淀反應(yīng)分兩個階段：第一階段、抗原抗體特異性結(jié)合第二階段、形成可見的免疫復合物第四頁，共四十一頁，2022年，8月28日免疫濁度測定經(jīng)典的沉淀試驗有4個缺點無法克服：操作繁瑣敏感度低（10～100μg/ml）時間長難以自動化第五頁，共四十一頁，2022年，8月28日（一）免疫濁度分析的基本原理：抗原、抗體在特定的電解質(zhì)溶液中反應(yīng)，形成小分子免疫復合物(<19S)，在增濁劑(如PEG、NaF等)的作用下，迅速形成免疫復合物微粒(>19S)，使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度。在抗體稍微過量且固定的情況下，形成的免疫復合物量隨抗原量增加而增加，反應(yīng)液的濁度亦隨之增大，即待測抗原量與反應(yīng)溶液的濁度呈正相關(guān)。用一系列已知濃度的抗原標準品同時進行試驗，制備劑量反應(yīng)曲線，即可計算出標本中抗原的含量第六頁，共四十一頁，2022年，8月28日（二）類型透射免疫比濁法散射免疫比濁法免疫膠乳比濁法

第七頁，共四十一頁，2022年，8月28日第八頁，共四十一頁，2022年，8月28日1透射免疫比濁法原理：

抗原抗體在一定緩沖液中形成免疫復合物(IC)，當光線透過反應(yīng)溶液時，由于溶液內(nèi)復合物粒子對光線的反射和吸收，引起透射光減少，免疫復合物量越多，透射光越少，即光線吸收越多，可用吸光度表示。吸光度和復合物的量成正比，當抗體量固定時，與待檢抗原量成正比。用抗原標準品建立標準曲線，可測出待檢抗原含量。第九頁，共四十一頁，2022年，8月28日方法評價：優(yōu)點：①靈敏度比單擴法高5—10倍；②

CV小于10％；③操作簡便快速，1h可報告結(jié)果；④結(jié)果準確，且能用全自動化或半全自動化儀器進行分析，尤其隨著膠乳粒子增強濁度測定法的出現(xiàn)，使敏感度提高，其應(yīng)用更加廣泛。缺點：抗體用量較大；檢測需抗原抗體反應(yīng)達到平衡，耗時較長；不宜用于藥物等半抗原的測定；靈敏度較散射比濁法低。第十頁，共四十一頁，2022年，8月28日2散射免疫比濁法原理：

散射光系指一定波長的光沿水平軸照射，碰到小顆粒的免疫復合物，光線被折射，發(fā)生偏轉(zhuǎn)，這種偏轉(zhuǎn)的角度可因光線波長和顆粒大小不同而有所區(qū)別。散射濁度法是在入射光的一定角度檢測粒子發(fā)出的散射光，散射光的強度與復合物的含量呈正比，即待測抗原越多，形成復合物越多，散射光強度越強。又可分為速率散射比濁法(ratenephelometry)和終點散射比濁法(endpointnephelometry)。第十一頁，共四十一頁，2022年，8月28日3免疫膠乳比濁法原理選擇一種大小適中，均勻一致的膠乳顆粒，吸附抗體后，當遇到相應(yīng)抗原時，則發(fā)生凝集，單個膠乳顆粒在入射光波長之內(nèi)，光線可透過，當兩個膠乳凝集時，則使透過光減少。這種減少的程度與膠乳凝集成正比，與抗原量成正比。第十二頁，共四十一頁，2022年，8月28日（a）帶抗體的膠乳在波長之內(nèi)可透過光線；（b）結(jié)合后，則形成光線衰減第十三頁，共四十一頁，2022年，8月28日方法評價

敏感度高，試劑穩(wěn)定，因反應(yīng)液中無PEG沉淀劑的影響，個體IC對結(jié)果影響也小，所以結(jié)果穩(wěn)定、可靠，特異性好；不需特殊儀器設(shè)備，一般分光光度計、自動化生化分析儀或散射比濁儀均可使用。

第十四頁，共四十一頁，2022年，8月28日總評價缺點：測定結(jié)果與儀器的性能和試劑的質(zhì)量密切相關(guān)，特別對抗體的質(zhì)量要求高，儀器和試劑價格比較貴。優(yōu)點：①自動化②快速(30～60s)③靈敏(μg/L)④準確⑤精密度高(CV<5％)⑥穩(wěn)定性好⑦節(jié)省試劑⑧檢測范圍廣⑨不需減去樣本和試劑本底值等優(yōu)點。第十五頁，共四十一頁，2022年，8月28日(三)、主要影響因素抗原抗體比例抗體的質(zhì)量抗原抗體反應(yīng)的溶液增濁劑的使用第十六頁，共四十一頁，2022年，8月28日1抗原抗體比例高劑量鉤狀效應(yīng)（highdosehookeffect)海德堡（heidelberger）曲線理論第十七頁，共四十一頁，2022年，8月28日第十八頁，共四十一頁，2022年，8月28日第十九頁，共四十一頁，2022年，8月28日2抗體的質(zhì)量（1）特異性高（2）效價高（3）親和力高（4）抗血清來源第二十頁，共四十一頁，2022年，8月28日3抗原抗體反應(yīng)的溶液pH6.5~8.5電解質(zhì)離子強度、種類（磷酸鹽緩沖液）第二十一頁，共四十一頁，2022年，8月28日4增濁劑的使用PEG、tween-20等非離子型親水劑作用：消除蛋白質(zhì)分子周圍的電子云和水化層，促進抗原、抗體分子靠近，結(jié)合形成大分子復合物。第二十二頁，共四十一頁，2022年，8月28日凝膠內(nèi)沉淀試驗

(gelphaseprecipitation)

主要是指瓊脂糖擴散或稱凝膠擴散(geldiffusion)。常用的凝膠有瓊脂、瓊脂糖、葡聚糖或聚丙稀酰胺凝膠等。第二十三頁，共四十一頁，2022年，8月28日★根據(jù)實驗目的與方法不同，可將固相內(nèi)沉淀驗分為2類：（一）免疫擴散①單向免疫擴散試驗

(singlegeldiffusiontest)②雙向免疫擴散試驗

(doublegeldiffusiontest)（二）凝膠免疫電泳(gelimmuno-electrophoresis)火箭免疫電泳雙擴散免疫電泳第二十四頁，共四十一頁，2022年，8月28日一、單向免疫擴散試驗(一)原理將一定量的抗體混入瓊脂凝膠中，使待測的抗原物質(zhì)在凝膠中自由擴散，與抗體結(jié)合形成沉淀環(huán)，沉淀環(huán)的大小與抗原濃度呈正相關(guān)。第二十五頁，共四十一頁，2022年，8月28日(二)操作步驟

（平板法）1.將抗體和0.9%瓊脂糖50-56℃混合,即刻傾注成平板。2.待凝固后在瓊脂板上打孔,孔中加入已稀釋的抗原溶液和不同濃度的抗原標準品溶液。3.置37℃,讓其向四周自由擴散,24-48h后可見其孔周圍出現(xiàn)沉淀環(huán)。第二十六頁，共四十一頁，2022年，8月28日單向輻射狀免疫擴散上排為5個不同的參考，中、下排為患者血清，下排右2為一異常病理血清第二十七頁，共四十一頁，2022年，8月28日(三)方法評價

單向瓊脂擴散試驗是一種穩(wěn)定、簡便、毋需特殊設(shè)備，一般實驗室均可使用的常規(guī)方法，試驗的重復性和線性均好。敏感度為1.25mg/L第二十八頁，共四十一頁，2022年，8月28日(四)影響因素1.抗原分子量

抗原分子量大，擴散慢，沉淀環(huán)較?。豢乖肿恿啃?，擴散快，沉淀環(huán)相對較大。要求待檢血清和抗原標準品在血清學上具有均一性，否則可能出現(xiàn)結(jié)果偏高或偏低。

2.抗體種類實驗證明兔抗血清優(yōu)于馬、羊抗血清，兔抗血清可測抗原0.1~1IU/ml，馬抗血清為1~10IU/ml，羊為0.4~4IU/ml，為提高實驗敏感度，應(yīng)首選敏感度高的抗血清。第二十九頁，共四十一頁，2022年，8月28日3.抗體稀釋度

抗體濃度大，沉淀環(huán)小，則敏感度低；抗體濃度小，沉淀環(huán)增大，不同濃度抗原間的差別較顯著，敏感度高。但沉淀環(huán)過大，常造成邊緣糊不清，致使測量誤差也增大。因此要求在沉淀環(huán)清晰的基礎(chǔ)上加大稀釋度以提高敏感度。下圖為抗體分別以1:25、1:50、1:75、1:100稀釋，所形成的4條標準曲線。第三十頁，共四十一頁，2022年，8月28日二、雙向瓊脂擴散試驗(一)原理

將可溶性抗原和抗體置于瓊脂凝膠板的對應(yīng)孔中，兩者各自在凝膠中向四周自由擴散，當抗原與抗體相遇，在比例合適時形成可見的白色沉淀線。沉淀線的特征與抗原抗體的濃度、純度和擴散速率等有關(guān)。第三十一頁，共四十一頁，2022年，8月28日(二)操作步驟

（平板法）融化瓊脂，澆板每張載玻片約4ml。凝固，打孔孔徑3mm，孔間距3~5mm，孔型有雙孔型、三角孔型、雙排孔型和梅花孔型。加樣在相對孔內(nèi)加抗原或抗體。孵育使抗原抗體自由擴散，在兩孔之間抗原抗體相遇，在比例適時形成可見的沉淀線。沉淀線的數(shù)目、形態(tài)和位置與抗原和抗體的純度、濃度和擴散速度有關(guān)。第三十二頁，共四十一頁，2022年，8月28日第三十三頁，共四十一頁，2022年，8月28日(三)雙向免疫擴散試驗的應(yīng)用1.檢測未知抗原或抗體及其相對含量將已知的抗體或抗原與待檢標本加入成對孔中，見圖:根據(jù)沉淀線有無定性；根據(jù)沉淀線的位置估計抗原或抗體的相對含量根據(jù)沉淀弧形狀判斷抗原或抗體的相對擴散速率。第三十四頁，共四十一頁，2022年，8月28日沉淀線形狀、位置與抗原抗體擴散率及濃度的關(guān)系A(chǔ)：Ag、Ab濃度及擴散率近似；B：Ag、Ab濃度近似，擴散率Ag＞Ab；C：Ag、Ab濃度近似，擴散率Ag＜Ab；D：擴散率近似，濃度Ag＞Ab；E：濃度Ag＞Ab，擴散率Ag＞Ab；F：濃度Ag＜Ab，擴散率Ag＜Ab第三十五頁，共四十一頁，2022年，8月28日2.抗原性質(zhì)分析

利用三角孔型，將待檢抗原和標準抗原加入相鄰兩個孔中，與另一孔相對，根據(jù)沉淀線形狀分析待測抗原，見圖。第三十六頁，共四十一頁，2022年，8月28日A1：待檢抗原；A2：標準抗原第三十七頁，共四十一頁，2022年，8月28日3.抗體效價滴定

用梅花型孔，中間放抗原，周圍孔放下不同稀釋度的相應(yīng)抗體，以出現(xiàn)沉淀線的最高稀釋倍數(shù)為該抗體的效價。第三十八頁，共四十一頁，2022年，8月28日

效價檢測結(jié)果該圖是經(jīng)過一次基礎(chǔ)免疫，三次加強免疫，間隔七天之后，頸動脈取血所得血清測定的效價。免疫雙擴散測效價，加樣方式同上，從圖中可以看出最后測得的效價分別為：1：256，1：128，1：128中間孔—抗原；周圍孔——血清血清的稀釋倍數(shù)分別為：孔1—1/8；孔2