臨床生物化學(xué)檢驗(yàn)與分子診斷學(xué)

臨床生物化學(xué)檢驗(yàn)與分子診斷學(xué)自編實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)（供五年制醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)、衛(wèi)生檢驗(yàn)、國(guó)境衛(wèi)生檢疫等本科專業(yè)使用）廣東醫(yī)學(xué)院臨床生物化學(xué)教研室201012目 錄實(shí)驗(yàn)一 生物化學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)基本操作 1實(shí)驗(yàn)二 Hanes作圖法測(cè)定兔血紅細(xì)胞過(guò)氧化氫酶的Km值 6實(shí)驗(yàn)三 凝膠過(guò)濾法分離蛋白質(zhì) 8實(shí)驗(yàn)四 PCR擴(kuò)增DNA 11實(shí)驗(yàn)五 分子診斷學(xué)實(shí)驗(yàn)基本操作及樣品蛋白定量 17實(shí)驗(yàn)六 Western–blot技術(shù)：SDS 18實(shí)驗(yàn)七 Western–blot技術(shù)：電轉(zhuǎn)移 21實(shí)驗(yàn)八 質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化 23實(shí)驗(yàn)九 質(zhì)粒DNA的制備 28實(shí)驗(yàn)十 DNA的限制性內(nèi)切酶酶切分析 34實(shí)驗(yàn)十一RT-PCR法釣取小鼠肝臟β-actin基因 38實(shí)驗(yàn)十二全血基因組DNA提取 41實(shí)驗(yàn)十三核酸定量 43PAGEPAGE22/45實(shí)驗(yàn)一生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)基本操作一、實(shí)驗(yàn)記錄及實(shí)驗(yàn)報(bào)告的書寫生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)是在生物化學(xué)與分子生物學(xué)理論及有關(guān)理論指導(dǎo)下的實(shí)踐。實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟诮?jīng)過(guò)實(shí)踐掌握科學(xué)觀察的基本方法和技能，培養(yǎng)科學(xué)思維、分析判斷及解決實(shí)際問(wèn)題的能力，培養(yǎng)尊重科學(xué)事實(shí)和真理的學(xué)風(fēng)和科學(xué)態(tài)度。當(dāng)然，通過(guò)實(shí)驗(yàn)還可以加深和擴(kuò)大對(duì)生物化學(xué)與分子生物學(xué)理論的認(rèn)識(shí)。為了達(dá)到實(shí)驗(yàn)的目的，要求學(xué)生在實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行預(yù)習(xí)，通過(guò)預(yù)習(xí)對(duì)實(shí)驗(yàn)的內(nèi)容、目的要求、基本原理、基本操作及注意事項(xiàng)有初步的了解；要求學(xué)生在實(shí)驗(yàn)中合理組織安排時(shí)間，嚴(yán)肅認(rèn)真地進(jìn)行操作，細(xì)致觀察各種變化并如實(shí)做好實(shí)驗(yàn)結(jié)果的記錄；還要求學(xué)生在操作結(jié)束后認(rèn)真進(jìn)行計(jì)算或分析，寫好實(shí)驗(yàn)報(bào)告。（一）實(shí)驗(yàn)記錄實(shí)驗(yàn)記錄應(yīng)及時(shí)、準(zhǔn)確、如實(shí)、詳盡、清楚?！凹皶r(shí)”是指在實(shí)驗(yàn)中將觀察到的現(xiàn)象、結(jié)果、數(shù)據(jù)及時(shí)記錄在記錄本（或《實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》合適位置）上?；仡櫺缘挠涗浫菀自斐蔁o(wú)意或有意的失真。實(shí)驗(yàn)結(jié)果的記錄不可摻雜任何主觀因素，不能受現(xiàn)成資料及他人實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。若出現(xiàn)“不正?！钡默F(xiàn)象，更應(yīng)如實(shí)詳盡記錄。表格式的記錄方式簡(jiǎn)練而清楚，值得提倡使用。如無(wú)專用的記錄本，可分項(xiàng)記錄于《實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》中相應(yīng)的操作項(xiàng)目之下。記錄時(shí)字跡必須清楚，不提倡使用易于涂改及消退的筆、墨做原始記錄。完整的實(shí)驗(yàn)記錄應(yīng)包括日期、題目（內(nèi)容、目的、操作、現(xiàn)象及結(jié)果（括計(jì)算結(jié)果及各種圖表。使用精密儀器進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)還應(yīng)記錄儀器的型號(hào)及編號(hào)。（二）實(shí)驗(yàn)報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，應(yīng)及時(shí)整理和總結(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，寫出實(shí)驗(yàn)報(bào)告。完整的實(shí)驗(yàn)報(bào)告應(yīng)包括實(shí)驗(yàn)名稱、實(shí)驗(yàn)日期、目的要求、實(shí)驗(yàn)原理、試劑、儀器設(shè)備、操作方法、實(shí)驗(yàn)結(jié)果、討論等多項(xiàng)內(nèi)容。其中，目的要求、原理、設(shè)備、試劑及操作方法等項(xiàng)只要求作簡(jiǎn)明扼要的敘述，不必也不應(yīng)將《實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》原版抄錄一遍。但對(duì)實(shí)驗(yàn)的條件、操作要點(diǎn)等實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵環(huán)節(jié)應(yīng)作清楚描述。據(jù)及計(jì)算做出的各種圖表（如曲線圖、對(duì)照表等。討論部分不是對(duì)結(jié)果的重述，而是對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果、實(shí)驗(yàn)方法和異?，F(xiàn)象進(jìn)行探討和評(píng)論，以及對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的認(rèn)識(shí)、體會(huì)及建議。一般要有實(shí)驗(yàn)結(jié)論。結(jié)論要簡(jiǎn)單扼要，以說(shuō)明本次實(shí)驗(yàn)所獲得的結(jié)果。如在臨床生化檢驗(yàn)項(xiàng)目中，可評(píng)價(jià)樣本檢出值與相應(yīng)正常值之間的異同及其臨床意義。二、儀器操作（一）刻度吸量管：于取液量，同時(shí)必須看清楚吸量管的刻度讀數(shù)，以免弄錯(cuò)。刻度數(shù)字要向著自己。切忌用大拇指堵住管口，控制流量。處。用洗耳球的下端出口對(duì)準(zhǔn)吸量管上口，將液體輕輕吸上，眼睛注視上升液面，當(dāng)液面上升至所需取量稍高一些刻度時(shí)，立即用右手食指按緊管口。調(diào)準(zhǔn)刻度：吸管從溶液中取出后（如標(biāo)準(zhǔn)溶液或粘性較大的液體）須用小濾紙片將吸管尖端外部溶液擦干。然后用食指控制流量，使液面緩慢下降至所需刻度時(shí)（此時(shí)，液體彎月面底部、刻度和視線同在一水平線上，右手食指立即按緊吸管上口，使液體不再流出。內(nèi)壁，但不能插入受器內(nèi)原有液體之中，以免污染吸管及試劑。稍稍松動(dòng)右手食指，使液體自然流出。放液后吸管尖端殘留的液體是吹出或不吹出，則視選用吸量管種類要求而定。（二）微量移液器：使用方法：將吸嘴（Tip頭）裝在吸液桿上，應(yīng)套牢避免間隙。依據(jù)所需容量旋轉(zhuǎn)“手輪”，使“數(shù)輪”顯示所需值。輕輕地將推動(dòng)按鈕下壓，使推動(dòng)按鈕從“起始位置”推移到“置”。2～3cm2～3緩慢放松按鈕,即回到“起始位置”，溶液吸入后稍停即可將吸嘴移出液面。至“第一停點(diǎn)位置”，稍停繼續(xù)按壓至“第二停點(diǎn)位置”。同時(shí)將吸嘴在容器內(nèi)壁往復(fù)移動(dòng)幾次，排盡溶液。松開按鈕移出容器。移液完畢，按壓卸尖按鈕將吸嘴脫卸。使用注意事項(xiàng)：“數(shù)輪”其標(biāo)稱的容量范圍，否則使螺旋擰出殼體造成計(jì)數(shù)結(jié)構(gòu)損壞。吸不同類型的溶液應(yīng)更換吸嘴，以防止試樣之間的交叉污染。新吸嘴在使用前應(yīng)吸、排溶液幾次，浸漬吸嘴以消除測(cè)量誤差。移液器吸液后嚴(yán)禁倒置、平放，以免溶液流入內(nèi)腔，損壞活塞。“數(shù)輪”腔的彈簧變形，導(dǎo)致讀數(shù)出現(xiàn)較大的誤差。長(zhǎng)時(shí)間不用或剛從箱中取出的新移液器應(yīng)輕輕用手將推動(dòng)按鈕上下按（三）離心機(jī)：檢查各開關(guān)是否處于零位，放平機(jī)器。注意離心機(jī)的金屬（或塑料）離心套管必須完整。管底應(yīng)墊好軟墊（花或膠墊。離心前將兩支裝有標(biāo)本的離心管放入離心套管內(nèi)，在天平稱量，使之重量平衡（0.1g）好的離心管連同離心套管一起分別置于離心機(jī)對(duì)稱位置上，以保持平衡。逐步加快至所需轉(zhuǎn)速。切不可將轉(zhuǎn)速一下調(diào)至最大，以免引起劇烈振動(dòng)、損壞電機(jī)或使離心管破碎。減速，待離心機(jī)停穩(wěn)后方可取出離心物。切勿用手或其他物件強(qiáng)行減速。水沖洗后再擦干，以免金屬離心管被腐蝕、生銹而損壞。在使用中如發(fā)現(xiàn)聲音不正常，應(yīng)立即切斷電源，待檢查修復(fù)后再使用。（四）紫外可見分光光度計(jì)：WFZUV2100濃度值或斜率測(cè)量樣品濃度等測(cè)量方式，可根據(jù)需要選擇合適的測(cè)量方式。該546nm，測(cè)量方式自動(dòng)設(shè)定在透射率方式100％T0%。在開機(jī)前，需先確認(rèn)儀器樣品室內(nèi)是否有物品擋在光路上，光路上有阻擋物將影響儀器自檢甚至造成儀器故障。無(wú)論選用何種測(cè)量方式，都必須遵循以下基本操作步驟。連接儀器電源線，確保儀器供電電源有良好的接地性能。接通電源，至儀器自檢完畢，顯示器顯示“546nm100.0”即可進(jìn)行測(cè)試。用<MODE>鍵設(shè)置測(cè)試方式：透射率(T)，吸光度（A濃度值方式（C）和己知標(biāo)準(zhǔn)樣品斜率（F）方式。用波長(zhǎng)設(shè)置鍵，設(shè)置測(cè)定波長(zhǎng)。每當(dāng)測(cè)定波長(zhǎng)改變時(shí)，必須重新調(diào)整0A/100%T。UV-2100晶屏?xí)@示“BLA―――”335nm處。正常情況下，儀器開機(jī)后，鎢燈和氘燈同時(shí)點(diǎn)亮。為延長(zhǎng)光源燈的使用壽命，儀器特別設(shè)置了光源燈開關(guān)控制功能，測(cè)定波長(zhǎng)在335nm-1000nm時(shí)，應(yīng)選用鎢燈。蓋。一般情況下，參比樣品放在第一個(gè)槽位中。儀器所附的比色杯，其透射率是經(jīng)過(guò)配對(duì)測(cè)試的，未經(jīng)配對(duì)處理的比色杯將影響樣品的測(cè)試精度。比色杯透光部分表面不能有指印、溶液痕跡，被測(cè)溶液中不能有氣泡、懸浮物，否則也將影響樣品測(cè)試的精度。將參比樣品推（拉）“0A/100%T”鍵調(diào)0A/100%T，此時(shí)液晶屏顯示的“BLA―――”直至“100.0”或“0.000”為止。后，將被測(cè)樣品推（拉）入光路，此時(shí)液晶屏顯示被測(cè)樣品的透射率或吸光度值，接著拉動(dòng)拉桿使第二、第三比色杯對(duì)準(zhǔn)光路，按相同的方法讀取數(shù)值。注意事項(xiàng)：分光光度計(jì)為貴重的精密儀器、要防震、防潮、防光和防腐蝕。力過(guò)猛，以防損壞機(jī)件。儀器應(yīng)放在干燥的地方。防光：光電池平時(shí)不應(yīng)受光照射。使用時(shí)要防止強(qiáng)光照射，防止長(zhǎng)時(shí)間的連續(xù)照射。防腐蝕：使用時(shí)要防止酸堿等物質(zhì)侵入機(jī)件內(nèi)部。盛裝待測(cè)液時(shí)，達(dá)到比3/4要輕柔，以防溶液濺出、腐蝕機(jī)件。比色杯的磨面。比色杯用完后立即先用自來(lái)水沖洗，再用蒸餾水洗凈、晾干。每臺(tái)分光光度計(jì)比色杯為本臺(tái)專用，不可與其他分光光度計(jì)的比色杯互換。實(shí)驗(yàn)二Hanes作圖法測(cè)定兔血紅細(xì)胞過(guò)氧化氫酶的Km值【原理】應(yīng)：222酶22O+2↑H2O2濃度可用KMnO4在硫酸存在下滴定測(cè)知。2KMn4＋522＋3SO4 O4O22求出反應(yīng)前后H2O2的濃度差并計(jì)算出反應(yīng)速度。用Hanes作圖法求出過(guò)氧化氫酶的米氏常數(shù)。Hanes作圖法：將米氏方程式變換為[S]/V=Km/Vmax+[S]/Vmax形式，計(jì)算出相關(guān)數(shù)值后，以[S]/V為縱坐標(biāo)，[S]為橫坐標(biāo)作圖，直線在橫軸上的截矩即為－Km?！驹噭?．0.05mol/L草酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液將草酸鈉（AR）100～10512h0.67g100mlH2SO45ml，加蒸餾水至刻度，充分混勻，此液可貯存數(shù)周。2．約0.02mol/LKMnO4儲(chǔ)存液稱取KMnO43.4g，溶于1000ml蒸餾水中，加熱攪拌，待全部溶解后，用表面皿蓋住，在低于沸點(diǎn)溫度上加熱數(shù)小時(shí)，冷后放置過(guò)夜，玻璃絲過(guò)濾，棕色瓶?jī)?nèi)保存。mol/L0.05mol/L20H2SO41ml70KMnO4貯存液滴定至微紅色，根據(jù)KMnO40.004mol/L須重新標(biāo)定儲(chǔ)存液。40.08mol/L20%0.004mol/L出準(zhǔn)確濃度后，稀釋至所需濃度。．0.2mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.0.2mol/LN2HPO4610ml，0.2mol/LNaH2PO4390pH7.00.2mol/L1000ml.6．25%H2SO4溶液（或肝素抗凝0.110ml，混勻。取此稀釋血液1.0ml，用磷酸鹽緩沖液(pH7.0，0.2mol/L)稀釋至10ml，得1:1000稀釋血液?！静僮鞑襟E】取干燥潔凈50ml錐形瓶5只，編號(hào)，按下表操作。加入物(ml)H2O2(0.08蒸餾水

10.503.0

21.002.50

31.502.00

42.001.50

52.501.00室溫下?lián)u勻，每瓶依次加入1:1000稀釋血液0.5ml，邊加邊搖，37℃保溫525%H2SO42.00.004mol/L滴定各瓶至微紅色KMnO4消耗量(ml)。[注意事項(xiàng)]硫酸的濃度較大，小心不要濺出。作圖應(yīng)該用坐標(biāo)紙，標(biāo)明有關(guān)參數(shù)。滴定操作：使用滴定管前要先檢查滴定管是否漏水或有堵塞。滴定管使用前要潤(rùn)洗（KMnO424ml處。使用時(shí)，不能左右推動(dòng)活塞（控制流量。0，爾后排除尖端氣體。讀數(shù)時(shí)，視線要與彎月面平行。實(shí)驗(yàn)三 凝膠過(guò)濾法分離蛋白質(zhì)【原理】物。目前主要有葡聚糖凝膠（Sephadex，天然瓊脂糖凝膠（商品名Sepharos、聚丙烯酰胺凝膠（Bio-Ge，其后還發(fā)展了凝膠的各種衍生物，如羧甲基交聯(lián)葡聚糖（CM-Sephadex，二乙基氨乙基交聯(lián)葡聚糖（DEAE-Sephadex）等種類。凝膠過(guò)濾就是按照溶質(zhì)分子的大小不同而進(jìn)行分離的一種色譜技術(shù)，當(dāng)溶質(zhì)分子大小不同的樣品溶液通過(guò)凝膠柱時(shí)，由于凝膠顆粒內(nèi)部的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)具有分子篩作用，分子大小不同的溶質(zhì)就會(huì)受到不同的阻滯作用，本實(shí)驗(yàn)高鐵血紅蛋白分子量大，不易滲入網(wǎng)絡(luò)，被排阻在凝膠顆粒之外，因而所受到阻滯作用小，先流出色譜床。高鐵氰化鉀(K3Fe(CN)6分子量小，能滲透到網(wǎng)絡(luò)的內(nèi)部，洗脫流程長(zhǎng)，因此所受到的阻滯作用大，后流出色譜床，這樣就可以達(dá)到分級(jí)分離的目的。在含有血紅蛋白(Mw＝64500)加入過(guò)量的高鐵氰化鉀(K3Fe(CN)6，Mw＝327.25)，血紅蛋白與高鐵氰化鉀反應(yīng)生成高鐵血紅蛋白 (methemoglobin，MetHb)。為了除去多余的高鐵氰化鉀，得到較純的MetHb樣品，將上述混合通過(guò)交聯(lián)葡聚糖凝膠柱，用磷酸緩沖液洗脫，從顏色的不同，可直接觀察到MetHb(紅褐色)洗脫較快而小分子高鐵氰化（黃色洗脫較慢達(dá)到將MetHb完全分離出來(lái)的目的?！驹噭靠鼓穆然?CCl4)生理鹽水G-25(細(xì)粒)5．0.1mol/L磷酸緩沖液(pH7.0)6．0.4%K3Fe(CN)6【操作步驟】5g60ml310倍體積的磷酸緩沖液浸泡過(guò)夜，以達(dá)平衡。裝柱取玻璃層析柱(25cm×1.5cm)一支，垂直裝好。加入緩沖液，打開2cm左右高，G-25G-255cm3ml5～10min后，打開出口，用2樣品處理3ml53000r/min5min，棄去上清液，重復(fù)3次。最后一次吸去上清液后，在紅細(xì)胞層上面加等體積蒸餾水，振搖。再1/2CCl4000r/min5minHb10%(4℃暫存，一周用完)。樣品血紅蛋白液3K3Fe(CN)682滴混合，制成MetHb混合樣品。上樣、洗脫打開平衡好的層析柱出口，使柱內(nèi)溶液流出至剛露出柱床面時(shí)即關(guān)閉出口。吸取混合樣品0.5ml左右，在距離床面1mm處沿管內(nèi)壁輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)加入，切勿攪動(dòng)床面。然后打開出口，使樣品進(jìn)入床內(nèi)，直至床面重新露1～2倍樣品量體積的洗脫液(這樣可以使樣品定容至最小，而樣品又完全進(jìn)入床內(nèi))切勿攪動(dòng)床面凝膠，然后人工添加洗脫液(保持液面距柱床面距離不少于2cm)進(jìn)行洗脫。分部收集用小試管，以5滴/min，10滴/管的速度進(jìn)行收集。并且觀K3Fe(CN)6色帶完全洗脫下來(lái)后(6~7管關(guān)閉出口。測(cè)定 將每管收集液加入蒸餾水2ml，混勻，在425nm處測(cè)其吸光度以吸光度為縱坐標(biāo)，管數(shù)為橫坐標(biāo)，繪出洗脫圖譜。1～22cm高磷酸緩沖液浸泡。【注意事項(xiàng)】裝柱后要檢查柱床是否均勻，若有氣泡或分層的界面時(shí)，需要重新裝柱。樣品上柱后應(yīng)在凝膠柱表面形成一層薄液層。4．收集要及時(shí)，不能等紅褐色物質(zhì)流出之后再收集。盡量保持各管收集的液量一致。洗脫過(guò)程中要防止凝膠柱洗脫液流干。洗脫完成后凝膠要回收，勿丟棄。實(shí)驗(yàn)四 PCR擴(kuò)增DNA【原理】PCRDNA增技術(shù)。PCR技術(shù)實(shí)際上是在模板DNA4種脫氧核糖核苷酸(dNTP)DNA聚合酶的酶促合成反應(yīng)。PCRDNA過(guò)程中獲得目的基因片段提供了簡(jiǎn)便快速的方法，該技術(shù)可用于：①與反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)相結(jié)合，直接從組織和細(xì)胞的mRNAcDNADNA為模板獲得已知目的cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)中獲得具有一定序列相cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)中克隆基因?；虻捏w外突變PCR技術(shù)建立以前，在體外對(duì)基因進(jìn)行各種突變是一費(fèi)時(shí)費(fèi)力的工作。PCR點(diǎn)突變等改造。PCRDNADNAcDNA）微量分析的最好方法。理論上講，只要存在一分子的模板，就可以獲得目的片段。實(shí)際工作中，一滴血液、一根毛發(fā)或一個(gè)細(xì)胞PCR的檢測(cè)需要，因此在基因診斷方面具有極廣闊的應(yīng)用前景。PCRDNA3步：①變性：通過(guò)加熱使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，雙鏈解離形成單鏈DNA；②退火：當(dāng)溫度突然降低時(shí)，由于模板分子結(jié)構(gòu)較引物要復(fù)雜得多，而且反應(yīng)體系DNADNDNA雙鏈之間互補(bǔ)的機(jī)會(huì)較少。③延伸：在DNA4dNTPMg2+DNA鏈延伸3DNA21067拷貝。蛋白激酶CK2是一種真核細(xì)胞中普遍存在的信使非依賴性絲/蘇氨酸蛋白(αα')和兩個(gè)調(diào)節(jié)亞基(β)RT-PCRCK2βcDNApT7-7CK2β亞基cDNA3087bppTCKBDNA的擴(kuò)增模板，加入人蛋白CK2βcDNA4dNTPTaqDNA聚合PCR擴(kuò)增。理論上擴(kuò)增的PCR672bp?！驹噭┡c器材】上游引物:5'AATCTAGACATATGAGCAGCTCAGAGGAGGT' 其序CK2βcDNA205'NdeI酶切位點(diǎn)。濃度為5pmol/μl5μmol/L，25μl12.5pmol。2．下游引物:5'AAGGATCCAAGCTTCAGCGAATCGTCTTGACTGGCK2β亞基cDNA215'5pmol/μl5μmol/L，25μl12.5pmol。CK2βcDNA質(zhì)粒1ng/μl，25μl5ng。4．10×buffer濃度（購(gòu)買Taq酶有配套的Buffer）:500mmol/LKCl，100mmol/LTriton-X5．10×MgCl2 25mmol/L。dNTP2.5mmol/L 10mol/LdCTP四種混合即成TaqDNA聚合酶（國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口5l，50μl1U,0.5U/μl8．消毒三蒸水9．6×載樣緩沖液 0.25%二甲苯青FF，0.25%溴酚藍(lán)，30%甘油。SYBR?GreenI熒光染料為避免溴化乙錠的污染，本實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)中所有涉及DNASYBR?GreenI熒光染料（參看后面所附的知識(shí)介紹EBSYBR?GreenIDMSO10000DMSO5060μl1ml6×5μlDNA1μlSYBR?GreenI熒光染料的載樣緩沖液，電泳后可直接于紫外分析儀上觀察結(jié)果，激發(fā)光最好用254nm紫外光以獲得最高靈敏度。上述SYBR?GreenI10000倍濃DMSO50倍的稀釋液須避光保存于-20℃，含SYBR?GreenI熒6×4℃。SYBR?GreenI6×配制方法見上，也可參考實(shí)驗(yàn)十一。12．50×TAE電泳Buffer 12.2gTris，2.85ml冰醋酸，10ml0.25加水至50ml。13．DNAMarker14．各種國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口移液器150.2mlPCR管，10μl，100μltips16．小型離心機(jī)PCR儀水平電泳槽和電泳儀紫外分析儀【操作步驟】PCR0.2mlPCR管，按下表操作（PCR2個(gè)人做一管：試劑消毒三蒸水10×buffer加入量7μl2.5μl最終濃度(或含量)1×buffer10×MgCl22.5μl2.5mmol/LdNTP2μl各0.2mmol/L上游引物2.5μl（5μmol/L）12.5pmol下游引物2.5μl（5μmol/L）12.5pmolDNA模板(pTCKB)5μl(1ng/μl)5ngTaqDNA聚合酶1μl(0.5U/μl)0.5U總體積 25μlPCRPCR反應(yīng)。PCRPCR30s94℃，5min72℃，10min?！经傊悄z電泳】制備瓊脂糖凝膠稱取1g1×TAEBuffer100ml1%瓊脂糖凝膠。灌膠取潔凈的電泳內(nèi)槽(又稱托盤)，用透明膠帶將內(nèi)槽的兩端邊緣封好(定要封嚴(yán)，不能留縫隙)。將內(nèi)槽放置于一水平臺(tái)面，并插好所需齒數(shù)和厚度的樣品梳子。602μl入內(nèi)槽，直至所需厚度，注意不要形成氣泡，特別是梳子下，如有氣泡可用牙簽挑破。泳槽中，注意凝膠點(diǎn)樣端要靠近負(fù)極。1×TAE緩沖液至電泳槽，緩沖液剛沒(méi)過(guò)凝膠表面即可。加樣取6×5μlEP10μl上樣。另外，每排孔需加一份DNAMake做對(duì)照（DNAMaker3μl1μl混勻,將其加入凝膠的點(diǎn)樣孔即可。電泳接通電源槽與電泳儀的電源(正極移動(dòng))100V2/3段凝膠，停止電泳。PCR3.5英寸磁盤,便于在電腦下觀察。[注意事項(xiàng)]EP管。PCRDNA樣品及各種試劑的用量都極少，必須嚴(yán)格注意吸樣DNATaqDNA聚合酶。加樣過(guò)程中所有試劑用完后均應(yīng)置于冰上。PCRPCRPCR反應(yīng)。附：SYBR?GreenI核酸熒光染料介紹SYBRGreenI烯酰胺凝膠中的核酸。根據(jù)AmesSYBRGreenI沒(méi)有溴乙啶（ethidiumDNA有較強(qiáng)的親和力，當(dāng)其結(jié)合到DNA上時(shí)，會(huì)產(chǎn)生很強(qiáng)的熒光及高量子產(chǎn)額，DNA/SYBR?GreenⅠ復(fù)合物的量子產(chǎn)額約為EB10倍。由于與核酸結(jié)合后能產(chǎn)生很強(qiáng)的信號(hào)，背景極低，并且對(duì)核酸的親和力很SYBR染料可在低濃度條件下使用。如果用300nmSYBRGreenIshDNA的最低檢測(cè)量為或6×10-11254nm光源從上往下照射，最低可以檢測(cè)到20pg的dsDNA。SYBRGreen大約比EB靈敏25到100倍。如果用300nm的透視法照射，檢測(cè)寡核苷酸的極限12pg。SYBRGreenI的高靈敏度特性使其在檢測(cè)微量DNADNA（PCR）SYBR的高靈敏度特性使其可以在某些時(shí)候甚至可以取代放射性同位素和銀染染料。SYBR?GreenDNASYBR?GreenDNADNA轉(zhuǎn)移至膜上，進(jìn)DNA的結(jié)合對(duì)多種常用的限制性內(nèi)切酶活性無(wú)抑制作用，可直接進(jìn)行消化或連接。SYBR?GreenDNA檢測(cè)（即實(shí)時(shí)PCRSYBR?GreeDMSO10,000、TETBE緩沖液，或直接加于上樣緩沖液中。10,000DMSO10100倍后，再加于各種水溶液中。SYBR?Green-204存于密封聚丙烯容器。20pgdsDNA，靈敏度比EB25到100倍。高亮度：在較暗的背景下發(fā)出亮綠色的熒光，比EB10使用簡(jiǎn)單：不需要清洗。價(jià)格便宜：比銀染更便宜。不比EB貴。實(shí)驗(yàn)五分子診斷學(xué)實(shí)驗(yàn)基本操作及樣品蛋白定量第一部分：分子診斷學(xué)實(shí)驗(yàn)基本操作（教師示教，學(xué)生練習(xí)操作）一、垂直板電泳裝置二、電轉(zhuǎn)移三、超凈臺(tái)無(wú)菌操作第二部分：樣品蛋白定量（Bradford法定量蛋白質(zhì)）原理考馬斯亮藍(lán)G-250465～595nm最大的光吸收值，化合物顏色的深淺與蛋白濃度的高低成正比，檢測(cè)595nm吸收值可計(jì)算蛋白的含量。Bradford法操作方法空白管標(biāo)準(zhǔn)管樣品管生理鹽水0.1ml--1.0mg/ml標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液-空白管標(biāo)準(zhǔn)管樣品管生理鹽水0.1ml--1.0mg/ml標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液-0.1ml-樣品液--0.1ml考馬斯亮蘭G-250試劑5.0ml5.0ml5.0ml每加完一管，立即在旋渦混合器上混合。加完試劑2~5分鐘后，在分光光度計(jì)上測(cè)定各樣品在595nm處的光吸收值A(chǔ)59595%色。樣品蛋白質(zhì)含量樣品管吸光度值/標(biāo)準(zhǔn)管吸光度值51.0（mg/ml。注意事項(xiàng)樣品制備過(guò)程應(yīng)注意保持低溫。離心時(shí)對(duì)稱放置，集體離心，離心機(jī)由帶教老師操作。因考馬斯亮藍(lán)G-250染色能力強(qiáng),易地將比色杯清洗干凈。實(shí)驗(yàn)六SDS器材垂直板電泳裝置試劑SDS加樣緩沖液30％凝膠貯備液(3)10％(W/V)SDSTEMED10％(W/V)過(guò)硫酸胺溶液Tris-甘氨酸電泳緩沖液(pH8.3)分離膠緩沖液濃縮膠緩沖液考馬斯亮藍(lán)R-250R-250450ml，100ml過(guò)濾，常溫保存；洗脫液：甲醇45ml，冰醋酸10ml45ml操作方法 說(shuō)明安裝好。按表1、表2選擇及配制PAGE分離膠，厚度為1mm。表1 蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺膠的有效分離范圍凝膠濃度％15107.55.0Bis：Acr的分子比為1：29

分離范圍12～4316～6839～9457～212表2 配制Tris-甘氨酸SDS-聚丙烯酰胺凝放電泳分離膠所用溶液溶液成份6％

5ml

不同體積凝膠液中各成分所需體積10ml 15ml 20ml 25ml 30ml 40ml 50mlH2O2.65.37.910.613.215.921.226.530％丙烯酰胺溶液1.02.03.04.05.06.08.010.01.5mol/LTris(pH8.8)1.32.53.85.06.37.510.012.510%SDS0.050.10.150.20.250.30.40.510%過(guò)硫酸胺溶液0.050.10.150.20.250.30.40.5TEMED0.0040.0080.0120.0160.020.0240.0320.048%H2O2.34.66.99.311.513.918.523.230％丙烯酰胺溶液1.32.74.05.36.78.010.713.31.5mol/LTris(pH8.8)1.32.53.85.06.37.510.012.510%SDS0.050.10.150.20.250.30.40.510%過(guò)硫酸胺溶液0.050.10.150.20.250.30.40.5TEMED0.0030.0060.0090.0120.0150.0180.0240.0310%H2O1.94.05.97.99.911.915.919.830％丙烯酰胺溶液1.73.35.06.78.310.013.316.71.5mol/LTris(pH8.8)1.32.53.85.06.37.510.012.510%SDS0.050.10.150.20.250.30.40.510%過(guò)硫酸胺溶液0.050.10.150.20.250.30.40.5TEMED0.0020.0040.0060.0080.010.0120.0160.02層加入幾毫升蒸餾水，以阻止空氣氧對(duì)凝膠聚合的抑制作用。紙吸干凝膠頂端殘存的液體。按表3配制濃縮膠，并注入分離膠上端，插入梳子應(yīng)小心避免氣泡。表3 配制Tris-甘氨酸SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳5％濃縮膠所用溶溶液成份1ml2ml溶液成份1ml2ml3ml4ml5ml6ml8ml10ml0.681.42.12.73.44.15.56.830%丙烯酰胺溶液0.170.330.50.670.831.01.31.71.0mol/LTris(pH6.8)0.130.250.380.50.630.751.01.2510%SDS0.010.020.030.040.050.060.080.110%過(guò)硫酸胺溶液0.010.020.030.040.050.060.080.1TEMED0.0010.0020.0030.0040.0050.0060.0080.01靜置待膠凝。取0.1ml樣品液，加入0.1ml樣品緩沖液混合，沸水加熱3分鐘,1000轉(zhuǎn)/心3分鐘，準(zhǔn)備上樣。電極緩沖液，檢查是否泄漏。驅(qū)除兩玻璃板間凝膠底部的氣泡。上樣前用上槽緩沖液沖洗梳子孔。20l樣品和標(biāo)準(zhǔn)物最好將1×樣品緩沖液加入未使用梳子孔中。電泳:開始時(shí)電壓為50V，染料進(jìn)入分離膠后，將電壓增加到100V泳到染料抵達(dá)分離膠底部，斷開電源。好無(wú)損。注意事項(xiàng)Acr和Bis單體溶液及過(guò)硫酸銨為有毒成份（勿入口）。配好膠后應(yīng)盡快灌膠，及時(shí)清洗儀器。灌分離膠時(shí)要注意防止膠液滲漏.灌膠時(shí)要注意排除氣泡。加水隔氧時(shí)動(dòng)作輕柔，小心勿沖擊到液面.器材

實(shí)驗(yàn)七電轉(zhuǎn)移電轉(zhuǎn)移裝置、Whatman3mm濾紙、硝酸纖維素膜(NC膜)試劑轉(zhuǎn)移緩沖液0.1％麗春紅染液操作方法戴手套剪6塊3mm濾紙和一塊NC膜，其大小與SDS大小相同。將剪好的上述物品在轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡3～5分鐘。按下列過(guò)程安裝轉(zhuǎn)移裝置：①將塑料支架平放在含有轉(zhuǎn)移緩沖液的托盤中，3抉3mm濾紙對(duì)齊放在海綿上，依次放置纖維3塊3mm濾紙及海綿。在放置每一層時(shí)，均要去除它們之間放入電轉(zhuǎn)移槽內(nèi)，注意纖維素膜一側(cè)靠正極，膠一側(cè)靠負(fù)極。接通電源，電壓40V電流0.17～0.2A，低溫下轉(zhuǎn)移1.5～6小時(shí)，轉(zhuǎn)移時(shí)間可根轉(zhuǎn)移結(jié)束后，取出塑料支架，依次去掉各層，用鉛筆或剪刀在NC膜的上緣作好標(biāo)記，將NC膜放入盛有麗春紅的培養(yǎng)皿中,再經(jīng)洗脫液脫色,果。凝膠放入氨基黑染液中染色0.5分鐘,再經(jīng)洗脫液脫色,觀察轉(zhuǎn)移結(jié)果。(注意電泳緩沖液、轉(zhuǎn)移緩沖液、麗春紅染色液氨基黑染色液要回收)注意事項(xiàng)3mm濾紙及NC泌物會(huì)影響轉(zhuǎn)移效果。安裝轉(zhuǎn)移裝置時(shí)，避免濾紙或膜比凝膠大，形成短路，影響轉(zhuǎn)移效果。22/45PAGEPAGE43/45實(shí)驗(yàn)八 質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化【原理】質(zhì)粒是存在于細(xì)菌染色體以外的小型環(huán)狀雙鏈DNA，能自我復(fù)制和表達(dá)其攜帶的遺傳信息。質(zhì)粒可自然形成超螺旋結(jié)構(gòu)，不同質(zhì)粒大小在2~300kb之間，＜15kb的小質(zhì)粒比較容易分離純化，＞15kb的大質(zhì)粒則不易提取。質(zhì)粒（autonomousreplicoDNA復(fù)制的質(zhì)粒可隨宿主細(xì)胞分裂而傳給后代。按質(zhì)粒復(fù)制的調(diào)控及其拷貝數(shù)可分兩類：嚴(yán)緊控制control）1個(gè)到十幾個(gè)拷貝；另一類是松弛控制（relaxedcontrol）DNAori能被宿主細(xì)胞復(fù)制蛋白質(zhì)識(shí)別的質(zhì)粒才能在該種細(xì)胞中復(fù)制，不同質(zhì)粒復(fù)制控制狀況主要與復(fù)制起點(diǎn)的序列結(jié)構(gòu)相關(guān)。質(zhì)粒對(duì)宿主生存并不是必需的。DNA1943DNA與無(wú)毒肺炎雙球菌共培養(yǎng)后產(chǎn)生有毒性的肺DNA進(jìn)入細(xì)胞的效率很低，在分子生物學(xué)和基因工程工作中可采取一些方法處理細(xì)胞，經(jīng)處理后的細(xì)胞就容易接受外界DNADNA接觸，就能提高轉(zhuǎn)化效率。DNA分子導(dǎo)入到受體細(xì)胞，使之獲得新的遺傳特性的一種-切酶和甲基化酶（R-，M-。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌（受體細(xì)胞）經(jīng)理化方法處DNA分子進(jìn)入的DNA分子通過(guò)復(fù)制和表達(dá)實(shí)現(xiàn)信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞具有了新的遺傳性狀。將經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)，即可篩選出轉(zhuǎn)化子（DNA分子的細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)采用CaCl2法制備感受態(tài)細(xì)胞。其原理是細(xì)胞處于0～4℃，CaCl2低滲溶液中，大腸桿菌細(xì)胞膨脹成球狀。轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羥基-4290s熱激處理，促進(jìn)細(xì)胞吸收DNAAmp的選擇性培養(yǎng)基上，倒置培養(yǎng)過(guò)夜，即可獲得細(xì)菌菌落。CaCl2CaCl2與質(zhì)粒DNA形成羥基DNA免受細(xì)胞DNACaCl2溶液可使大腸桿菌膨脹成球狀，細(xì)胞膜間隙增加，易于接受外源性2+帶正電荷可消除質(zhì)粒帶負(fù)電荷與細(xì)胞膜（含磷酸基團(tuán)帶負(fù)電荷）之間的靜電排斥作用。Bcl-2DH5αAmp基上進(jìn)行篩選，生長(zhǎng)的菌落即為含重組質(zhì)粒的工程菌。Bcl-2DH5αDNADNA?！驹噭┡c器材】LB10g5g10gNaCl加蒸500ml5mol/LNaOHpH7.41L瓶（1/3）103.4Kpa20min。LBLB液體培養(yǎng)基（液體約占瓶體1/31.5不燙手背時(shí)（50℃，平鋪于滅菌處理的培養(yǎng)皿。3．0.1mol/LCaCl2溶液稱取11.1g無(wú)水氯化鈣，加超純水溶解，倒入容量瓶定容至1L。隨后分裝于三角錐形瓶中，用棉塞或錫紙封好瓶口，高壓滅菌消毒；或者直接過(guò)濾除菌。4．100mg/ml1g的氨芐青霉素瓶中直接用注2ml無(wú)菌水或生理鹽水，溶解氨芐青霉素白色粉劑，吸取全部溶液于10ml1.5ml-20使用時(shí)需化凍。Bcl-2Bcl-2EcoRpBluescriptⅡKS(-)EcoRBcl-2cDNA重組而成的，大小為4861bp，前pUC192961bpEcoRⅠpBluescriptⅡKS(-)載體(2.96kb)Bcl-2cDNA片段(1.9kb)2ng/μl。大腸桿菌DH5α 此為DNA擴(kuò)增菌恒溫水浴箱，超凈工作臺(tái)，高速冷凍離心機(jī)，恒溫?fù)u床，恒溫培養(yǎng)箱消毒離心管，消毒tips，玻璃培養(yǎng)皿直徑9021個(gè)，玻璃涂布器（1個(gè)，標(biāo)記筆9．75%乙醇和燃燒酒精10．細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞的制備（）DH5αLB在恒溫培養(yǎng)箱里培養(yǎng)過(guò)夜或時(shí)長(zhǎng)12~16h。5ml不含氨芐青霉素的LB100~200r/min12~16h蘇。1ml100mlLB培養(yǎng)基（1:100）的三角錐形瓶（1/3口用滅菌處理過(guò)的棉塞或錫紙封好）中，37200~300r/min2～3A6000.25~0.3（A6002~3A6000.25-0.4小時(shí)以上15min。50ml離心機(jī)，4000×g，410min液體流盡。加預(yù)冷的已過(guò)濾除菌(過(guò)濾膜微孔直徑為22μm)或高壓滅菌的0.1mol/LCaCl2溶液（用無(wú)水氯化鈣和超純水配制）中用移液槍輕輕吹打，重懸菌體，置冰浴30min。使用冷凍高速離心機(jī)，4000×g，4℃離心10min，棄培養(yǎng)基。4ml0.1mol/L溶液，輕輕重懸菌體，置4h【操作步驟】30min30min4290s2min。加入不含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基200μl200μl37℃、100~150r/min15min，使細(xì)菌復(fù)蘇并表達(dá)抗性基因。200μl加至含氨芐青霉素（Amp）LB瓊脂平板上（平板側(cè)面用標(biāo)記筆寫好班級(jí)，姓名，日期，實(shí)驗(yàn)組或?qū)φ战M，用玻璃涂布器涂布均3712～16h無(wú)菌條件下分別加入：實(shí)驗(yàn)組陰性對(duì)照組新鮮感受態(tài)DH5α細(xì)菌50μl50μl人Bcl-2重組質(zhì)粒2ng/μl5μl——滅菌水——5μl【注意事項(xiàng)】搖或吹打。10倍。44～6倍。感受態(tài)細(xì)胞熱休克時(shí)間要準(zhǔn)確，中途不要搖動(dòng)離心管。細(xì)菌鋪板密度過(guò)高或培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)使一些未轉(zhuǎn)化（不含Amp抗性）的細(xì)100μg/ml徹底根治。2次。稍冷后，再涂此步實(shí)驗(yàn)切記用火安全！特別是在超凈臺(tái)上使用時(shí)，更應(yīng)注意，可安排每個(gè)實(shí)驗(yàn)臺(tái)由一人專門負(fù)責(zé)安全。生長(zhǎng)有菌落的平板密封倒置存放于4℃（可放在4℃冷柜中）DNA的制備。實(shí)驗(yàn)九 質(zhì)粒DNA的制備DNA的方法眾多，其分離的依據(jù)可根據(jù)分子DNA的超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)進(jìn)行。目前常用的有堿裂解法(又稱堿變性抽提法)、羥基磷灰石柱層析法、質(zhì)DNA釋放法、酸酚法、兩相法以及溴化乙錠-氯化銫密度梯度離心法。以上方法各有利弊。但總結(jié)多數(shù)實(shí)驗(yàn)室的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，認(rèn)為堿裂解法效果良好，經(jīng)濟(jì)DNA的方法，也是當(dāng)今分子生物DNAPCR【原理】細(xì)菌在堿液(pH12.6)中裂解，NaOHDNA變DNA相互交聯(lián)纏繞形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。但質(zhì)粒DNADNA易與變性蛋白質(zhì)纏繞。pH4.8KAcpHDNASDSSDS-DNASDS了溶解度低的十二烷基硫酸鉀(PDS)DNAPDS-DNA留在上清中，再經(jīng)酚/DNA。堿裂解法中一些試劑的生化原理：,維持滲透壓,DNAMg2+,Ca2+,DNase;有利于溶菌酶作用(環(huán)境)。③溶菌酶：溶菌,pH＜8.0該酶受抑制（從大腸桿菌中提取質(zhì)?？梢圆患尤芫?。溶液Ⅱ：①NaOHpH5～9穩(wěn)定,pH＞12或＜3則變性,IIpH12.6SDS-溶液Ⅲ：KAc-HAc緩沖液(pH4.8)pH12.6pH至中性,使變性DNA復(fù)性,并穩(wěn)定存在,SDS中的鈉后形成了水不溶的十二烷基硫酸鉀(PDS)KAcPDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物中的染色體DNADNA與蛋白質(zhì)復(fù)合物一起沉淀下來(lái)而被除去。DNA3DNADNA或多處斷裂；③復(fù)制中間體，即沒(méi)有復(fù)制完全的兩個(gè)質(zhì)粒連在了一起。在電泳DNA3種形式泳動(dòng)速度：超螺旋＞開環(huán)＞復(fù)制中間體?！驹噭烤N含pBR322DNA的大腸桿菌工程菌如HB10，JM109DNEcoRDNA轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，如本實(shí)驗(yàn)Bcl-2DH5α。LB10g5g10gNaCl500ml5mol/LNaOHpH7.41L瓶（1/3）103.4Kpa20min。3．10mg/ml氨芐青霉素(Amp)溶液在規(guī)格為1g的氨芐青霉素瓶中直接2ml100ml5ml的離心管中，封口紙封口，置-20℃保存，使用時(shí)需化凍。AmpLB100mlLB培養(yǎng)液在臨高壓滅菌前加入1.5g103.4KPa20min養(yǎng)基，并輕輕搖動(dòng)以使瓊脂均勻分布于整個(gè)培養(yǎng)基中。必須小心，此時(shí)培養(yǎng)基50℃(用手背碰一下Amp100ml10mg/mlAmp1100μg/ml，然后在超凈臺(tái)上鋪平板，90mm直徑的培養(yǎng)皿約需25ml培養(yǎng)基。Tris-HCl飽和酚(pH8.0) 將市售的苯酚置于65℃水浴中溶解，用空氣冷凝管進(jìn)行重蒸餾，當(dāng)溫度升高至183℃時(shí)開始收集于數(shù)個(gè)棕色瓶中(每瓶約200貯存于－20℃可保存數(shù)年使用前取一瓶重蒸酚于室溫放置一段時(shí)間后，移至65℃水浴融化(冰箱取出后勿立即放入65℃水浴中，以防玻璃炸)。融化后加8-羥基喹啉至終濃度為溶解混勻此時(shí)溶液呈黃色小心將酚倒入分液漏斗中。加入等體積的1mmol/L立即加蓋，劇烈振蕩并加入固體Tris搖勻(一般加1g固體Tris/100ml酚)靜置分層后從分液漏斗中放出下層黃色酚相，棄上層。將酚重新加至分液漏斗中，加入等體積的含0.2%β-巰基乙醇的0.1mol/L劇烈振蕩直至酚相將酚裝入棕色試劑瓶中，加入0.1倍酚體積的含0.2%β-巰基乙醇的0.1mol/LTris-HCl(pH8.0)覆蓋酚相，置4℃貯存?zhèn)溆?。由于酚重蒸和平衡費(fèi)時(shí)，操作有一定危險(xiǎn)，因此也可直接從試劑公司購(gòu)買Tris-HClTris-HCl6．溶液Ⅰ①0.1mol/L的Tris-HCl(pH8.0)母液Tris1.211mol/LHClpHml0.1mol/LTris-HCl(pH8.0)母液；②0.05mol/L的EDTA-Na2母液1.86g，加蒸餾水溶解，定容至100mlmol/L母液。Tris-HCl(pH8.0)50ml，EDTA-Na240ml1.98g6126.200ml50mmol/L葡萄糖，10mmol/mmol/LTris-HCl2mg/ml20min，4℃保存。溶液Ⅱ①10mol/L氫氧化鈉溶液稱取40g氫氧化鈉，加蒸餾水溶解，定容至100ml；②400mol/L氫氧化鈉溶液量取10mol/L氫氧化鈉溶液4ml，加蒸餾水定容至100ml；③20g/LSDS溶液稱取2gSDS，加蒸餾水溶解，定容至100ml；400mol/L20g/LSDS200mmol/Lg/L℃保存。溶液Ⅲ①5mol/L醋酸鉀溶液稱取49g醋酸鉀，加蒸餾水溶解，定容至100ml；5mol/L60ml(29.4g60ml)，冰醋酸11.5ml和雙蒸水28.5ml，混勻，即可得溶液Ⅲ，5mol/L醋酸鉀℃保存9．10 mg/ml RNase A 稱取RNase A 10 mg 溶于10 mmol/LTris-HCl(pH7.5)、15mmol/LNaCl10015minDNase，℃。如為Sigma需加熱煮沸。TE緩沖液(pH8.0)①1mol/LTris-HCl(pH8.0)溶液6.05g1mol/LHClpHml。②0.05mol/LEDTA-Na2(pH8.0)溶液1.86g5mol/LNaOHpH100ml。量取1mol/LTris-HCl(pH8.0)溶液2ml，0.05mmol/LEDTA-Na2(pH8.0)溶液4ml，加蒸餾水定容至200ml，使得樣品終濃度Tris-HCl(pH8.0)溶液為101mmol/L,103.4Kpa12020高壓蒸汽滅菌后，4℃保存。其他試劑氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇?！静僮鞑襟E】2mlLB(100μg/ml的試管中，37℃搖蕩培養(yǎng)過(guò)夜。1ml1.5mlEP000r/min2100μl5min。100μl5次，溶液變透明，粘稠。100μl，顛倒混勻，溶液出現(xiàn)白色沉淀。6．12000r/min2minEP管中。21010minDNA12000r/min5min，棄乙醇。70乙醇洗滌沉淀（5次，小心不讓沉淀脫落，120005min，棄乙醇，室溫下靜置使乙醇揮發(fā)或真空干燥。50μl含RNaseA的TE緩沖液溶解DNA20min20℃冰箱?！咀⒁馐马?xiàng)】21天晚上進(jìn)行單菌落液體培養(yǎng)min(用移液嘴沾吸沒(méi)有絲狀物出現(xiàn))是否正確。溶液Ⅰ中的溶菌酶宜臨用前加入。溶液Ⅱ也應(yīng)臨用前用母液配制。1~3注意分清哪一步棄上清，哪一步留上清。DNA不被限制性內(nèi)切酶切割。加入溶液Ⅰ時(shí)可用力振蕩，而加入溶液Ⅱ5min后，如溶液不變粘稠(移液嘴沾吸沒(méi)有絲狀物出現(xiàn))，則應(yīng)終止實(shí)驗(yàn)。檢查使用的試劑是否正確，加量是否正確。溶液Ⅰ和溶液Ⅲ要冰預(yù)冷，溶液Ⅱ要新鮮配制。加入溶液Ⅱ時(shí)禁止渦旋振蕩（DNA斷裂10minDNA。實(shí)驗(yàn)十 DNA的限制性內(nèi)切酶酶切分析【原理】限制性內(nèi)切酶(restrictionendonuclease，RE)是由細(xì)菌自己產(chǎn)生的能識(shí)別雙DNA分子中的特定堿基順序，并以內(nèi)切方式水解核酸中的磷酸二酯鍵的核REDNA的特異順序，并在這個(gè)順序內(nèi)進(jìn)行切割。它是基因工程中剪切DNARE酶切位點(diǎn)的改變，故當(dāng)用一定RE切割時(shí)，其切開的片段(分子量)DNA限制性圖譜發(fā)生改變，據(jù)此可達(dá)到基因診斷的目的。EcoRⅠ(λDNARE21226bp，7421bp，5804bp，5604bp，4878bp3530bp片段。本實(shí)驗(yàn)是將實(shí)驗(yàn)十一制備的人Bcl-2重組質(zhì)粒DNA作為EcoRBcl-2EcoRpBluescriptⅡKS(-)EcoRⅠ單酶切Bcl-2cDNA4pUC19質(zhì)粒衍生2961bppBluescriptⅡKS(-)載體(2.96kb)Bcl-2cDNA(1.9kb)＋pBS-Bcl-2(4.86kb)

pBS(2.96kb) Bcl-2(1.9kb)EcoEcoRⅠ酶Bcl-2重組質(zhì)粒的酶切模式圖【試劑】DNA底物λDNADNAEcoRBcl-2DNA。EcoRⅠ及其緩沖液只需購(gòu)買國(guó)內(nèi)試劑公司的產(chǎn)品即可RE2RE100%酶切活性。3．50×TAE電泳緩沖液取Tris24.2g，冰醋酸5.7ml，0.25mol/L(pH8.0)20ml100ml1×TAE為配制瓊脂糖凝膠及其電泳的應(yīng)用緩沖液。SYBR?GreenI熒光染料工作液的配制10000×SYBR?Green I 熒光染料原液，用TE 溶液稀釋成20×或30×SYBR?GreenI熒光染料工作液。詳見實(shí)驗(yàn)八。SYBR?GreenI6×loadingdyebuffer的配制20×30×SYBR?GreenI10ul6×loadingbuffer10uSYBGreenIdyebuffer20ul。詳見實(shí)驗(yàn)九。DNA0.5μg/μl?！静僮鞑襟E】11μ(10×buffer2μ20EcoRⅠ2μl，λDNA(2μg)DNA(2μg)DNA5μl(2μg)，加至200ulEP20μl，加蓋，混勻后稍離心，371h制備瓊脂糖凝膠按照被分離DNA含量，見表。表瓊脂糖凝膠濃度與分辨DNA大小范圍的關(guān)系凝膠中的瓊脂糖含量[%(w/v)] 線性DNA分子的有效分離范圍0.3 5～600.6 1～200.7 0.8～100.9 0.5～71.2 0.4～61.5 0.2～32.0 0.1～20.48g1×TAE60ml至完全熔化，取出搖勻。灌膠取潔凈的電泳內(nèi)槽(又稱托盤)，用透明膠帶將內(nèi)槽的兩端邊緣封好(定要封嚴(yán)，不能留縫隙)。將內(nèi)槽放置于一水平臺(tái)面，并插好所需齒數(shù)和厚度的樣品梳子。60內(nèi)槽，直至所需厚度，注意不要形成氣泡，特別是梳子下，如有氣泡可用牙簽挑破。泳槽中，注意凝膠點(diǎn)樣端要靠近負(fù)極。加入1×TAE緩沖液至電泳槽，緩沖液剛沒(méi)過(guò)凝膠表面即可。4．加樣取6×3μlEP15μl樣。另外，每排孔需加一份DNAMake做對(duì)照（DNAMaker3μl1μl混勻,將其加入凝膠的點(diǎn)樣孔即可。電泳接通電源槽與電泳儀的電源(片段是從負(fù)極向正極移動(dòng))。DNA5V/cm1～2cm處，切斷電源，停止電泳。存在處應(yīng)DNA帶的泳動(dòng)位置。3.5英寸磁盤,便于在電腦下觀察。【注意事項(xiàng)】本實(shí)驗(yàn)可先進(jìn)行酶切反應(yīng)，酶切過(guò)程等時(shí)間的間隙灌好瓊脂糖凝膠。DNA酶切時(shí)，要在其最適溫度下(37℃)進(jìn)行。最好是用2種酶酶切應(yīng)先用低鹽緩TE400μl，再進(jìn)行酚乙醇沉淀，重新建立第二個(gè)酶切反應(yīng)體系。RE一定要在低溫(－20℃)50%20℃，應(yīng)避免結(jié)冰。新購(gòu)的大包裝酶，RE管放在冰盒內(nèi)，用完后立即放在－20℃，每tip，避免污染。RE1URE37℃條件下作用DNA1h1μgDNA2～3DNA尤其如此。DNADNADNADNA實(shí)驗(yàn)十一 RT-PCR法釣取小鼠肝臟β-actin基因一、TRizol試劑提取小鼠肝臟總RNA【原理】TrizolRNA抽提試劑，內(nèi)含異硫氰酸胍等物質(zhì)，能在迅速RNA的完整性。Trizol既用于小量樣品50-100mg5106細(xì)胞，也可用于大量樣品1g組織/≥107細(xì)胞?？赏瑫r(shí)