乳酸菌的分離和初步鑒定

乳酸菌的分離和初步鑒定劉海音張超（長春師范學(xué)院生物系，長春，130032）摘要：本文采用BCG牛乳培養(yǎng)基瓊脂平板篩選乳酸菌，經(jīng)過連續(xù)6次以上的傳代，以達(dá)到分離提純，鏡檢時(shí)觀察到鏈球狀和桿狀兩種形狀。為了鑒定分離出的菌種，做了一系列的生理生化反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，如吲哚試驗(yàn)的反應(yīng)結(jié)果為陰性，糖發(fā)酵試驗(yàn)的反應(yīng)結(jié)果為陽性。此外還進(jìn)一步做了小型發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，檢測出了乳酸的存在⑴。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合乳酸菌的特征，從而證實(shí)該分離出的菌種為乳酸菌，桿狀的叫做短乳桿菌，鏈球狀的叫做乳鏈球菌。關(guān)鍵詞：乳酸菌分離鑒定乳酸菌為一群可發(fā)酵碳水化合物以獲取能量，并生成大量乳酸的一類細(xì)菌的總稱。利用發(fā)酵技術(shù)保藏食品，最典型的是通過乳酸菌的發(fā)酵。這在發(fā)酵乳工業(yè)中已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用。利用天然的或經(jīng)篩選的乳酸菌發(fā)酵，已經(jīng)生產(chǎn)出多種不同類型的發(fā)酵乳。因而分離和鑒定乳酸菌對人類的生產(chǎn)和生活都具有非常重要的意義。本報(bào)告采用BCG牛乳培養(yǎng)基瓊脂平板篩選和分離乳酸菌，利用鏡檢觀察到了鏈球狀和桿狀兩種形狀。通過吲哚試驗(yàn)和糖發(fā)酵試驗(yàn)以及小型發(fā)酵實(shí)驗(yàn)證明該菌種為乳酸菌，桿狀的叫做短乳桿菌，鏈球狀的叫做乳鏈球菌材料和方法1.1材料選用沈陽乳業(yè)有限責(zé)任公司乳品一廠生產(chǎn)的輝山純酸奶培養(yǎng)基BCG牛乳培養(yǎng)基A（溶液）：脫脂奶粉100g,水500ml,加入1.6%漠甲酚綠（B.C.G）乙醇溶液1ml,80攝氏度滅菌20min.B（溶液）：酵母膏10g,水500ml,瓊脂20g,PH:6.8121攝氏度滅菌20min以無菌操作趁熱將A,B溶液混合均勻后倒平板。乳酸菌培養(yǎng)基牛肉膏5g,酵母膏5g,蛋白胨10g，葡萄糖10g,乳糖5g,氯化鈉5g,水1000ml,PH:6.8121攝氏度濕熱滅菌20min蛋白胨水培養(yǎng)基蛋白胨10g,氯化鈉5g,水1000ml,PH:7.2?7.4121攝氏度濕熱滅菌20min糖發(fā)酵培養(yǎng)基蛋白胨水培養(yǎng)基1000ml,1.6%漠甲酚紫乙醇溶液1?2ml,PH:7.6,另配20%糖溶液(葡萄糖，蔗糖)各10ml.制法：.將上述含指示劑的蛋白胨水培養(yǎng)基(PH:7.6)分裝于試管中，在每管內(nèi)放一倒置的小玻璃管(Durhemtube)，使充滿培養(yǎng)液。.將已分裝好的蛋白胨水培養(yǎng)基和20%的各種糖溶液分別滅菌，蛋白胨水培養(yǎng)基121攝氏度滅菌20min，糖溶液112攝氏度滅菌30min..滅菌后，每管以無菌操作分別加入20%的糖溶液0.5ml,則成1%的濃度。1.1.3有關(guān)溶液1.6%漠甲酚紫乙醇溶液：漠甲酚紫1.6g溶于100ml乙醇中，貯存于棕色瓶中保存?zhèn)溆?。吲哚試劑：對二甲基氨基苯甲?g,95%乙醇760ml,濃鹽酸160ml.10%硫酸2%高錳酸鉀含氨的硝酸鹽溶液：稱取硝酸銀2g,蒸餾水100ml,待硝酸銀溶解后，取出10ml備用，向其余的90ml硝酸銀中滴加氨水，即可形成很厚的沉淀，繼續(xù)滴加氨水至沉淀剛剛?cè)芙獬蔀槌吻迦芤簽橹梗賹溆玫南跛徙y慢慢滴入，則溶液出現(xiàn)薄霧，但輕輕搖動(dòng)后，薄霧狀的沉淀又消失，繼續(xù)滴入硝酸銀，直到搖動(dòng)后仍呈現(xiàn)輕微而穩(wěn)定的薄霧狀沉淀為止。1.2方法1.2.1乳酸菌的分離提純直接用接種環(huán)蘸取純酸奶平板劃線分離，置40攝氏度培養(yǎng)48小時(shí)。挑選出乳酸菌進(jìn)行連續(xù)6次以上的傳代，以達(dá)到提純。1.2.2乳酸菌的鑒定吲哚試驗(yàn).試管標(biāo)記：取裝有蛋白胨水培養(yǎng)基的試管2支，分別標(biāo)記乳酸菌和空白對照。.接種培養(yǎng)：以無菌操作分別接種少量菌苔到標(biāo)記乳酸菌的試管中，標(biāo)記有空白對照的不接種，置37攝氏度恒溫箱中培養(yǎng)24?48小時(shí)。.觀察記錄：在培養(yǎng)基中加入乙醚1~2ml,經(jīng)充分振蕩，使吲哚萃取至乙醚中，靜置片刻后乙醚層浮于培養(yǎng)液的上面，此時(shí)沿管壁緩慢加入5~10滴吲哚試劑，如有吲哚存在，乙醚層呈玫瑰色，此為吲哚試驗(yàn)陽性反應(yīng)，否則為陰性反應(yīng)。糖發(fā)酵試驗(yàn).試管標(biāo)記：取分別裝有葡萄糖，蔗糖發(fā)酵培養(yǎng)液試管各2支，每種糖發(fā)酵試管中分別標(biāo)記乳酸菌和空白對照。.接種培養(yǎng)：以無菌操作分別接種少量菌苔至以上各相應(yīng)試管中，每種糖發(fā)酵培養(yǎng)液的空白對照均不接菌。將裝有培養(yǎng)液的杜氏小管倒置試管中，置37攝氏度恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，觀察結(jié)果。.觀察記錄：與對照管比較，若接種培養(yǎng)液保持原由顏色，其反映結(jié)果為陰性；如果培養(yǎng)液呈黃色，反映結(jié)果為陽性。培養(yǎng)液中的杜氏小管內(nèi)有氣泡為陽性反應(yīng)，杜氏小管內(nèi)沒有氣泡為陰性反應(yīng)。

1.2.3乳酸的檢測選用已經(jīng)分離的菌種做小型發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，取發(fā)酵液的上清液約10ml于試管中，加入10%硫酸1ml,再加2%高錳酸鉀1ml,此時(shí)乳酸轉(zhuǎn)化為乙醛，把事先在含氨的硝酸銀溶液中侵泡的濾紙條搭在試管口中，微火加熱試管至沸，觀察濾紙變化。結(jié)果和分析2.1乳酸菌的分離提純在平板上出現(xiàn)了圓形稍扁平的黃色菌落，周圍培養(yǎng)基變?yōu)辄S色，初步定為乳酸菌⑴，取出少量在顯微鏡下觀察到了鏈球狀和桿狀兩種形狀（如圖一）（圖一）量在顯微鏡下觀察到了鏈球狀和桿狀兩種形狀（如圖一）（圖一）2.2 乳酸菌的鑒定該菌種的菌落為圓形稍扁平的黃色菌落，有桿狀和鏈球狀兩種形狀。在吲哚試驗(yàn)中，加入菌種的試管無任何變化，證明為陰性反應(yīng)（如圖二）。（圖二）中，加入菌種的試管無任何變化，證明為陰性反應(yīng)（如圖二）。（圖二）說明該菌不具有分解色氨酸產(chǎn)生吲哚的能力。也說明此菌種不是大腸桿菌，因?yàn)榇竽c桿菌的吲哚試驗(yàn)證明為陽性。在糖發(fā)酵試驗(yàn)中，在加入葡萄糖的發(fā)酵培養(yǎng)液中加入菌種后，培養(yǎng)液變?yōu)辄S色，反應(yīng)結(jié)果為陽性，且杜氏小管內(nèi)無氣泡（如圖三）;（圖三）加入蔗糖的發(fā)酵培養(yǎng)液中加入菌種后的反應(yīng)結(jié)果也為陽性且杜氏小管內(nèi)無氣泡（如圖四）。（圖四）養(yǎng)液變?yōu)辄S色，反應(yīng)結(jié)果為陽性，且杜氏小管內(nèi)無氣泡（如圖三）;（圖三）加入蔗糖的發(fā)酵培養(yǎng)液中加入菌種后的反應(yīng)結(jié)果也為陽性且杜氏小管內(nèi)無氣泡（如圖四）。（圖四）證明該菌種能分解葡萄糖和蔗糖而產(chǎn)酸。杜氏小管內(nèi)沒有氣泡，說明該菌種分解糖后不產(chǎn)氣。也證明此菌種不是大腸桿菌，因?yàn)槿绻谴竽c桿菌除了產(chǎn)酸反應(yīng)結(jié)果為陽性外，而且杜氏小管內(nèi)會(huì)有氣泡，因?yàn)榇竽c桿菌具有分解葡萄糖和蔗糖產(chǎn)酸并產(chǎn)氣的能力。為了進(jìn)一步鑒定該菌種，還做了小型發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，通過濾紙條變黑，說明有乳酸存在（如圖五）

（圖五）（圖五）因?yàn)樵诎l(fā)酵液的上清液中加入10%硫酸1ml和2%高錳酸鉀1ml后，此時(shí)上清液中的乳酸轉(zhuǎn)化為乙醛，加熱后使乙醛揮發(fā)，因此使濾紙條變黑⑴。以上種種特征均符合乳酸菌的特征。桿狀的即為乳酸菌中的短乳桿菌，鏈球狀的即為乳酸菌中的乳鏈球菌。3.討論通過對菌落特征，菌體細(xì)胞形態(tài)以及該菌的生理生化反應(yīng)實(shí)驗(yàn)和運(yùn)用該菌種做小型發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了該菌種為乳酸菌。桿狀的即為短乳桿菌，鏈球狀的即為乳鏈球菌。實(shí)驗(yàn)證明：用BCG牛乳瓊脂培養(yǎng)基易于得到乳酸菌。為了高效分離篩選乳酸菌，應(yīng)該注意挑取具有典型特征的黃色菌落。另外，在吲哚試驗(yàn)中，為了保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，在加入吲哚試劑后切勿搖動(dòng)試管，這樣乙醚層就不至于被破壞。在糖發(fā)酵試驗(yàn)中，應(yīng)該在滅菌時(shí)適當(dāng)延長煮沸時(shí)間，這樣可以防止倒置杜氏小管內(nèi)有殘留氣泡。注意了上述幾點(diǎn)有利于實(shí)驗(yàn)的成功性。此外隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，對菌種的鑒定也逐漸應(yīng)用了分子生物學(xué)手段，但由于本實(shí)驗(yàn)室條件有限，不能做這個(gè)方面的實(shí)驗(yàn)。如有條件，可以做測定DNA的G+C含量，限制性片段長度多態(tài)性分析（RFLP）,隨機(jī)擴(kuò)增DNA多態(tài)性分析（RAPD）等等，這樣就能更精確地鑒定該菌種。參考文獻(xiàn)（1）