課題需要交東西基于微流控芯片技術(shù)水紅花子有效組分對(duì)

摘 .-1...............................................................................................................-3前言6-正文8-第一章抗腫瘤藥物篩選微流控的設(shè)計(jì)和制作.........................................-8材料與方法8-實(shí)驗(yàn)材料8實(shí)驗(yàn)方法9總結(jié)......................................................................................................-16第二章基于微流控的水紅花子有效組分抗肝癌作用研究...................-17HepG217-常規(guī)培養(yǎng)..............................................................................................-17-細(xì)胞培養(yǎng)的預(yù)處理18-細(xì)胞在中的培養(yǎng)和檢測(cè).......................................................-18水紅花子有效組分對(duì)中細(xì)胞的影響............................................-19水紅花子有效組分供試品溶液的.................................................-19HepG219-討論......................................................................................................-22分析討論............................................................................................................-24-結(jié)論26-參考文獻(xiàn)............................................................................................................-28-致謝30-個(gè)人簡(jiǎn)歷............................................................................................................-31-長(zhǎng)期培養(yǎng)，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，其形態(tài)與常規(guī)培養(yǎng)的細(xì)胞沒(méi)有明顯差別，經(jīng)LIVE/DEAD72h97%集成有微閥結(jié)構(gòu)的微流控微閥控制系統(tǒng)下的液閥在72h的閉合過(guò)程中保持了良好的壓力穩(wěn)定性，能夠維持對(duì)溶液長(zhǎng)時(shí)間、大面積的效果，72h后微閥可順利開啟，表明液閥具有良好的回彈力與靈敏度。集成化配伍篩選多功能微流控微泵微閥驅(qū)動(dòng)控制系統(tǒng)對(duì)氣動(dòng)微泵微閥具便，功能全面，其各項(xiàng)指令能正確通過(guò)裝置作用于。結(jié)論：流控和一種集成化配伍篩選多功能微流控以及相應(yīng)的環(huán)境和流體控制初步進(jìn)行了基于微流控技術(shù)的中紅花子中有效組分對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的凋亡壞死作用研究并證明了實(shí)驗(yàn)自主構(gòu)建的微流控系統(tǒng)具有良好的HepG2HepG2Thebackgroundofthestudyisbasedonmicrofluidictechnology.Designedandfabricatedthemicrofluidicchipforanti-tumordrugscreening,andconstructedthematchingenvironmentalcontrollingandmicro-fluiddrivingcontrolsystemwithproprietaryinlectualpropertyrights，anduseittocompletetheapoptoticeffectofPolygonumorientaleeffectivecomponentofhepatocellularcarcinomaHepG2cells.Wecomparedtheresultsgottotheformerpesticideeffectsgotfromtraditionalinvitroexperimentstotesttheaccuracyoftheexperimentsoperatedinchipsandtoverifytheapplicabilityfordrugscreening.Throughtheresearchwe’dliketoprovideatheoreticalbasisfortheapplicationandpopularizationofmicrofluidictechnologyinthefieldofresearchinganddevelonewdrugsoftraditionalChinesemedicineinanti-tumor,toprovideanewideaandmethodfortherapidscreeningandresearchingofanti-tumordrugs,especiallythetraditionalChineseMedicineinourcountry,andplayapositiveroleinexploringtheoriginalinnovationandintegratedapplicationofthekeytechnologyresearchanddevelopmentofnewdrugsinChina.MaterialandUseakindofmicrofluidicchipthatcontainedtheconcentrationgradientstructurewhichwe’dliketoapplyitsautomaticgeneratefunctiontodrugscreening.Manufacturedandoptimizedtheenvironmentcontrolsystemmatchingwiththechip.Testifiedthepropertyofthesystemandchipbythelong-timecellcultureanddetecteditsmerisisstatus.Useakindofmicrofluidicchipthatcontainedthemicro-valvewhichisflexibleandcontrollablethatcanswitchdifferentfunctionswhenscreeningthedrugs.Testifiedthelong-timeclosedability,thestabilityofthepressureandtheelasticityforthehydraulicvalvesandthesystemtoensuretheirproperties.UsethechiptocompletetheapoptoticeffectofPolygonumorientaleeffectivecomponentofhepatocellularcarcinomaHepG2cellsandcomparedtheresultswiththeformerdatagotfromthetraditionalexperimentsinvitro.Constructedakindofmicrofluidicchipthatintegratedwiththeconcentrationgradientstructure,akindofmicrofluidicchipintegratedwithmicro-valvesandanintegratedmicrofluidicchipforthescreeningandcompatibilityof intraditionalChinesemedicines,andthematchedenvironmentalcontrolandfluidcontrolsystem,whichprovideaplatformforanti-tumordrugscreening.Themicro-chipcellculturesystemcanprovideasuitableenvironmentforcells,themicro-valvecontrolsystemcanprovideastablepressureforthehydraulicvalvesandthepaticvalves,whichallhaveagoodelasticity.Theautomaticprogramcontrolman-machineinterfacehasasensitiveresponse.Thesystemscanprovidepowerfulsupportforcellresearchanddrugscreening,layasolidfoundationforthedevelopmentofthelaterexperiments.WedidtheinitialresearchontheapoptosisandnecrosisfunctionoftheingredientsinSWGTtowardsHepG2cellsinmicrofluidicchipsandtheresultsshowthatthemicrofluidicbasedsystemconstructedourselvesgaveagoodapplicability,whichprovideanewtrainofthoughtandmethodforanti-tumordrugscreening.TheeffectivecomponentsofPolygonumorientalehasasignificantapoptoticeffecttoHepG2cells,andwecomparedtheexperimentalresultsfromthemicrofluidictechwiththetraditionalexperimentsinvitro.Constructedakindofmicrofluidicchipthatintegratedwiththeconcentrationgradientstructure,akindofmicrofluidicchipintegratedwithmicro-valvesandanintegratedmicrofluidicchipforthescreeningandcompatibilityof intraditionalChinesemedicines,whichprovideaplatformforanti-tumordrugThemicro-chipcellculturesystemcanprovideasuitableenvironmentforcells,themicro-valvecontrolsystemcanprovideastablepressureforthehydraulicvalvesandthepaticvalves,whichallhaveagoodelasticity.Theautomaticprogramcontrolman-machineinterfacehasasensitiveresponse.Thesystemscanprovidepowerfulsupportforcellresearchanddrugscreening,layasolidfoundationforthedevelopmentofthelaterexperiments.WedidainitialresearchontheapoptosisandnecrosisfunctionoftheeffectivecomponentsinPolygonumorientaletowardsHepG2cellsinmicrofluidicchipsandtheresultsshowthatthemicrofluidicbasedsystemconstructedourselvesgaveagoodapplicability,whichprovideanewtrainofthoughtandmethodforanti-tumordrugKeyword：microfluidic;cellculture;PolygonumorientaleL.;drugscreening;LiverTumorCellsHepG2當(dāng)前許多發(fā)達(dá)國(guó)家已把現(xiàn)代科學(xué)儀器當(dāng)做信息社會(huì)的和基礎(chǔ)納入未來(lái)發(fā)展的重點(diǎn),而分析儀器又是其中最重要的組成部分之一最近,人類組計(jì)劃的提前完成充分說(shuō)明了先進(jìn)的分析儀器與技術(shù)在現(xiàn)代高科技發(fā)展中的重要甚至關(guān)鍵作用著21世紀(jì)科技發(fā)展中眾多,分析儀器和分析科學(xué)也正經(jīng)歷著深刻的,其中一個(gè)日益明顯的發(fā)展趨勢(shì)就是化學(xué)分析設(shè)備的帶有性的重要轉(zhuǎn)折時(shí)期在當(dāng)前發(fā)展較快的微分析系統(tǒng)中,以1990年由的n和idmr首先“微全分析系統(tǒng)”(icroTotalyisSytem,即μTS)和目前較多的“生物”(iochip)或稱“微陣列(icrorryhips)的發(fā)展勢(shì)頭最為猛烈在μTS中,微流控系統(tǒng)(icrofluidichipytems)也通俗地稱“建在上的(bonahip)或簡(jiǎn)稱(bhip),正處于當(dāng)前發(fā)展的前沿,也最具廣闊的發(fā)展前景。上世紀(jì)90年代初，Manz等首次提出微流控技術(shù)（Microfluidics），又試劑消耗低、分析速度快、高通量輸出、多指標(biāo)檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)，微流控能克服理論,應(yīng)用水紅花子組方治療肌瘤、囊腫且獲得很好的效果。現(xiàn)代臨床應(yīng)用用于治療性肝癌,以水紅花配伍石見穿、三棱、莪術(shù)子與其他藥物配伍的臨床新用途還有：治療肝硬化（代償期）總有效率、紅花子中藥復(fù)方為主要方式的有5]：治療性肝癌、對(duì)肝癌的預(yù)防和治療治療肝癌尤其是近年來(lái)年運(yùn)用中治療肝癌,以活血理氣、消瘤、化瘀為主，組方“化瘀消瘤湯”,將赤芍、水紅花子藥材等煎湯用于中晚期肝癌患者,30例中,大多數(shù)的癥狀都有大小不同的改善,8人生存率達(dá)到一年,其中一人經(jīng)過(guò)服藥，延長(zhǎng)了6年多的 ，而且癥狀完全。、第一章抗腫瘤藥物篩選微流控的設(shè)計(jì)和制。部分，因此對(duì)承載有不同功能的進(jìn)行構(gòu)建顯得尤為重要的構(gòu)建實(shí)際上同時(shí)采用一定的技術(shù)方法將其制作出來(lái)并應(yīng)用于研究的設(shè)計(jì)和制作是構(gòu)建容即為對(duì)抗腫瘤藥物篩選微流控細(xì)胞進(jìn)行構(gòu)建，結(jié)合制圖軟件AUTOCAD。材料與方實(shí)驗(yàn)TG2U型光刻機(jī)（科技）；SC-1B型勻膠機(jī)（創(chuàng)世威納科技）；BP-2B型烘膠臺(tái)（創(chuàng)世威納科技）；XMTD-808P程序溫控儀（余姚江溫度儀表廠）；HC5002型電子天平（慈溪市衡器實(shí)業(yè)）；SZX9型體式顯微鏡（Olympus公司）；HPDC-32G-2型等離子機(jī)（HarrickPlasma公司）；真空干燥箱（一恒科學(xué)儀器）；Milli-Q超純水處理裝置（Millipore公司）。顯影液（Micro-Chem公司）；Sylgard184型聚二甲基硅氧烷PDMS和劑（DowCorning公司）實(shí)驗(yàn)集成有濃度梯度結(jié)構(gòu)微流控的設(shè)計(jì)與制微流控細(xì)胞培養(yǎng)是藥物篩選實(shí)驗(yàn)的前提和基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)腔的設(shè)計(jì)是芯片整體構(gòu)建中十分重要的一環(huán)。現(xiàn)如今，微流控所用的細(xì)胞培養(yǎng)腔大多為圓1-1所示。1-1圓形培養(yǎng)腔（A)和橢圓形培養(yǎng)腔（B）絡(luò)結(jié)構(gòu)是實(shí)現(xiàn)微流體的關(guān)鍵環(huán)節(jié)傳統(tǒng)的微流控在微通道的轉(zhuǎn)折處一般1-2所示。1-2直拐點(diǎn)微通道（A）和弧形拐點(diǎn)微通道（B）濃度梯度作為微流控的一種經(jīng)典結(jié)構(gòu)，自問(wèn)世以來(lái)一直受到廣泛的推崇現(xiàn)已成為藥物篩選中應(yīng)用最普遍的結(jié)構(gòu)之一這“圣誕樹形狀的結(jié)構(gòu)有很多獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)首先依賴不同的濃度并列使液體以層流的方式流動(dòng),流經(jīng)不同的網(wǎng)絡(luò)最終溶液“圣誕樹底部形成復(fù)雜而精確的濃度梯度其次網(wǎng)絡(luò)的設(shè)計(jì)具有很大的靈活性通過(guò)改變通道的長(zhǎng)度及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)型可以有不同的形態(tài)和空間構(gòu)型。控，旨在把該結(jié)構(gòu)的優(yōu)勢(shì)應(yīng)用于藥物篩選中。本實(shí)驗(yàn)采用AUTOCAD軟件繪制微流控的整體結(jié)構(gòu)，如圖1-3如下圖1-3集成有濃度梯度結(jié)構(gòu)的微流控結(jié)構(gòu)原理。8接且對(duì)稱的結(jié)構(gòu)并在銜接處設(shè)置若干出液口和彎曲結(jié)構(gòu)的流道整體分300μm流道寬度為200m；過(guò)渡區(qū)彎曲通道寬為20μm；細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)培養(yǎng)腔尺寸為11.2mm300μm。。SU-8負(fù)性光刻膠和PDMS為SU-8piranha（濃H2SO4：H2O2=3：1）中浸泡過(guò)夜，取出，分別用、無(wú)水乙醇和去離子水后，放在加熱板上150℃烘干20min使硅片脫水完全。之后將硅片置于勻2800rpmSU-840s10min，然后置于烘9530min進(jìn)行前烘。緩慢降至室溫后，將涂覆有光刻膠的硅片移至光刻機(jī)，與結(jié)構(gòu)圖形打印成的光刻掩膜接觸后以10-250mJ/cm2紫外輻射劑量對(duì)其2min，后的硅片95℃加熱約15min對(duì)（中烘SU-88min，90μm115℃環(huán)境下30min以完成堅(jiān)膜。PDMS微通道層制作將PDMS預(yù)聚物與劑按重量比10:1均勻混攪拌均勻后置于真空干燥箱中脫氣25min，然后澆鑄到SU-8陽(yáng)模板上，90℃的PDMS層。的鍵合：將待鍵合的玻璃基片與PDMS流體通道層依次用、無(wú)水乙醇和去離子水超聲10min后，將玻璃基片置于加熱板上150℃烘干20min使其脫水完全，PDMS放入90℃烘箱中脫水烘干30min，之后將玻璃基片和PDMS層的待鍵合面放入等離子機(jī)中進(jìn)行氧等離子處理，處理參數(shù)為：3min100W1.8pa200sccm，以完成鍵合[13]。集成有微閥結(jié)構(gòu)微流控的設(shè)計(jì)及制在對(duì)微流體進(jìn)行精確的過(guò)程中，微閥扮演著十分重要的角色。微閥是在啟閉以及流體流向的切換等。由于材料PDMS本身就具有彈性形變的特點(diǎn)，利用這一特點(diǎn)開發(fā)出的PDMS薄膜微閥（即利用薄膜上閥控通道的彈性形變來(lái)PDMS薄膜微閥的制動(dòng)壓要來(lái)源于正壓及通過(guò)對(duì)輸入壓力的11-4普通微閥通道（A）和寬窄不一的微閥通道（B）實(shí)驗(yàn)擬將寬窄不一的微閥結(jié)構(gòu)集成到微流控中，依靠微閥的靈活控制，來(lái)實(shí)現(xiàn)所需的各種功能，發(fā)揮的集成化優(yōu)勢(shì)。我們采用AUTOCAD軟件繪制微流控的整體結(jié)構(gòu)，如圖1-5所示：圖1-5集成有微閥結(jié)構(gòu)的微流控結(jié)構(gòu)示意200μm1×1.2mm，培養(yǎng)區(qū)下游彎曲流阻結(jié)構(gòu)寬度為150μm；微閥控制層由3條寬窄不一的液閥通道組成在需要閉合以實(shí)現(xiàn)開關(guān)作用的微閥處通道寬為400μm，在不需實(shí)現(xiàn)開關(guān)處通道寬為將設(shè)計(jì)好的圖形文件打印成光刻掩膜，然后以SU-8負(fù)性光刻膠和對(duì)集成有微閥結(jié)構(gòu)的微流控進(jìn)行制作，具體工藝步驟如下：SU-8硅片陽(yáng)模制作：將切割成合適大小的兩片單晶硅片放入piranha溶液（濃H2SO4：H2O2=3：1）浸泡過(guò)夜，取出，分別用、無(wú)水乙醇和去離子水后，放在加熱板上120℃烘干40min使硅片脫水完全。之后將硅片置于勻膠機(jī)上旋涂SU-840s3400rpm，2200rpm5min后置于烘膠臺(tái)上緩慢加熱9530min以進(jìn)行前烘。前烘后將陽(yáng)膜移至光刻機(jī)，與掩膜緊密貼合后以10-250mJ/cm2紫外輻射劑量分別2min和2.5min，后的硅片9515min對(duì)其進(jìn)行熱處理（中烘），冷卻至室溫后將兩硅片浸入顯影液6min8min2個(gè)11530min以完成堅(jiān)膜。PDMS微閥控制層制作：將PDMS預(yù)聚物與劑按重量比8:1均勻25minSU-8陽(yáng)模微閥控制層PDMS流體通道層制作：將PDMS預(yù)聚物與劑按重量比15:1均25minSU-8陽(yáng)模板上，以1000rpm旋涂，90℃15min，剝離得到PDMS流體通道層的鍵合：將從模板上剝離的兩層PDMS在顯微鏡下對(duì)準(zhǔn)貼合在一901h,利用兩層PDMS界面不同比例成分的熱擴(kuò)散和內(nèi)部反應(yīng)來(lái)完成兩層PDMS的鍵合。之后將雙層PDMS與干凈的玻璃一起放入等離子機(jī)中進(jìn)行氧等離子處理以完成的鍵合制作流程圖如下：圖1-6制作流程(a:SU-8硅片陽(yáng)膜；b：PDMS澆注；c：PDMS剝離；dPDMS熱鍵合；e：最終)微制作工藝分本實(shí)驗(yàn)選取了有機(jī)聚合物聚二甲基硅氧烷（PDMS）為制作的材料，相逆和重復(fù)變形而不發(fā)生永久性破壞，能用模塑法高保真地微流控本實(shí)驗(yàn)在制作PDMS層的時(shí)候使用模塑法，包括PDMS的混合、脫氣、澆注模板加熱切割打孔等步驟制作過(guò)程中分別涉及了單層及雙層PDMS的制作。在制作單層時(shí)一般將PDMS預(yù)聚物和劑按10:1的比例混于混合過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量氣泡，這些氣泡會(huì)對(duì)后的PDMS造成折射率的差25min脫氣完全后，將PDMS澆注在硅陽(yáng)膜上，90℃40min，冷卻后取下切割打孔即可。在制作雙層PDMS的時(shí)候，我們采用了熱鍵合的方式來(lái)鍵合兩層PDMS2種不同粘度的PDMS，分別對(duì)應(yīng)流體層和閥控層，兩層PDMS的組成分別為預(yù)聚物：劑=8:1及15:1。為了增強(qiáng)鍵合的牢固性，2種PDMS9015minPDMS層，相互之間的粘附力PDMS的對(duì)準(zhǔn)十分重將制作完成的PDMS層與玻璃片經(jīng)過(guò)氧等離子體的處理，PDMS的表面會(huì)應(yīng)，使表面層的部分-CH3/-CH2等基團(tuán)，并嵌入了一些-OH、-COOH等極性基團(tuán)，這些極性基團(tuán)的存在增加了PDMS表面的親水性能。經(jīng)氧等離子體處理的PDMS，能夠與玻璃發(fā)生永久鍵合，該鍵合步驟也是微流控制作過(guò)程中的最后一步，實(shí)驗(yàn)將玻璃基片和制作好的PDMS層進(jìn)行氧等離子處理，經(jīng)后藥物濃度梯度的表實(shí)驗(yàn)采用熒光素(M：376.27)進(jìn)行濃度梯度的表征實(shí)驗(yàn)。熒光片中，待液流穩(wěn)定后用熒光顯微鏡拍攝8個(gè)細(xì)胞緩沖區(qū)通道的熒光,專業(yè)圖像分析軟件Image-ProPlus6.0分析每個(gè)通道的光密度平均值（Densitymean）總AUTOCAD軟件，分別設(shè)計(jì)繪制了其他幾種抗腫第二章基于微流控的水紅花子有效組分抗肝癌作用水紅花子為蓼科植物紅蓼(PolygonumorientaleL.)的干燥成熟果實(shí)，具有散1.2.1微流控進(jìn)行水紅花子藥材中抗肝癌有效組分對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的凋亡壞肝癌HepG2細(xì)胞培常規(guī)培37℃水浴鍋中，順時(shí)針搖動(dòng)，使凍存管中的液體迅速解凍并融化。快速用75%的乙醇將管表面的液體擦拭干凈后放入高速離心機(jī)中，2000rpm/min離心3min2mL培養(yǎng)液吹打底部細(xì)胞直25mL的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，3mLDMEM高糖培養(yǎng)基，吹打均勻，將瓶蓋擰松一些后平置入細(xì)并匯合至80%-90%即可進(jìn)行傳代，吸取2mLPBS溶液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行，重復(fù)31.5mL0.25%胰酶-EDTA溶液消化細(xì)胞，在顯微鏡下觀察細(xì)胞，當(dāng)細(xì)1:334mL培養(yǎng)基混合細(xì)胞凍存:取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，棄去上層培養(yǎng)液，使用無(wú)菌PBS細(xì)胞3次，胰酶消化2min后，加入新鮮培養(yǎng)液停止消化，吹打均勻后移入凍存管放入離心機(jī)中2000rpm/min離心3min，棄去上層液體加入1mL凍存（現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)的預(yù)處將待用先用無(wú)菌水潤(rùn)洗，之后通入75%乙醇3遍，每遍5min，然后用無(wú)菌水沖洗數(shù)遍，烘干，紫外照射20min滅菌，之后通入0.1mg·mL-1的多聚L-賴氨酸(PLL)，于37℃下孵育1h，以對(duì)的細(xì)胞培養(yǎng)腔進(jìn)行包被處理，促進(jìn)細(xì)胞快速貼壁[16]，最后用無(wú)菌水將剩余PLL沖掉，烘干備用。荷發(fā)生吸附作用，使細(xì)胞貼壁加快。經(jīng)PLL處理的，細(xì)胞在3~3.5h內(nèi)即可貼壁完全，并且多聚賴氨酸沒(méi)性，不會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)[17]。細(xì)胞在中的培養(yǎng)和檢2000rpm/min3min，用培養(yǎng)液將細(xì)胞密度稀釋至5×105個(gè)/cm2，利用微量注射器將細(xì)胞注入中之后將片放入微流控細(xì)胞孵育平臺(tái)的孵育腔里，打開平臺(tái)裝置，調(diào)整好氣體濃度、環(huán)境溫度等參數(shù)進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，中的細(xì)胞用精密注射泵以0.2μL?min-124h拍照一次，IPP軟件對(duì)細(xì)胞圖像進(jìn)行計(jì)數(shù)分析，根據(jù)所得結(jié)果繪制人肝癌HepG2細(xì)胞在內(nèi)的生長(zhǎng)曲線以觀察和研究細(xì)胞生長(zhǎng)基本規(guī)律細(xì)胞在微流控中分別培養(yǎng)24h、48h、72h后，使用LIVE/DEAD對(duì)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)（死活試劑盒中包含兩種熒光探針，分別為鈣黃綠素-AM和乙錠二聚體-1（EthD-1），綠色熒光鈣黃綠素-AM可著染活細(xì)胞，發(fā)出強(qiáng)綠色熒光；EthD-1可著染死細(xì)胞，產(chǎn)生紅色熒光）LIVE/DEAD染液混勻后通入，避光染色30min，之后用PBS3次，使用倒置熒光顯微5個(gè)培養(yǎng)腔分別計(jì)數(shù)。細(xì)胞存活率為進(jìn)一步驗(yàn)證細(xì)胞孵育裝置中細(xì)胞的情況，我們用LIVE/DEAD染料分別對(duì)中培養(yǎng)了24h、48h、72h的細(xì)胞進(jìn)行了熒光染色，結(jié)果如圖2-1所分別為（96.3±2.8）%、（97.3±4.2）%和（97.8±3.8）%，說(shuō)明細(xì)胞在中生長(zhǎng)的良好，可用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。圖2-1中HepG2細(xì)胞LIVE/DEAD雙染熒光圖水紅花子有效組分對(duì)中細(xì)胞的影水紅花子有效組分供試品溶液50g500mL660%乙醇（300mL），3每次2h，合并濾液，揮干（水浴揮至無(wú)醇味），絹布過(guò)濾，濃縮成生藥0.4g/mLNaHCO4-HCl調(diào)節(jié)pH3-4HPD-300（樹95%乙醇浸泡，過(guò)夜，裝柱，同濃度乙醇沖洗數(shù)次，自來(lái)水沖洗至無(wú)醇味，60℃水浴揮干，放入干燥烘箱中，備用。水紅花子有效組分對(duì)HepG2細(xì)胞的影肝癌的發(fā)病機(jī)制與細(xì)胞增殖與凋亡的失衡有密切關(guān)系細(xì)胞凋亡是由調(diào)控的細(xì)胞程序性，凋亡時(shí)細(xì)胞膜會(huì)內(nèi)陷，細(xì)胞變圓、表面產(chǎn)生突起，與周圍紅花子有效組分對(duì)HepG2細(xì)胞的凋亡壞死影響實(shí)驗(yàn)中所用的微流控集成有Hoechst33342和碘化丙啶（PI）雙染法觀察中不同濃度待測(cè)藥物對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡壞死的影響。由于實(shí)驗(yàn)樣本量較大，導(dǎo)致到的熒光圖數(shù)量也比較多，圖2-2水紅花子Hoechst33342/PI雙染熒光檢測(cè)結(jié)果72h>48h>24h。由于正常細(xì)胞核著弱藍(lán)色熒光和弱紅色熒光導(dǎo)致其在縮放圖IPPHepG22-1所示。（/%（-1118與空白對(duì)照組比較討。章所優(yōu)化改進(jìn)的各局部結(jié)構(gòu)，并考慮到藥物篩選實(shí)驗(yàn)的實(shí)際需求濃度梯度18種不同的藥物濃。微流控在細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)的微流控細(xì)胞平臺(tái)。Forry等[20]通過(guò)控制微流控通道內(nèi)溶液的流暢度來(lái)養(yǎng)1周左右表等[21]將ITO透明導(dǎo)電玻璃與PDMS薄膜經(jīng)氧等離子體作用后共價(jià)結(jié)合成細(xì)胞培養(yǎng)。以ITO薄膜為發(fā)熱材料，通過(guò)電極連入外部溫度控制系動(dòng)小于0.5℃。以上研究表明了微流控系統(tǒng)在對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)外在條件控制的可且清除培養(yǎng)基中的廢物微流控所特有的灌流培養(yǎng)模式能很好的解決Hung等[22]設(shè)計(jì)了一種可以批量化培養(yǎng)細(xì)胞并進(jìn)行長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)的微流控。。此外，r等人[23]制作了一種多參數(shù)具有微生理機(jī)能測(cè)試功能的來(lái)檢測(cè)癌細(xì)胞的新陳代謝產(chǎn)物包含細(xì)胞培養(yǎng)腔流體區(qū)以及含有化學(xué)生T98G集稀釋的樣本來(lái)進(jìn)行檢同時(shí)還能對(duì)細(xì)胞代謝產(chǎn)物的多種指標(biāo)，如P，氧氣含量，葡萄糖消耗和乳酸的ng等[24]設(shè)計(jì)了具有5組平行濃度梯度網(wǎng)絡(luò)和30個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)池的微流控將細(xì)胞接種培養(yǎng)梯度濃度化學(xué)刺激標(biāo)記檢測(cè)等功能?，F(xiàn)階段微流 的發(fā)展?fàn)顟B(tài)和其未來(lái)展作為目前發(fā)展迅速的高新技術(shù)和多學(xué)科交叉研究前沿領(lǐng)域之一，微流控分析系統(tǒng)的出現(xiàn)使的微型化、集成化、自動(dòng)化和便攜化成為可能。目前，用于細(xì)胞培養(yǎng)藥物分析和篩選等的微流控分析技術(shù)正逐步成為人們關(guān)注和控的不斷涌現(xiàn)，其必將在藥物發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域扮演越來(lái)越重要的角色，微流控分析流控技術(shù)仍然存在很多問(wèn)題。如使用的操作技術(shù)和仍存在技術(shù)難度高、藥物篩選的實(shí)驗(yàn)處于早期研究開發(fā)階段尚未達(dá)到理想的商品化和通用化程度，能夠被普通藥物開發(fā)人員獲得并有效使用的產(chǎn)品并不多見。微流控技術(shù)要真正成為新一代藥物篩選有很長(zhǎng)的道路要走。微流控細(xì)胞孵育裝置中可提供良好的細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境，微流控微面積效果高通量藥物篩選微泵微閥控制及驅(qū)動(dòng)裝置對(duì)氣動(dòng)微泵微閥具有穩(wěn)功能全面，其各項(xiàng)指令能正確通過(guò)裝置作用于。綜上，本構(gòu)建的抗腫瘤藥物篩選微流控系統(tǒng)具有強(qiáng)大的功能與優(yōu)良的細(xì)胞研究適用性系統(tǒng)操作基于微流控技術(shù)的水紅花子有效組分對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的凋亡壞死作用結(jié)果表明：水紅花子有效組分對(duì)HepG2細(xì)胞有明顯的抑制作用，且這種應(yīng)及時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。同時(shí)所得結(jié)果與前期已完成的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果一致從而驗(yàn)證了本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的微流控及系統(tǒng)在藥物篩選實(shí)驗(yàn)方面的準(zhǔn)確ReyesDR，IossifidisD，AurouxPA，etal．Micrototalysissystems，IntroductiontheoryandChemistry2002742623-.柔肝湯治療肝硬化（代償期）31例臨床觀察.[J]中醫(yī),地,.方治療乙型性肝炎臨床觀察.[J]黑龍江中醫(yī)藥,2001.6：17-18.普陀膏并中藥治療性70例療效分析.[J]中西醫(yī)結(jié)合雜志,1990.10（12）：723.淺述中對(duì)肝癌的預(yù)防與治療.[J]中醫(yī)雜志.中治療腫瘤臨床進(jìn)展.[J],2004.8（3）：年.辨證治療中晚期肝癌的臨床觀