EASYspinPlus細(xì)菌RNA快速提取試劑盒操作方法及步驟說明書

htpp://杭州昊鑫生物科技股份有限公司htpp://EASYspinPlus細(xì)菌RNA快速提取試劑盒目錄號：RN43眨編號包裝單位RN430250次?：?適用范圍:適用于快速提取細(xì)菌總RNA，使用獨(dú)有基因組DNA清除柱技術(shù)確保有效清除gDNA殘留，不需要使用DNase消化，RNA可直接用于反轉(zhuǎn)錄PCR，熒光定量PCR.。?試劑盒組成、儲(chǔ)存、穩(wěn)定性：試劑盒組成保存50次TE(PH8.0)室溫6ml溶菌酶4c20mg裂解液RLTPlus室溫25ml去蛋白液RW1室溫40ml漂洗液RW室溫10ml一第一次使用前按說明加指定量乙醇70%乙醇室溫9mlRNase-freeHO2第一次使用前按說明加指定量乙醇RNase-freeHO室溫10ml基因組DNA清除柱和收集管RNase-free吸附柱RA和收集管室溫50套室溫50套本試劑盒在室溫儲(chǔ)存6個(gè)月不影響使用效果。

杭州昊鑫生物科技股份有限公司htpp://杭州昊鑫生物科技股份有限公司htpp://儲(chǔ)存事項(xiàng):.所有的溶液應(yīng)該是澄清的，如果環(huán)境溫度低時(shí)溶液可能形成沉淀，此時(shí)不應(yīng)該直接使用，可在37。。水浴加熱幾分鐘，即可恢復(fù)澄清。.不合適的儲(chǔ)存于低溫（4。?；蛘咭?0℃）會(huì)造成溶液沉淀，影響使用效果，因此運(yùn)輸和儲(chǔ)存均在室溫下（15℃—25℃）進(jìn)行。.避免試劑長時(shí)間暴露于空氣中產(chǎn)生揮發(fā)、氧化、PH值變化，各溶液使用后應(yīng)及時(shí)蓋緊蓋子。注意事項(xiàng)所有的離心步驟均在室溫完成，使用轉(zhuǎn)速可以達(dá)到13,000rpm的傳統(tǒng)臺式離心機(jī)，MEppendorf5415C或者類似離心機(jī)。樣品處理量絕對不要超過基因組吸附柱DA和和RNA吸附柱RA處理能力，否則造成DNA殘留或產(chǎn)量降低。開始摸索實(shí)驗(yàn)條件時(shí)，如果不清楚樣品DNA/RNA含量時(shí)寧可使用較少的樣品處理量，將來根據(jù)樣品試驗(yàn)情況增加或者減少處理量。裂解液RLTPlus和去蛋白液RW1中含有刺激性化合物，操作時(shí)戴乳膠手套，避免沾染皮膚，眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時(shí)，要用大量清水或者生理鹽水沖洗。關(guān)于DNA的微量殘留：一般說來任何總RNA提取試劑在提取過程中無法完全避免DNA的微量殘留（DNase消化也無法做到100%無殘留），本公司的EASYspinPlusRNA提取產(chǎn)品，由于采取了本公司獨(dú)特的緩沖體系和基因組DNA清除柱技術(shù)，絕大多數(shù)DNA已經(jīng)被清除，不需要DNase消化，可直接用于反轉(zhuǎn)錄PCR和熒光定量PCR。個(gè)別特殊情況如DNA含量過于豐富造成殘留或者要進(jìn)行嚴(yán)格的mRNA表達(dá)量分析熒光定量PCR,我們建議在進(jìn)行模板和引物的選擇時(shí)：選用跨內(nèi)含子的引物，以穿過mRNA中的連接區(qū)，這樣DNA就不能作為模板參與擴(kuò)

杭州昊鑫生物科技股份有限公司htpp://杭州昊鑫生物科技股份有限公司htpp://增反應(yīng)。選擇基因組DNA和cDNA上擴(kuò)增的產(chǎn)物大小不一樣的引物對。將RNA提取物用RNase-free的DNaseI處理。本試劑盒還可以用于DNaseI處理后的RNA清潔(cleanup),請聯(lián)系我們索取具體操作說明書。在步驟去蛋白液RW1漂洗前，直接在吸附柱RA上進(jìn)行DNaseI處理。請聯(lián)系我們索取具體操作說明書。RNA純度及濃度檢測：完整性：RNA可用普通瓊脂糖凝膠電泳(電泳條件：膠濃度1.2%；0.5XTBE電泳緩沖液；150v，15分鐘)檢測完整性。由于細(xì)胞中70%-80%的RNA為rRNA，電泳后UV下應(yīng)能看到非常明顯的rRNA條帶。動(dòng)物rRNA大小分別約為5kb和2kb，分別相當(dāng)于28S和18SrRNA。動(dòng)物RNA樣品中最大rRNA亮度應(yīng)為次大rRNA亮度的1.5-2.0倍，否則表示RNA樣品的降解。出現(xiàn)彌散片狀或條帶消失表明樣品嚴(yán)重降解。純度：OD260/OD280比值是衡量蛋白質(zhì)污染程度的參考指標(biāo)。高質(zhì)量的RNA，OD260/OD280讀數(shù)(10mMTris,pH7.5)在2.1-2.2之間(100%純的RNA比值一般是2.2左右，很多公司無法達(dá)到這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，所以1.9-2.0就湊合用了，但是我們的產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)一般可以達(dá)到2.1-2.2)。OD260/OD280讀數(shù)受測定所用溶液的pH值影響。同一個(gè)RNA樣品，假定在10mMTris，pH7.5溶液中測出的OD260/OD280讀數(shù)1.8-2.1之間，在水溶液中所測讀數(shù)則可能在1.5-1.9之間，但這并不表示RNA不純。濃度：取一定量的RNA提取物，用RNase-free水稀釋n倍，用RNase-free水將分光光度計(jì)調(diào)零，取稀釋液進(jìn)行OD260,OD280測定，按照以下公式進(jìn)行RNA濃度的計(jì)算：終濃度(ng/〃)l=(OD260)x(稀釋倍數(shù)n)x40杭州昊鑫生物科技股份有限公司 htpp://?：? 操作步驟：（實(shí)驗(yàn)前請先閱讀注意事項(xiàng)）提示：“第一次使用前請先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入指定量無水乙醇！“提取細(xì)菌RNA需先配制加了溶菌酶的TE（10mMTris-HCl，1mMEDTAPH8.0），TE中溶菌酶的終濃度為1mg/ml。離心收集1-2ml菌液（約108-109細(xì)胞）到一個(gè)1.5ml離心管，盡可能去除上清，注意殘留的上清不能超過20回。根據(jù)細(xì)胞的種類和數(shù)量，充分重懸細(xì)胞在100m（＜5x108細(xì)胞）/200m（5x108-7.5x108細(xì)胞）TE中（TE中需先加入溶菌酶，終濃度濃度為1mg/ml）或者直接用TE重懸后，用干凈槍頭挑取少許溶菌酶加入。室溫（15-25℃）溫育5分鐘/溶菌酶，破解細(xì)胞壁。每2分鐘渦旋振蕩10秒幫助破壁。注意各種細(xì)菌破壁的難易程度不一樣，一般革蘭氏陰性菌E.coli使用上面的條件就足夠了,甚至可能省略該步驟，但是某些革蘭氏陽性菌如B.subtilis難破壁需要提高溶菌酶濃度到15mg/ml和溫育時(shí)間到10分鐘。如果金黃色葡萄球菌需要加入lysostaphin到1mg/ml，37c溫育15分鐘?？傊煌?xì)菌類型破壁難易程度不同，有的難破壁的種類需要根據(jù)用戶自己的具體情況調(diào)節(jié)酶的種類、工作濃度和溫育溫度、時(shí)間，此外還可以聯(lián)合使用玻璃珠擊打，機(jī)械破壁，蛋白酶K消化等方法幫助破壁。短暫離心收集細(xì)胞到管底，吸棄上清。渦旋振蕩重懸分散細(xì)胞。加入500m裂解液RLTPlus,吹打混勻后用手劇烈振蕩20秒，充分裂解。一般加入裂解液后充分渦旋吹打后應(yīng)該見不到明顯團(tuán)塊或者不溶物，極少數(shù)情況下如果有明顯團(tuán)塊或者不溶物可以將裂解物13,000rpm離心3分鐘，沉淀不能裂解的碎片或者不溶物，取裂解物上清進(jìn)行下一步。

杭州昊鑫生物科技股份有限公司htpp://杭州昊鑫生物科技股份有限公司htpp://立刻將裂解物加入一個(gè)DNA清除柱上（清除柱放在收集管內(nèi)）13,000rpm離心60秒，保留濾過液（RNA在濾過液中）。確保離心后液體全部濾過去，膜上沒有殘留，如有必要，可以加大離心力和離心時(shí)間。用微量移液器較精確估計(jì)濾過液體積（通常為500回，濾過時(shí)候損失體積應(yīng)該減去），加入等體積的70%乙醇（請先檢查是否已加入無水乙醇!），此時(shí)可能出現(xiàn)沉淀，但是不影響提取過程,立即吹打混勻，不要離心。立刻將混合物（每次小于700或多可以分兩次加入）加入一個(gè)吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）13,000rpm離心60秒，棄掉廢液。加700m去蛋白液RW1，12,000rpm離心30秒，棄掉廢液。加入500m漂洗液RW（請先檢查是否已加入無水乙醇!），12,000rpm離心30秒，棄掉廢液。加入500m漂洗液RW重復(fù)一遍。將吸附柱RA放回空收集管中，13,000rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液，以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)。取出吸附柱區(qū)八，放入一個(gè)RNasefree離心管中，根據(jù)預(yù)期RNA產(chǎn)量在吸附膜的中間部位加30-50可RNasefreewater（事先在70-90℃水浴中加熱可提高產(chǎn)量），室溫放置1分鐘，12,000rpm離心