Western blot 實(shí)驗(yàn)介紹及流程

會(huì)計(jì)學(xué)1Westernblot實(shí)驗(yàn)介紹及流程Bio-rad垂直電泳、電轉(zhuǎn)裝置目的與要求

掌握垂直電泳、電轉(zhuǎn)的基本原理與操作步驟培訓(xùn)內(nèi)容

熟悉western-blot與SDS的基本原理與實(shí)驗(yàn)流程考核題目第1頁/共17頁電泳槽玻璃板、梳子、加樣校準(zhǔn)架等電轉(zhuǎn)移槽切膠板、黑白夾板、海綿墊等電泳儀

Bio-rad垂直電泳、電轉(zhuǎn)裝置用途：用于生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中對(duì)特定目的蛋白質(zhì)的分離，定性及定量的檢測(cè)分析，是Western-blot（蛋白免疫印跡）實(shí)驗(yàn)中非常重要的部分。

第2頁/共17頁Westernblot是利用已知的特異性抗體與抗原（即組織細(xì)胞中的目的蛋白）能特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記于結(jié)合后的特異性抗體上的顯示劑（如酶、金屬離子、同位素）顯示一定的顏色或發(fā)光來對(duì)組織細(xì)胞內(nèi)目的蛋白定性及半定量的研究。Westernblot實(shí)驗(yàn)原理抗原一抗生物素標(biāo)記的二抗ECL發(fā)光試劑第3頁/共17頁Westernblot檢測(cè)蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)流程提取總蛋白蛋白濃度測(cè)定SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳ECL檢測(cè)封閉二抗一抗洗滌洗滌掃描分析轉(zhuǎn)膜第4頁/共17頁

SDS電泳技術(shù)首先在1967年由Shapiro建立,1969年由Weber和Osborn進(jìn)一步完善。

SDS-聚丙烯酰胺（PAGE）凝膠電泳，是在PAGE凝膠中引進(jìn)SDS（十二烷基磺酸鈉，含有大量帶負(fù)電荷的SO32-），SDS能破壞蛋白質(zhì)分子的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)，在含有強(qiáng)還原劑的溶液中可與蛋白質(zhì)形成SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物（電泳樣品加入樣品緩沖液后,要在沸水中煮3-5分鐘）。由于結(jié)合大量帶負(fù)電荷的SDS，好比蛋白質(zhì)穿上帶負(fù)電的“外衣”，蛋白質(zhì)本身帶有的電荷則被掩蓋了，從而起到消除各蛋白質(zhì)分子之間自身的電荷差異的作用，蛋白質(zhì)在SDS膠中的遷移率主要取決于其分子量的大小。

SDS電泳的基本原理第5頁/共17頁1AproteinsampleissubjectedtoelectrophoresisonanSDS-polyacrylamidegel.Westernblot實(shí)驗(yàn)流程第6頁/共17頁SDS電泳操作步驟（1）配制分離膠

注意：邊配邊平搖燒杯混勻，配好膠后迅速灌膠（2）灌分離膠

灌膠之上輕輕加一層水或正丁醇液（3）配制濃縮膠

注意：邊配邊平搖燒杯混勻，配好膠后迅速用滴管灌膠（4）灌濃縮膠倒掉分離膠上的水或正丁醇之后，倒置吸凈殘留溶液，灌注濃縮膠，將梳子插好,膠凝固好后有膠條的國產(chǎn)槽需要去掉膠條（濃縮膠與分離膠一般比例為1：3）（5）加Tris-甘氨酸電泳緩沖液

足量（6）上樣

蛋白質(zhì)含量要適量，上樣總體積要適量（7）電泳

50V1h,100V2.5h，根據(jù)分子量的大小確定電壓和時(shí)間，一般溴酚藍(lán)離膠下１cm停止電泳，上槽接負(fù)極，下槽接正極

第7頁/共17頁第8頁/共17頁2Electroblottingtransferstheseparatedproteinsfromthegeltothesurfaceofanitrocellulosemembrane.Westernblot實(shí)驗(yàn)流程第9頁/共17頁（1）剝膠

用切膠板切去濃縮膠和多余的分離膠（2）準(zhǔn)備濾紙和硝酸纖維素膜切濾紙和膜時(shí)一定要戴手套，大小與膠一致

（3）浸泡濾紙、膜和海綿墊

用轉(zhuǎn)移液（含甲醇）浸泡，開門通風(fēng)（4）制備“三明治”制備每一層時(shí)注意趕氣泡（5）電轉(zhuǎn)

75V，1.5h，在冰浴中進(jìn)行，黑板對(duì)黑極（－），白板對(duì)白極（＋）電轉(zhuǎn)操作步驟第10頁/共17頁4Anantibodythatisspecificfortheproteinofinterest(theprimaryantibody-Ab1)isaddedtothenitrocellulosesheetandreactswiththeantigen.

Onlythebandcontainingtheproteinofinterestbindstheantibody,formingalayerofantibodymoleculesWesternblot實(shí)驗(yàn)流程一抗孵育：必須選擇可以抗抗原種屬的一抗。如做大鼠目的蛋白的檢測(cè)，則我們選擇的一抗可以是來自兔、人、小鼠的抗大鼠的抗體。一抗?jié)舛燃胺跤龝r(shí)間、溫度很重要。3Theblotisincubatedwithagenericprotein(suchasmilkproteinsorBSA)whichbindstoanyremainingstickyplacesonthenitrocellulose.第11頁/共17頁5Followingseveralrinsesforremovalofnon-specificallyboundAb1,theAb1-antigencomplexonthenitrocellulosesheetisincubatedwithasecondantibody(Ab2),whichspecificallyrecognizes

theFcdomainoftheprimaryantibodyandbindsit.Ab2isradioactivelylabeled,oriscovalentlylinkedtoareporterenzyme,whichallowstovisualizetheprotein-Ab1-Ab2complex.Westernblot實(shí)驗(yàn)流程

二抗孵育：二抗的選擇根據(jù)一抗的種屬來源，如：一抗是兔抗大鼠目的蛋白的抗體，則二抗應(yīng)選擇山羊或其他來源抗兔的抗體，而且二抗要標(biāo)記有同位素或酶。第12頁/共17頁Westernblot實(shí)驗(yàn)流程6ECLdetectionECLKitisbasedontheenzyme-linkedimmunodetectionofantigen-specificantibodyusinganti-IgGsecondaryantibodiesconjugatedtohorseradishperoxidase(HRP),whichreactswithachemiluminescentsubstrateinthepresenceofachemicalenhancer.ECL顯色：ECL試劑與過氧化物酶結(jié)合后發(fā)光后，可用儀器自動(dòng)檢測(cè)或在暗室內(nèi)用X-光片將其記錄下來。第13頁/共17頁Westernblot實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

c-fosactin62kD42kD將X-光片在凝膠圖像分析儀上進(jìn)行灰度掃描，比較目的蛋白與內(nèi)參照蛋白的灰度值，可得到蛋白表達(dá)半定量分析結(jié)果第14頁/共17頁考核題目1.Bio-rad垂直電泳、電轉(zhuǎn)裝置的主要用途是什么？2.Bio-rad垂直電泳、電轉(zhuǎn)裝置主要由哪幾部分構(gòu)成？3.