EO工程細(xì)胞培養(yǎng)方法和反應(yīng)器

EPO工程細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)方法和反應(yīng)器

馬佳鵬劉麗佳

70期生命科學(xué)與技術(shù)基地班沈陽藥科大學(xué)1紅細(xì)胞生成素(erythropoietin,EPO)

紅細(xì)胞生成素(erythropoietin,EPO)是一種糖蛋白,它是紅細(xì)胞發(fā)育成熟過程中的一種最重要的調(diào)節(jié)因子,它在治療腎衰引起的貧血中,顯示明顯的療效和很小的副作用;在糾正惡性腫瘤相關(guān)貧血、艾滋病引起的貧血和化療引起的貧血等方面,也顯示樂觀的前景;還可在手術(shù)前作為自體輸血,從而避免感染血源性疾病等等。因此EPO是很有前途的一種細(xì)胞因子

2rhEPO的工程細(xì)胞

rhEPO(人重組紅細(xì)胞生成素)

的工程細(xì)胞通常使用CHO細(xì)胞,因為CHO細(xì)胞是重組糖蛋白生產(chǎn)的首選體系,而rhEPO就是一種糖蛋白.CHO細(xì)胞是體壁依賴性細(xì)胞.3培養(yǎng)基微載體生物反應(yīng)器rhEPOrhEPO工程細(xì)胞CHO培養(yǎng)參數(shù)分泌產(chǎn)物分離純化4培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基無血清培養(yǎng)基5無血清培養(yǎng)基無血清培養(yǎng)基是在合成培養(yǎng)基內(nèi)加入不同種類的補(bǔ)充因子而替代PBS的培養(yǎng)基.它避免了血清培養(yǎng)基污染的可能性,并排除了批次間的差別還減少了純化的難度.但無血清培養(yǎng)基沒有廣泛的適應(yīng)性,不同的細(xì)胞甚至不同的細(xì)胞株和細(xì)胞系有各自獨(dú)立的無血型培養(yǎng)基配方.6

補(bǔ)充因子是無血清培養(yǎng)基中各種血清替代成分的總稱。補(bǔ)充因子的種類繁多,主要有生物大分子、小分子和微量元素等。補(bǔ)充因子又可歸類為必需補(bǔ)充因子和特殊補(bǔ)充因子。必需補(bǔ)充因子:胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和亞硒酸鈉所有的細(xì)胞株在無血清培養(yǎng)基中生長時都需要的,特殊補(bǔ)充因子:①生長因子②激素③貼壁因子④其它補(bǔ)充因子71.胰島素:細(xì)胞無血清培養(yǎng)中,胰島素的使用濃度為0.1~10μg·mL-1。胰島素可以促進(jìn)RNA、蛋白質(zhì)和脂肪酸的合成,抑制細(xì)胞凋亡,是重要的細(xì)胞存活因子,部分學(xué)者認(rèn)為在批式培養(yǎng)中胰島素迅速耗盡是細(xì)胞比生長速率下降的主要原因。CHO細(xì)胞能在僅含重組人胰島素一種蛋白成分的無血清培養(yǎng)基中連續(xù)傳代82.轉(zhuǎn)鐵蛋白:大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞上存在特定的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體,受體與轉(zhuǎn)鐵蛋白/Fe3+復(fù)合物結(jié)合是細(xì)胞獲取必需的微量元素鐵的主要來源,此外轉(zhuǎn)鐵蛋白還具有生長因子的性質(zhì)并能與其他微量元素如釩等結(jié)合。轉(zhuǎn)鐵蛋白的使用濃度為0.5~100μg·mL-1,亦有研究報告指出,無血清培養(yǎng)基中必須要有轉(zhuǎn)鐵蛋白至少5μg·mL-1,胰島素才能起作用。也有資料證實轉(zhuǎn)鐵蛋白在無血清培養(yǎng)基中的作用可以為某些鐵鹽所代替,如檸檬酸鐵、二甲胂酸鐵、葡糖酸鐵等。93.亞硒酸鈉:Hewlett在1991年曾指出硒在任何一種細(xì)胞,特別是人體細(xì)胞的生長過程中確實具有明顯作用,微量元素硒參與谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化物歧化酶的作用過程,消除氧化物酶和氧自由基對細(xì)胞的傷害。亞硒酸鈉的最適添加濃度是30~60nmol·L-1。10生產(chǎn)rhEPO的無血清培培養(yǎng)基用于基因重重組促人紅紅細(xì)胞生成成素(Recombinanthumanerythropoietin,rHuEPO)生產(chǎn)且不含含牛血清白白蛋白的無無血清培養(yǎng)養(yǎng)基-p(Serumfreemedium-p,SFM-p)培養(yǎng)液,就是在達(dá)爾爾貝可改良良的伊格爾爾(DulbeccosmodifiedEaglesmedium,DMEM)∶F12(1∶1)培養(yǎng)基中添添加了Se、乙醇胺、、多種維生生素、蛋白白胨、胰島島素、轉(zhuǎn)鐵鐵蛋白和一一些細(xì)胞因因子等成分分構(gòu)成的專專用培養(yǎng)基基11使用無血清清培養(yǎng)基的的問題無血清培養(yǎng)養(yǎng)基雖然在在各個方面面都顯示出出其強(qiáng)大的的優(yōu)勢和發(fā)發(fā)展前景,但采用無血血清培養(yǎng)而而誘發(fā)的細(xì)細(xì)胞凋亡也也成為動物物細(xì)胞無血血清培養(yǎng)技技術(shù)中亟待待解決的問問題.在培養(yǎng)基中中加入某些些化合物,如金精三羧羧酸(Aurintricarboxylicacid,ATA)、鋅離子、、抗氧化劑劑和細(xì)胞因因子等,在一定程度度上可阻止止因采用無無血清培養(yǎng)養(yǎng)基而導(dǎo)致的的細(xì)胞凋亡亡.12無血清培養(yǎng)養(yǎng)基展望培養(yǎng)基中所所添加的蛋蛋白成分主主要還是來來源于動物物或人,仍然存在病病毒污染的的危險,只有完全采采用非動物物來源的材材料,才是相對安安全的,而植物提取物物將是理想的的選擇.可以這樣預(yù)預(yù)測,未來開發(fā)的的新一代無無血清培養(yǎng)養(yǎng)基,將是一種既既無血清、、無蛋白,又可以高溫溫消毒,且適合于多多種不同細(xì)細(xì)胞生長的的全能型培培養(yǎng)基13微載體微載體培養(yǎng)養(yǎng)是細(xì)胞在在由葡聚糖糖制成的小小球表面成成單層生長長,通過輕輕攪攪拌使細(xì)胞胞維持懸浮浮狀態(tài)。這這種培養(yǎng)較較傳統(tǒng)的單單層細(xì)胞培培養(yǎng),面積大大增增加,將這種微載載體在流化化床式、固固定床式反反應(yīng)器中進(jìn)進(jìn)行培養(yǎng),則可獲得比比原來多20~50倍的高密度度細(xì)胞.14常用的微載載體15Cytodex微載體上細(xì)細(xì)胞生長情情況161718192021Cytopore的性質(zhì)22動物細(xì)胞生生物反應(yīng)器器23常見動物細(xì)細(xì)胞生物反反應(yīng)器類型型氣升式(airlift)生物反應(yīng)器器中空纖維管管(hollow-fiber)生物反應(yīng)器器流化床(fluidiz-bed)生物反應(yīng)器器(FBR)攪拌罐(stir-tank)生物反應(yīng)器器(STR)固定床(fixed-bed)生物反應(yīng)器器填充床(packed-bed)生物反應(yīng)器器24填充床生物物反應(yīng)器動物細(xì)胞大大規(guī)模培養(yǎng)養(yǎng)需要合適適的生物反反應(yīng)器.目前國內(nèi)用用的比較多多的適合CHO細(xì)胞生長并并能高效表表達(dá)產(chǎn)物的的反應(yīng)器是是填充床式式生物反應(yīng)應(yīng)器,其中比較有有名的是美美國NBS公司生產(chǎn)的的Celligen系列.25CelligenplusCelligen31026Cellgen系列生物反反應(yīng)器的特特點適合貼壁培培養(yǎng)細(xì)胞和和懸浮細(xì)胞胞,適合各種動動物細(xì)胞,昆蟲細(xì)胞和和植物細(xì)胞胞等灌流式的培培養(yǎng)過程低（無）剪剪切力攪拌拌,無氣泡通氣氣；特殊的貼壁壁載體,比表面積大大,靜止培養(yǎng)通過持續(xù)檢檢測攝氧率率實時檢測測細(xì)胞濃度度符合現(xiàn)行藥藥品生產(chǎn)質(zhì)質(zhì)量管理規(guī)規(guī)范(cGMP)27灌注培養(yǎng)灌注屬于連連續(xù)培養(yǎng),細(xì)胞保留在在反應(yīng)器系系統(tǒng)中,收獲培養(yǎng)液液的同時不不斷加入新新鮮培養(yǎng)基基.灌注培養(yǎng)的的主要優(yōu)點是連續(xù)灌注注的培養(yǎng)基基可以提供供充分的營營養(yǎng)成分,并帶走代謝謝產(chǎn)物.同時,細(xì)胞保留在在反應(yīng)器中中,可以達(dá)到很很高的細(xì)胞胞密度.同其他他方法法相比比,灌注培培養(yǎng)的的產(chǎn)率率可以以提高高一個個數(shù)量量級,并可以以大大大降低低勞動動力的的消耗耗.2829Celligen系列生生物反反應(yīng)器器的特特點適合貼貼壁培培養(yǎng)細(xì)細(xì)胞和和懸浮浮細(xì)胞胞,適合各各種動動物細(xì)細(xì)胞,昆蟲細(xì)細(xì)胞和和植物物細(xì)胞胞等灌流式式的培培養(yǎng)過過程低（無無）剪剪切力力攪拌拌,無氣泡泡通氣氣；特殊的的貼壁壁載體體,比表面面積大大,靜止培培養(yǎng)通過持持續(xù)檢檢測攝攝氧率率實時時檢測測細(xì)胞胞濃度度符合現(xiàn)現(xiàn)行藥藥品生生產(chǎn)質(zhì)質(zhì)量管管理規(guī)規(guī)范(cGMP)30攪拌葉葉輪種種類31Celligen系列生生物反反應(yīng)器器的特特點適合貼貼壁培培養(yǎng)細(xì)細(xì)胞和和懸浮浮細(xì)胞胞,適合各各種動動物細(xì)細(xì)胞,昆蟲細(xì)細(xì)胞和和植物物細(xì)胞胞等灌流式式的培培養(yǎng)過過程低（無無）剪剪切力力攪拌拌,無氣泡泡通氣氣；特殊的的貼壁壁載體體,比表面面積大大,靜止培培養(yǎng)通過持持續(xù)檢檢測攝攝氧率率實時時檢測測細(xì)胞胞濃度度符合現(xiàn)現(xiàn)行藥藥品生生產(chǎn)質(zhì)質(zhì)量管管理規(guī)規(guī)范(cGMP)32Celligen系列使使用的的載體體—Fibra-Cel(聚酯片片)33FibraCel的技術(shù)術(shù)指標(biāo)標(biāo)34FibraCel的電鏡鏡照片片無細(xì)胞胞生長長的FibraCelHEK293細(xì)胞在在FibraCel上生長長4天的情情況HEK293細(xì)胞在在FibraCel上生長長7天的情情況35FibraCel適用的的細(xì)胞胞種類類36籃式纖纖維填填充床床37Celligen系列生生物反反應(yīng)器器工作作原理理(P113)38用無血血清培培養(yǎng)基基在填填充床床生物物反應(yīng)應(yīng)器生生產(chǎn)rHuEPO文摘在填充充床生生物反反應(yīng)器器用含含5%FBS的DMEM:F12培養(yǎng)基基培養(yǎng)養(yǎng)產(chǎn)重重組人人促紅紅細(xì)胞胞生成成素(rHuEPO)的細(xì)胞胞CHO8~10d后,使用自自制的的無血血清生生產(chǎn)培培養(yǎng)(SFM-p)生rHuEPO。SFM-p培養(yǎng)基基既能能維持持細(xì)胞胞生長長,又能生生產(chǎn)EPO,也便于于純化化分離離rHuEPO。使用用填充充床生生物反反應(yīng)器器培養(yǎng)養(yǎng)細(xì)胞胞,能維持持培養(yǎng)養(yǎng)20~25d,rHuEPO表達(dá)水水平達(dá)達(dá)12~28·4mg/L之間,反應(yīng)器器的產(chǎn)產(chǎn)率達(dá)達(dá)71··0mg/L/d,比滾瓶瓶的產(chǎn)產(chǎn)率增增加12~14倍。葡葡萄糖糖最高高消耗耗量達(dá)達(dá)到21g/L/d,細(xì)胞培培養(yǎng)密密度最最高達(dá)達(dá)到3·0×107/ml以上,每次可可收無無血清清培養(yǎng)養(yǎng)上清清80~87L。由于于細(xì)胞胞被固固定在在聚酯酯片上上,培養(yǎng)上上清中中脫落落細(xì)胞胞很少少。觀觀察了了反應(yīng)應(yīng)器的的乳酸酸和氨氨的含含量,其結(jié)