生化藥物質量標準中生物檢定及其進展

生化藥物質量標準中生物檢定及其進展生物檢定（bioassay

）一些生化藥物質量標準中有生物活性測定

安全性檢查

（多組分生化藥的原材料來源于人、動物的組織或者體液，或者通過發(fā)酵而來。其組分不明確、按照化學藥品的質控方式很難控制其質量）

多組分生化藥注射劑基本技術要求：

涉及到多組分生化藥特性的指標質量標準，如過敏物質、降壓物質、異常毒性等?；钚詼y定也是反映產品質量的重要指標，有時比含量測定更具專屬性，建議將活性測定收入標準生物檢定（bioassay

）按生物體分類：體內測定(invivo)---整體動物體外測定(invitro)---離體器官、組織，微生物、酶和細胞（原代細胞、傳代細胞）中國藥典2005版二部中的生物檢定

用于生物活性測定的生化藥物有21品種（約占我國生化藥的10%）安全性檢查---很多生化藥物（無菌、微生物限度、熱原、細菌內毒素、異常毒性、降壓物質、過敏等）生物檢定針對的品種---多組分生化藥對無適當理化方法檢定、常規(guī)化學測定方法較難建立，不能控制其質量的藥品生物檢定是反映產品質量的重要指標，具有專屬性當前英國、美國及中國藥典都有收載生物檢定的重要作用新藥研發(fā)初始階段(體外測定篩選有效成分、整體動物試驗確認藥效)生產階段：評價產品批與批之間穩(wěn)定性和一致性生產工藝驗證（生物檢定可監(jiān)測不曾預料、不易發(fā)現的構象變化，它是所有變化的綜合效應）生產工藝驗證的品種DNA重組人生長激素、人胰島素、人胰高血糖素，降鈣素等常規(guī)檢定已用理化測定（HPLC）藥典（BP、ChP）規(guī)定：在研發(fā)階段，生產過程中的產品必須用體內生物測定方法測定其生物效價，直到生產穩(wěn)定為止活性測定分類活性測定---定量：質量標準中生物效價測定（HCG、HMG、肝素）---半定量---定性活性測定------半定量半定量------當理化測定占主導地位，生物效價測定降為輔助作用，只用于活性檢查，設定限值，采用半定量方法，不需精確的生物統(tǒng)計，盡可能減少實驗動物用量

如治療二型糖尿病新藥重組人胰高血糖素類多肽-1（7-36）質量標準中采用半定量方法（限值為小鼠血糖降低應大于20%）進行活性檢查活性測定------定性定性（鑒別Identity）對質量控制能用理化測定的產品，生物測定從主導地位的定量測定降為次要的鑒別項的定性測定，只用較少的動物例如USP29版：縮宮素（oxytocin）子宮收縮法用于鑒別；升壓素（Vasopressin）大鼠血壓升高法用于鑒別，效價測定均采用HPLC法ChP2005版二部縮宮素仍用定量生物測定法生化藥標準中的體內生物檢定（1）生化藥名生測方法應用收載標準HMG尿促性素FSH大鼠卵巢增重法LH大鼠精囊增重法鑒別效價測定ChP2005HCG絨促性素雌幼小鼠子宮增重法效價測定ChP2005垂體后葉大鼠血壓升高法效價測定ChP2005促皮質素大鼠腎上腺內維C降低效價測定14th冊地標升國標小牛脾提取物家兔升高白細胞法活性檢查9th冊靈桿菌多糖家兔升高白細胞法活性檢查9th冊生化藥標準中的體內生物檢定（2）生化藥名生測方法應用收載標準rhGH重組人生長激素去垂體大鼠體重法和脛骨法

工藝驗證

ChP2005

降鈣素

大鼠血鈣法

工藝驗證

ChP2005

孕馬血清促性腺激素

雌幼大鼠卵巢增重法

效價測定

BP2007

升壓素

大鼠血壓升高法

鑒別

USP29

人胰高血糖素

兔血糖升高法

工藝驗證

BP2007人紅細胞生成素小鼠網織紅細胞計數效價測定ChP2005生化藥標準中的體外生物檢定（1）

離體動物器官、細胞培養(yǎng)、生化酶促反應、免疫學活性等測定法

生化藥名生測方法應用收載標準縮宮素大鼠子宮收縮法效價測定鑒別ChP2005USP29肝素家兔血，兔、豬血漿凝固法效價測定ChP2005低分子肝素酶促反應的分光光度法效價測定BP2005硫酸魚精蛋白家兔血，兔豬血漿凝固法效價測定ChP2005甘露聚糖肽補體結合法檢查免疫原性16th冊地標升國標生化藥標準中的體外生物檢定（2）

離體動物器官、細胞培養(yǎng)、生化酶促反應、免疫學活性等測定法

生化藥名生測方法應用收載標準胸腺肽脫E受體法活性檢查16th冊地標升國標轉移因子脫E受體法活性檢查16th冊抗腫瘤免疫核糖核酸小鼠脾細胞黏附率法活性檢查16th冊抗乙肝免疫核糖核酸小鼠脾細胞黏附率法活性檢查16th冊促肝細胞生長素SMMC-7721肝癌細胞增殖MTT比色法活性檢查9th冊牛胎肝提取物SMMC-7721肝癌細胞增殖MTT比色法活性檢查9th冊基因重組技術產品體外生物檢定

多采用相對快速重復性好的細胞培養(yǎng)測定法，收載ChP2005

生化藥名生測方法原理應用干擾素（IFN）Wish細胞病變抑制/結晶紫染色法間接保護細胞效價測定粒細胞集落刺激因子（G-CSF）NFS-60細胞/MTT比色法促進細胞生長效價測定粒細胞-巨嗜細胞集落刺激因子（GM-CSF）TF-1細胞/MTT比色法促進細胞生長效價測定表皮生長因子（EGF）3T3細胞/MTT比色法促進細胞生長效價測定白細胞介素-2（IL-2）CTLL-2細胞/MTT比色法促進細胞生長效價測定腫瘤壞死因子（TNF）L929細胞/結晶紫染色法抑制細胞生長效價測定堿性成纖維細胞生長因子（bＦＧＦ）3T3細胞/MTT染色法促進細胞生長效價測定實驗設計與生物統(tǒng)計

生物測定（無論體內、體外）的實驗誤差比理化測定要大控制實驗誤差尤為重要試驗控制（良好實驗操作、試驗材料一致性）合理的實驗設計運用生物統(tǒng)計例如肝素含片質量標準（9th冊地標升國標）內為低分子肝素:LMWH，對FXa效價測定采用體外酶促反應的分光光度法實驗設計為標準曲線法對其相關系數（r）和每一濃度重復次數均未作要求本實驗室增加要求r>0.98和每一濃度至少重復2次對同一批號肝素含片產品測定其抗FXa效價，結果誤差仍大，重現性差，波動大，缺乏可比性改為量反應平行線原理的4·4實驗設計

并結合生物統(tǒng)計

要求實驗可靠性測驗通過：直線回歸P<0.01，偏離平行、二次曲線和反向二次曲線P>0.05

P結果較平穩(wěn)，誤差小，重現性好肝素含片內LMWH不是化學純品，是一定分子量范圍內的多相性成分的分布，其相對分子量、糖鏈長度、硫酸化數目和位置、結構的不均一性對顯色反應的分光光度法均有一定誤差正確的實驗設計并運用生物統(tǒng)計

提高實驗的準確度和精密度標準曲線法與量反應平行線4·4法測定同一批肝素含片產品抗FXa效價比較生物檢定進展科技發(fā)展，一些生化藥已由現代生物技術（DNA重組、生物合成等）獲得檢測技術、結構分析水平的提高產品純度生產工藝的成熟、完善，產品達到高純生物測定繁瑣、實驗周期長、準確度差、誤差大、耗費大量人力、物力隨著對動物保護、對實驗動物減少、替代、優(yōu)化（3R）的呼聲越來越高，生物測定已不適應現代科學技術的發(fā)展發(fā)展趨勢

減少實驗動物用量、降低實驗費用縮短實驗周期，提高實驗準確度、精密度和穩(wěn)定性檢測方法的invitro代替invivo簡單代替繁瑣生物測定正從主導地位的定量測定降為輔助作用的半定量、定性測定，直至被取代胰島素（動物胰腺提?。┥餀z定USP29版胰島素生物鑒別試驗(Bioidentitytest)半定量的8只家兔血糖法（SH、SL，TH、TL組，每組2只），生物效價不得低于15USPU/mg定量的生物效價測定需用24只家兔血糖法（SH、SL，TH、TL組，每組6只）定量法用于胰島素標準品標定、新制劑穩(wěn)定性的考察、胰島素類似物特異性活性的測定，而不用于常規(guī)檢定BP2007版胰島素采用HPLC法ChP2005版二部，動物胰腺提取的胰島素定量生物測定中國藥典2010年版二部生化藥品專業(yè)科研項目1、藥品中氨基酸分析方法的研究（歸納分類）。（中檢所負責）2、蛋白質含量測定方法的規(guī)范化研究，增訂附錄。（上海所負責）3、人工腸液和胃液中所用酶試劑的標準化研究。（中檢所和北京所負責）4、縮宮素、降鈣素等品種用HPLC法替代生物測定法的研究。（各品種起草單位）。5、等電聚焦電泳法的規(guī)范化研究，增訂附錄（中檢所負責）6、體外生物活性測定法標準化研究。（中檢所負責）7、多合成肽（8、14、28、3、4、9肽）的相關物、不相關物的分析。（中檢所負責）8、硫酸軟骨素、香菇多糖、低分子肝素等多糖類藥物的分子量及分布的標準物質的研究。（中檢所）9、多烯酸乙酯的相關物、不相關物的分析。（北京所）10、氨基酸原料藥中其他氨基酸檢查方法的考察。（河南所牽頭，中檢所復核，各品種起草單位參加）中國藥典2010年版二部生化藥品專業(yè)科研項目11、降壓物質（組胺、類組胺）質譜檢測與動物實驗相關性的研究。（中檢所負責，上海所、廣州所、天津所參與）12、應用PCR對人源性藥品原材料殘留病毒核酸的研究。（中山大學負責）13、生化藥注射劑、滴眼劑的可見異物檢查研究。（北京所牽頭，各品種起草單位參加）14、生化藥品過敏原的研究。（中檢所負責）15、輔酶AHPLC法與效價測定法的相關驗證。（河南所負責）16、磷測定方法的方法學研究。（上海所負責）17、多酶片的質量標準提高。（陜西所負責）18、復方氨基酸注射液等輸液中鋁元素考察及檢查方法的建立。（遼寧所牽頭）19、修訂分子排阻色譜法中生物大分子聚合物分子量與分子量分布的測定法（增訂普適校正法和寬分布標樣法）。（中檢所）在本實驗室已用理化測定代替生物測定

兩種方法間具有良好相關性（P﹤0.01）的品種生化藥名生物測定方法理化測定方法收載質量標準rhGH重組人生長激素去腦垂體大鼠的體重法和脛骨法HPLCChP2005BP2007重組人胰島素小鼠或家兔血糖法HPLCChP2005BP2007降鈣素大鼠血鈣法HPLCChP2005BP2007低分子肝素血漿凝固法或家兔全血凝固法分光光度法BP2007在本實驗室已用理化測定代替生物測定

兩種方法間具有良好相關性（P﹤0.01）的品種生化藥名生物測定方法理化測定方法收載標準偉素(Sulodexide)

大鼠血脂清除率法分光光度法企業(yè)標準重組絨促性素(rHCG)幼小鼠子宮增重法HPLC

企業(yè)標準重組卵泡刺激素(rFSH)幼大鼠卵巢增重法HPLC

企業(yè)標準重組黃體生成素(rLH)幼大鼠精囊增重法HPLC

企業(yè)標準發(fā)展方向取代在今后藥品質量標準中生物測定逐漸被先進的理化方法、或能保證臨床用藥安全有效的其它方法所取代，或只存在于生產研究階段WHO國際藥典及藥品專家委員會第42次專家會議(2007年10月)討論對于胰島素、縮宮素等由原來生物測定轉化為理化測定的提議安全性檢查（safetytest）

一般原則：注射液為肌內注射：異常毒性、過敏反應物質等檢查項。原料和工藝易污染熱原且用量較大者應考慮設熱原檢查項注射液為靜脈注射必需設異常毒性、熱原(細菌內毒素)、過敏反應物質檢查、降壓反應物質檢查、溶血與凝聚檢查等所有安全性檢查項多組分生化藥注射劑基本技術要求:由于原材料為生物來源，成品中含有各種生化物質，為保證注射給藥的安全，一般須進行過敏物質、降壓物質、異常毒性等檢查藥典會：生化藥品注射劑標準提高專項工作

生化藥名考慮增訂的項目巴曲酶注射液注射用、亮菌甲素注射液內毒素、考查有關物質

細菌內毒素或熱原、異常毒性薄芝糖肽注射液高分子物質或過敏試驗

蜂毒注射液蜂毒毒性試驗、過敏試驗聚肌胞注射液分子量分布、熱原靈孢多糖注射液熱原、異常毒性、過敏試驗滅菌前列腺素E2溶液過敏試驗、熱原脫氧核苷酸鈉注射液異常毒性、考查高分子物質垂體后葉注射液內毒素、異常毒性、過敏試驗、有關物質垂體前葉腎上腺皮質提取物注射液過敏試驗生化藥名考慮增訂的項目注射用、亮菌甲素注射液細菌內毒素或熱原、異常毒性中性胰島素注射液精蛋白重組人胰島素注射液過敏試驗、異常毒性過敏試驗、異常毒性精蛋白鋅胰島素注射液過敏試驗、異常毒性、考查有關物質羥乙基淀粉20氯化鈉注射液熱原改為細菌內毒素。人參多糖注射液分子量與分子量分布、溶血與凝聚、過敏試驗、有關物質、內毒素胎盤多肽注射液胎盤脂多糖注射液熱原、過敏試驗或高分子物質、含量測定制法、安全性試驗乙酰谷酰胺注射液內毒素注生化藥名考慮增訂的項目卵磷脂（供注射用）溶血性磷脂檢查及過氧化值待標準修訂后，收入2005年版第二部分（輔料）脂肪乳注射液（C14～24)鑒別：磷脂酰膽堿的TLC、檢查項：過氧化值，溶血性磷脂粉塵螨注射液溶血與凝聚、異常毒性、過敏試驗等復方氨基酸注射液（14AA）將熱原改為內毒素、透滲壓及抗氧劑的含量測定核酪注射液安全性試驗硫酸魚精蛋白注射液異常毒性、過敏試驗、有關物質、pH值鞣酸加壓素注射液pH值、內毒素、異常毒性、溶血與凝聚、過敏試驗、顏色、有關物質、含量測定縮宮素注射液異常毒性、過敏試驗、有關物質、按EP修訂五肽胃泌素注射液內毒素、含量測定改HPLC注生化藥名考慮增訂的項目注射用醋酸丙氨瑞林細菌內毒素、考查有關物質注射用糜蛋白酶無菌、內毒素、過敏試驗、異常毒性、有關物質注射用糜胰蛋白酶熱原等安全性試驗注射用抑肽酶無菌、過敏試驗、異常毒性眼氨肽注射液制法、過敏試驗、考查肽含量、增加中間體控制氨碘肽注射液制法、熱原、有效成分定量、高分子物質輔酶Q10注射液內毒素復方骨肽注射液制法、考查神經毒、高分子物質骨肽注射液骨瓜提取物注射液肝水解肽注射液安全性試驗、分子量范圍安全性試驗高分子物質、安全性試驗注生化藥名考慮增訂的項目肌氨肽苷注射液制法、高分子物質或過敏試驗注射用、科博肽注射液考查出血毒、神經毒、熱原鹿瓜多肽注射液制法、安全性試驗腦蛋白水解物注射液制法、異常毒性、其他物質提高標準、過敏試驗腦苷肌肽注射液制法、安全性試驗曲克蘆丁腦蛋白水解物注射液金葡菌毒素注射液制法、安全性試驗安全性試驗水解蛋白注射液制法、滲透壓注射用降纖酶不同蛇種的活性硫酸軟骨素注射液硫酸軟骨素A鈉注射液安全性試驗安全性試驗注考慮增訂的項目：

考查有關物質滲透壓注射用、三磷酸腺苷二鈉注射液更昔洛韋氯化鈉注射液鹽酸精氨酸注射液利巴韋林氯化鈉注射液谷氨酸鉀注射液小兒復方氨基酸注射液（18AA-Ⅰ）注射用、細胞色素C注射液小兒復方氨基酸注射液（19AA-Ⅰ）注射用尿促性素右旋糖酐20、40、70氯化鈉注射液注射用絨促性素右旋糖酐20、40、70葡萄糖注射液注射用玻璃酸酶注射用尿激酶注射用門冬酰胺酶甲硫氨酸維B1注射液異常毒性(abnormaltoxicity)定義異常毒性是檢查藥品在生產制造、制劑過程中外來引入的異物或藥物降解產生的不正常毒性反應,與生產工藝水平有關,而不是檢查藥物本身毒性。限值異常毒性限值劑量的設置一般在低于藥物最低致死量（LD5），在藥物本身的安全劑量范圍內問題：限值定的過大，（＜LD50）概念混淆，國大多數生化藥注射用或注射液標準中都有異常毒性檢查,有些品種易忽略不是考察藥品本身毒性這一特性,應予以糾正。ChP2005中概念混淆的品種例如右旋糖酐鐵注射液異常毒性檢查:每只小鼠靜脈注射5mg(Fe),5日內死亡數10只中不得過3只;這實際上是考察藥品本身(游離鐵有毒)的毒性,而不應稱為異常毒性。BP2007稱該項為不當毒性(unduetoxicity)USP29稱該項為急毒(Acutetoxicity)中、英兩國藥典異常毒性檢查法比較ChP2005藥品BP2007

藥品ChP2005生物制品BP2007生物制品動物5只小鼠5只小鼠5只小鼠5只小鼠動物體重g17～2017～2217～2017～20靜脈給藥速度4～5秒15～30秒4～5秒4～5秒給藥途徑靜脈、腹腔、皮下、口服靜脈腹腔注射腹腔注射觀察時間48h24h7d7d結果判斷不得有死亡不得有死亡健存、無異常、體重增加不得有一只死亡或不健康給藥途徑、靜脈給藥速度靜脈注射速度iv過快,小鼠心臟壓力驟增,也是造成死亡原因之一，因此應緩慢注射給藥途徑異常毒性檢查針對多為注射用或注射液一般動物試驗給藥途徑應與臨床給藥途徑因此不應設定口服給藥途徑皮下注射給藥吸收速度慢、差異較靜脈注射大即使臨床為非注射給藥,也應iv,以便更易于發(fā)現毒物的混入;iv給藥線性關系好、斜率大是較常用的給藥途徑。藥典中異常毒性檢查法

僅ChP和BP有收載BP2007異常毒性檢查4個生化藥：抑肽酶、抑肽酶濃縮液、鹽酸魚精蛋白、硫酸魚精蛋白7個抗菌素品種作該項檢查其余30多品種為抗血清、疫苗等生物制品ChP2005版二部已有42個品種（組份和雜質明確）刪除了異常毒性但目前我國大多數生化藥物注射用或注射液標準中都有異常毒性檢查USP29安全(Safety)檢查

急毒(Acutetoxicity)USP29版安全(Safety)檢查和急毒(Acutetoxicity)與異常毒性大致相同，限度稍寬（允許1-2只死亡）安全(Safety)檢查收載3個生化藥：右旋糖酐40、右旋糖酐70、HMG（HMG：5只小鼠18-22g，iv1.0ml,觀察48h,1-2只死亡，10只重試）其余10多種為疫苗、生物技術產品等生物制品急毒(Acutetoxicity)收載2個生化藥HCG和右旋糖酐鐵（HCG:5只小鼠18-22g，iv0.5ml,觀察48h,1-2只有毒性癥狀或死亡，10只重試）有關異常毒性檢查的爭議國外文獻認為它缺乏專屬性和科學性，當初是在沒有實施GMP的情況下，為以防萬一而設其結果各實驗室間差異極大，與產品質量、添加物、所用動物都毫無關聯，不足以反映產品質量，不易與藥品本身引起的毒性反應相區(qū)別對動物福利、3R、現在已實施GMP等因素的考慮微量雜質或毒物的混入，已可用理化分析方法定量測定歐洲各國藥廠和檢驗部門檢查異常毒性從未不合格,因此重點應放在考察生產過程,尤其新建廠對每一生產步驟監(jiān)控直到正常生產結論：不應再在終產品質量標準中設定異常毒性檢查項，異常毒性檢查應當取消我國大多數生化藥物注射用或注射液標準中都有異常毒性檢查

國情不同，雖然實施GMP但仍有漏洞（由于我國生化藥物多為多組分來源復雜和工藝過程的變化使生化藥注射劑有可能污染劇毒物質和成分,從而引起急性毒性反應，因此,目前對生化藥注射劑設異常毒性檢查項目是必要的，以后真正實施GMP，才可考慮取消）藥典會有關高風險品種（多組分生化藥）注射劑質量標準提高，增加安全性檢查項目某些生化藥物過去沒有該項的反而增加異常毒性檢查

降壓物質（depressorsubstances）我國一些臟器提取生化藥物靜脈注射劑進行該檢查定義降壓物質檢查是確定供試品對麻醉貓能否引起血壓下降及與組胺對照品比較其下降程度ChP和BP收載降壓物質檢查BP2007附錄有降壓物質檢查和組胺檢查法具體品種都沒有ChP過去減少，ChP2005版二部已有30個品種刪除（組份和雜質明確）降壓物質檢查存在的問題貓給藥途徑靜脈推注，使組織胺樣物質產生急性降壓而臨床給藥為靜脈滴