目的基因的獲得

第3章目的基因的獲得basicprocessofDNArecombinationinvitro

體外DNA重組的基本步驟2.重組體的制備：將目的基因的DNA片斷連接到能自我復(fù)制并帶有選擇性標記（如：抗菌素抗性標記）的載體分子上（DNA重組過程，需要各種工具酶的參與）3.重組體的轉(zhuǎn)化：將重組體（載體）轉(zhuǎn)入適當(dāng)?shù)氖荏w細胞中。4.克隆鑒定：篩選轉(zhuǎn)化成功的細胞克?。ê心康幕颍?.目的基因表達：使導(dǎo)入寄主細胞的目的基因表達出我們所需要的基因產(chǎn)物*1.目的基因的獲得：從復(fù)雜的生物基因組中，經(jīng)過PCR擴增或基因組文庫篩選、cDNA文庫篩選等步驟，分離出帶有目的基因的DNA片斷。

2contents化學(xué)合成法構(gòu)建基因組DNA文庫篩選目的基因構(gòu)建cDNA文庫篩選目的基因聚合酶鏈式式反應(yīng)(PCR)法1化學(xué)合成法多用于合成短的DNA片段，如引物、DNA探針等。DNA合成儀2構(gòu)建基因組文庫篩選目的基因Genomiclibraries：acollectionofclones,representativeoftheentirestartingpopulation某種生物的基因組的全部遺傳信息切割成一定長度的DNA片段，再通過克隆載體貯存在一個受體菌的群體之中，這個集合即為該生物的基因組文庫構(gòu)建時遺傳信息供體是基因組DNA，因而無發(fā)育時期及組織器官特異性；一個完全的基因組文庫中包含著基因組DNA上的所有編碼區(qū)及非編碼區(qū)序列的克隆。生物有機體的每一個基因在文庫中都有其克隆，該克隆的基因片段里包括著間隔序列，所以基因組文庫可真實地顯示基因組的全部結(jié)構(gòu)信息?；蚪M文庫的大小一個理想的基因組文庫，包含完整基因組的所有DNA序列理論上的克隆子數(shù)目＝基因組DNA總長度/DNA插入片段的平均長度實際的克隆子數(shù)目：大于理論666載體能夠容載的DNA片段大小直接影響到構(gòu)建完整的基因文庫所需要的重組子的數(shù)目。載體容量越大，構(gòu)建文庫所要求的DNA片段數(shù)目越少，所需的重組子越少。777Processconstructingagenemiclibrary

（基因組文庫的構(gòu)建流程）①物理切割法：超聲波（300bp）或機械攪拌（8kb）。②酶切法：內(nèi)切酶Sau3A進行局部消化?？傻玫?0-30kb的隨機片段。888（1）染色體DNA大片段的制備直接連接、人工接頭（adapter）或同聚物加尾。如：Sau3A與BamHI的酶切末端相同（二者是同尾酶）。（2）載體分別與得到的基因組DNA大片段進行連接（3）重組載體各自轉(zhuǎn)導(dǎo)受體細胞，擴大培養(yǎng)，得到基因組文庫*（4）篩選重組子形成一個含有所有片段的菌群，這個菌群就是一個基因組文庫靶DNA未測序或未定位時，可通過基因組文庫篩選靶DNA。Q：什么是adapter？Linker？同尾酶？（第2、5章）999采用λ噬菌體載體進行基因組文庫的構(gòu)建示意圖Sau3AI和BamHI是同尾酶。101010基因組DNA的處理：用兩種酶對基因組進行部分酶切；EcoRI甲基化酶封閉EcoRI位點；EcoRI連桿(linker)與平末端連接；EcoRI酶切產(chǎn)生粘性末端；Λ噬菌體置換型載體的處理：Cos位點退火，載體成環(huán)；用EcoRI酶切產(chǎn)生1個大片段，2個小片段；去掉小片段，保留大片段；連接反應(yīng)：大片段與基因組片段連接形成噬菌體基因組的串聯(lián)體；在cos位點酶切成噬菌體大小后包裝進噬菌體頭部；感染宿主并在宿主中增殖。Producingrepresentativegenomiclibrariesinλcloningvectors(1978年，最早用兩種不常見的酶酶切基因組，進行克隆。)111111CreationofagenomicDNAlibraryusingthephage-λvectorEMBL3A.(1983年，采用一種酶對基因組進行切割。該克隆策略方便高效。)Aconvenientsimpli?cationcanbeachievedbyusingasinglerestrictionendonucleasethatcutsfrequently,suchasSau3AI.

Sau3AIandBamHIcreatethesamecohesiveends.Inplaceofphage-λderivatives,anumberofhigher-capacitycloningvectorssuchascosmids,BACs,PACsandYACsareavailablefortheconstructionofgenomiclibraries.Theadvantageofsuchvectorsisthattheaverageinsertsizeismuchlargerthanforλreplacementvectors.Butsuchlibrariesaregenerallymoredifficulttoprepare,andthelargerinsertscanbelessthanstraightforwardtoworkwith.除了λ噬菌體衍生載體之外，還有其他許多的高容量克隆載體（如BAC、PAC、YAC等）都可以用于基因組文庫的構(gòu)建。這些載體的優(yōu)點是平均插入片段的大小遠大于λ置換載體，但文庫較難制備，插入片段較大，不容易直接操作。1212123構(gòu)建cDNA文庫篩選目的基因mRNAcDNA反/逆轉(zhuǎn)錄DNA轉(zhuǎn)錄AcDNAlibraryisprepared

byreverse-transcribingapopulationofmRNAsand

thenscreenedforparticularclones.cDNA

library：某種生物基因組轉(zhuǎn)錄的的全部mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的各種cDNA分別與克隆載體重組，貯存在一個受體菌的群體中，這個群體就稱為cDNA文庫。*CharacterofcDNA

library

（cDNA文庫的特點）分離的目的基因可直接用于表達比DNA文庫小的多，容易構(gòu)建，文庫的篩選比較簡單易行；以mRNA為材料，反映的是該生物特定發(fā)育時期、特定組織(或器官)在某種環(huán)境條件下的基因表達情況，有一定的時效性；只與編碼序列有關(guān)，因此不能反映內(nèi)含子、啟動子、終止子以及與核糖體識別等的序列的結(jié)構(gòu)和功能特征141414*ProcessconstructingacDNAlibrary

（cDNA文庫的構(gòu)建流程）151515*(i)isolatemRNA（提取總RNA并分離mRNA）;(ii)?rst-strandDNAsynthesisonthemRNAtemplate,carriedoutwithareversetranscriptase（用Oligo(dT)（或隨機引物）作引物，以RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA的第一鏈）;(iii)removaloftheRNAtemplate（去除RNA/DNA雜合鏈中的RNA，堿處理或RNaseH處理）;(iV)second-strandDNAsynthesisusingthefirstDNAstrandasatemplate,carriedoutwithaDNA-dependentDNApolymerase,suchasE.coliDNApolymeraseI（以cDNA第一鏈為模板，用DNA依賴性的DNA聚合酶合成cDNA第二鏈）.1：分離mRNA，通過反轉(zhuǎn)錄的方式合成cDNA161616*2：cDNA與載體連接，形成重組載體在雙鏈cDNA末端接上人工接頭，即可與載體連接，轉(zhuǎn)入受體菌。（通過接頭形成粘性末端而連接）或借助末端轉(zhuǎn)移酶給載體和雙鏈cDNA的3’端分別加上幾個C或G，成為粘性末端。（通過寡聚化形成粘性末端而連接）3：噬菌體顆粒的包裝及轉(zhuǎn)染或質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化（導(dǎo)入宿主中繁殖），得到cDNA文庫注：剛合成的cDNA雙鏈的末端幾乎不可能正好是內(nèi)切酶的酶切位點，因此這里肯定不存在由粘性末端直接相連的例子。這一點與基因組DNA與載體的相連有所區(qū)別。4：從cDNA文庫中篩選目的重組子171717181818HowtoisolatemRNA？利用mRNA都含有一段polyA尾巴的特點，采用親和層析柱將mRNA從總RNA（rRNA、tRNA等）中分離純化。mRNA只占總RNA的1%-2%。合成12－20個dT組成oligo（dT）作為引物與mRNApoly（A）尾巴雜交，用反轉(zhuǎn)錄酶引導(dǎo)可合成cDNA第一鏈。1919cDNA克隆中使用的反轉(zhuǎn)錄酶AMV：來源于禽類的成髓細胞瘤病毒MMLV：大腸桿菌中克隆的莫羅尼氏鼠白血病病毒NativeenzymeshavepoorprocessivityandintrinsicRNaseactivity,whichleadstodegradationoftheRNAtemplate.天然來源的酶缺乏持續(xù)合成能力，但具有內(nèi)在的RNA酶活力，容易使RNA模板降解，不利于生產(chǎn)全長的cDNAThenativeenzymesfunctionoptimallyat37℃andthereforetendtostallatsequencesthatarerichinsecondarystructure,asoftenfoundin5’and3’untranslatedregions.(天然來源的酶，發(fā)揮功能的最適溫度是37℃，且通常會在富含二級結(jié)構(gòu)的序列出轉(zhuǎn)錄終止——這些結(jié)構(gòu)往往出現(xiàn)在5端或3端的非翻譯區(qū)（這樣就不容易形成全長cDNA）)*2020現(xiàn)在常用的酶：天然的酶改造過以利于生產(chǎn)全長cDNASeveralcompaniesproduceengineeredmurinereversetranscriptasesthatlackRNaseHactivity,andthesearemoreef?cientintheproductionoffull-lengthcDNAs.（現(xiàn)在常用突變了的反轉(zhuǎn)錄酶（老鼠病毒來源的），它們?nèi)狈NaseH活性，因此更有利于生產(chǎn)全長cDNA）AnexampleistheenzymeSuper-ScriptII,marketedbyLifeTechnologies(Kotewiczetal.1988).Thisenzymecanalsocarryoutreversetranscriptionattemperaturesofupto50℃.(如：LifeTechnologies公司生產(chǎn)的改造后的Super-ScriptII可以在50℃下進行反轉(zhuǎn)錄。)DevelopmentofcDNAcloningstrategiesAnearlycDNAcloningstrategy,involvinghairpin-primedsecond-strandDNAsynthesisandhomopolymertailingtoinsertthecDNAintothevector.(早期的策略：發(fā)卡方法：引導(dǎo)cDNA第二鏈的合成)212121ImprovedmethodforcDNAcloning.Thefirststrandistailedwitholigo(dC)allowingthesecondstrandtobeinitiatedusinganoligo(dG)primer.(改進的策略：寡聚加帽法：對cDNA第一鏈同聚物加尾后，設(shè)計相對應(yīng)的引物合成cDNA第二鏈)*早期cDNA策略222222mRNA的分離Oligo(dT)引物與mRNA退火，cDNA第一鏈合成降解mRNA模板，cDNA3’末端形成雙鏈發(fā)夾結(jié)構(gòu)以發(fā)夾結(jié)構(gòu)為引物，合成cDNA第二鏈用S1核酸酶去掉發(fā)卡結(jié)構(gòu)缺點：S1核酸酶的作用，會使cDNA5’端的序列部分丟失232323AnearlycDNAcloningstrategy,involvinghairpin-primedsecond-strandDNAsynthesisandhomopolymertailingtoinsertthecDNAintothevector.（合成的cDNA雙鏈通過同聚物加尾的方式與載體相連后導(dǎo)入宿主細胞中）AseriousdisadvantageofthehairpinmethodisthatcleavagewithS1nucleaseresultsinthelossofacertainamountofsequence