實驗酵母菌形態(tài)學(xué)觀察與顯微鏡直接計數(shù)技術(shù)1

實驗四酵母菌形態(tài)觀察、測微技術(shù)、細胞計數(shù)、不同接種技術(shù)、抑菌能力觀察目的要求內(nèi)容原理方法結(jié)果與分析一、目的要求1.觀察酵母菌的不同細胞形態(tài)（單細胞和假絲）2.觀察酵母菌的繁殖方式(出芽\子囊），學(xué)習區(qū)別死活細胞的染色方法3.學(xué)習測微技術(shù)4.學(xué)習直接計數(shù)的方法。5.學(xué)習插片法培養(yǎng)放線菌和點植法培養(yǎng)霉菌。6.觀察土壤芽孢桿菌抗霉菌、抗葡萄球菌能力。二、實驗內(nèi)容I.酵母形態(tài)觀察1.肉眼觀察酵母菌苔，了解酵母菌培養(yǎng)特性2.顯微鏡下觀察酵母個體，認識酵母細胞形態(tài)：酵母單細胞、牙殖子、子囊孢子染色和假菌絲。II.測微技術(shù)和計數(shù) 1.用目鏡測微尺和物鏡測微尺，標定，測定酵母細胞大小。

2.用血球計數(shù)板用酵母菌懸液進行計數(shù)，學(xué)習直接計數(shù)法。III.實驗準備1.高氏1號培養(yǎng)基融化傾倒，用活化的放線菌，學(xué)習放線菌的插片接種法，每2組一板。2.馬丁培養(yǎng)基傾倒，1組1板，用活化的一種霉菌點植接種青霉菌，曲霉和根霉。3.觀察土壤芽孢桿菌抑菌能力。三、實驗原理1.如何區(qū)別酵母菌細胞的死活？其原理如何？2.酵母菌的生殖方式有哪些？3.酵母菌的形態(tài)有何特點？4.測微技術(shù)原理5.血球計數(shù)板的構(gòu)造及用其進行微生物直接計數(shù)的原理？三、實驗原理1.用什么方法區(qū)別酵母菌死活細胞？其原理如何？常用區(qū)別酵母細胞死與活的方法，是采用0.1％的呂氏美蘭液染色法?；畹慕湍讣毎捎诓煌５剡M行新陳代謝，細胞內(nèi)氧化還原值頗小，還原力強，美蘭染液進入細胞后，能立即還原脫色，不能被美蘭液染上顏色；而死后或接近死亡的酵母細胞，不具有此還原能力，當加入美蘭液后，就被美蘭液染成蘭色。進而達到鑒別的目的。必須指出，上述鑒別法中酵母細胞的顏色往往會受到美蘭液的濃度、作用時間的影響，實際應(yīng)用操作中應(yīng)十分注意。BW2.酵母菌的生殖方式有哪些？1.無性生殖

芽殖酵母的種類多，主要是通過出芽的方式進行無性生殖.裂殖酵母菌通過與細菌相似的裂殖方式進行無性生殖，進行裂殖的酵母菌種類很少

。2.有性生殖 酵母菌的有性生殖方式,是指鄰近兩個”性別”不同的細胞,相互接觸,局部融合,再通過質(zhì)配,核配和減數(shù)分裂,形成4個單倍體子核,每一個子核與其附近的原生質(zhì)一起,在其表面形成一層孢子壁后,就形成了一個子囊孢子,而原有營養(yǎng)細胞就成了子囊

BW3.酵母菌的形態(tài)有何特點？

大多數(shù)酵母菌為單細胞，形狀因種而異。基本形態(tài)為球形、卵圓形、圓柱形或香腸形。有些酵母菌(熱帶假絲酵母，Candidatropicalis)進行一連串的芽殖后，長大的子細胞與母細胞并不立即分離，其間僅以狹小的接觸面相連，這種藕節(jié)狀的細胞串稱為“假菌絲”

(圖)。（如果細胞相連，且其間的橫截面積與細胞直徑一致，這種竹節(jié)狀的細胞串稱真菌絲。如霉菌菌絲等）。

BW子囊孢子染色孢子壁厚不易著色，但是一旦著色就很難被脫色。因此先用強染色劑（孔雀綠）下染色，使染料進入菌體和孢子，水洗時菌體中染色被洗脫而孢子中染料保留。在用對比度大的復(fù)染色劑染色后，菌體染上復(fù)染色劑的顏色而孢子保留原來顏色，這樣可將兩者區(qū)別開來。制片，取在28℃培養(yǎng)7d斜面培養(yǎng)物涂片，并干燥固定孔雀綠染2min,水洗，95%乙醇脫色，番紅染1min,水洗干燥，4、測微技術(shù)

測微尺分目鏡測微尺和物鏡測微尺。目鏡測微尺是一塊圓形玻片，刻度隨著使用的目鏡和物鏡的放大倍數(shù)而改變,用前必須用物鏡測微尺來標定。物鏡測微尺為一塊特制的載玻片，其中央有一小圓圈。圓圈內(nèi)刻有分度，將長1mm的直線等分為100小格，每小格等于10μm。物鏡測微尺目鏡測微尺測微技術(shù)-標定先用低倍鏡觀察，對準焦距，待看清物鏡測微尺的刻度后，轉(zhuǎn)動目鏡，使目鏡測微尺的刻度與物鏡測微尺的刻度相平行，并使兩尺的左邊第一條線相重合，再向右尋找兩尺的另外一條重合線。目鏡測微尺每格長度=兩個重疊刻度間物鏡測微尺格數(shù)×10/兩個重疊刻度間目鏡測微尺格數(shù)。5、顯微鏡計數(shù)技術(shù)活菌計數(shù)法：平板菌落計數(shù)法。通過培養(yǎng)活菌，形成菌落而計數(shù)?？偩嫈?shù)：顯微計數(shù)法。適用于各種含單細胞菌體的純培養(yǎng)懸浮液。菌體較大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球計數(shù)板，一般細菌則采用細菌計數(shù)板。兩種計數(shù)板的原理和部件相同，只是細菌計數(shù)板較薄，可以使用油鏡觀察。而血球計數(shù)板較厚，不能使用油鏡，計數(shù)板下部的細菌不易看清。顯微鏡計數(shù)技術(shù)血球計數(shù)板是一塊特制的厚型載玻片，載玻片上有4條槽而構(gòu)成3個平臺。中間的平臺較寬，其中間又被一短橫槽分隔成兩半，每個半邊上面各有一個計數(shù)區(qū)（圖5-2）。顯微鏡計數(shù)技術(shù)計數(shù)區(qū)的刻度有兩種：一種是計數(shù)區(qū)分9個大方格（大方格用三線隔開），而每個大方格又分成16個中方格；另一種是一個計數(shù)區(qū)分成25個中方格（大方格之間用雙線分開）。但是不管計數(shù)區(qū)是哪一種構(gòu)造，它們都有一個共同特點，即計數(shù)區(qū)都由400個小方格組成。顯微鏡計數(shù)技術(shù)計數(shù)區(qū)邊長為1mm，則計數(shù)區(qū)的面積為lmm2蓋上蓋玻片后，計數(shù)區(qū)的高度為0.1mm，所以每個計數(shù)區(qū)的體積為0.1mm3。

使用血球計數(shù)板計數(shù)時，先要測定每個中方格中微生物的數(shù)量，再換算成每毫升菌液（或每克樣品）中微生物細胞的數(shù)量。計算公式：(1)16中格×25小格的血球計數(shù)板計算公式:

細胞數(shù)/ml=每中格內(nèi)細胞個數(shù)×16×104×稀釋倍數(shù)

(2)25格x16格的血球計數(shù)板計算公式:

細胞數(shù)/ml=每中格內(nèi)細胞個數(shù)×25×104×稀釋倍數(shù)四、實驗方法一）酵母菌形態(tài)觀察：(1)酵母菌菌落觀察：觀察菌落表面干燥或潤濕、隆起形狀、邊緣整齊度、大小、顏色等，并用接種環(huán)挑菌，注意與培養(yǎng)基結(jié)合是否緊密。(2)個體形態(tài)觀察：用美蘭浸片觀察啤酒酵母菌/紅酵母的基本細胞形態(tài)、芽殖子、區(qū)別死活細胞。方法：在載玻片中央加一滴美蘭溶液，取少量啤酒酵母置于其中，使菌體與染色液混合均勻，將蓋片斜置，慢慢放下蓋在液滴上，以免產(chǎn)生氣泡。用高倍鏡觀察（不用油鏡）即可。（3）假絲酵母假菌絲的觀察：用水浸片觀察假絲酵母的假菌絲。四、實驗方法二）測微技術(shù)1、取下接目鏡，旋下目鏡上的目透鏡，將目鏡測微尺放入接目鏡的中隔板上，使有刻度一面朝下，再旋上目透鏡，裝入鏡筒內(nèi)。2、將物鏡測微尺置于顯微鏡的載物臺上，使有刻度的一面朝上，同觀察標本一樣，使具有刻度的小圓圈位于視野中央。3、目鏡測微尺刻度的標定4、記錄二條重合線間的目鏡測微尺的格數(shù)和物鏡測微尺的格數(shù)。計算目鏡測微尺的刻度。

5、酵母水浸片的制備觀察、測大小。四、實驗方法三）計數(shù)技術(shù)：計數(shù)過程及原則：

(1)準備：鏡檢計數(shù)室，熟悉其結(jié)構(gòu)；樣品稀釋（目的是便于酵母菌懸液的計數(shù)）.(2）將血球計數(shù)板用擦鏡紙擦凈或吹干,在計數(shù)室上加蓋玻片.(3）將提供的稀釋10倍的酵母菌懸液混勻,用吸管盡可能快地吸取一滴置于蓋玻片的邊緣,使菌液緩緩滲入,靜置5min以上，使酵母菌全部沉降到血球計數(shù)室內(nèi).(4)計數(shù)時,如果使用16中格×25小格規(guī)格的計數(shù)室,取對角線頂位（左上,右上,左下,右下）4個中格的酵母菌數(shù).如果規(guī)格為25中格×16小格的計數(shù)板,除取其4個對角位外,還需再數(shù)中央的一個中格的酵母菌數(shù).對每個樣品計數(shù)三次,取其平均值,取均值。四、實驗方法三）計數(shù)技術(shù)：(5)當細胞位于中格線上，采用“上計下不計，左計右不計”原則.(6)遇到有芽體的酵母時，若芽體≥1/2母體，認為芽體=1。（7）按照以上各均值，計算每1ml菌液中所含的酵母菌個數(shù).（8）血球計數(shù)板的清潔：血球汁數(shù)板使用后,用自來水沖洗,切勿用硬物洗刷,洗后自行晾干或用吹風機吹干,或用95%的乙醇,無水乙醇等有機溶劑脫水使其干燥.通過鏡檢觀察每小格內(nèi)是否殘留菌體或其他沉淀物.若不干凈,則必須重復(fù)清洗直到完全潔凈為止.四、實驗方法四）插片接種法融化高氏1號培養(yǎng)基，傾倒平板。冷凝。將浸泡于酒精中的蓋玻片用酒精燃燒法滅菌、冷卻，45度傾角插入培養(yǎng)基。接種環(huán)取放線菌孢子，沿插片接縫處劃線接種。每人練習1片，共用培養(yǎng)基。每2組共用一平板。每板插片4片一半同學(xué)接種天藍色放線菌，另一半同學(xué)接種白色放線菌四、實驗方法五）點植法接種霉菌融化馬丁氏培養(yǎng)基，傾倒平板。冷凝。無菌接種法點植霉菌，每個平板點植4點。每種霉菌只能點植在同一個平板上。每1組1板，每人點植1點。1/3組點植青霉菌1/3組點植曲霉1/3組點植根霉四、實驗方法六）芽孢桿菌的保存和驗證

-觀察抑菌圈大小-保存菌種-重復(fù)實驗五、結(jié)果與討論1.繪圖說明酵母菌各形態(tài)觀察結(jié)果。2.列表記錄各計數(shù)原始值，依此計算所提供菌懸液中酵母菌的濃度。3.你每次取樣的計數(shù)結(jié)果差異大嗎？如果比較大，試分析原因。示教