發(fā)酵工業(yè)與發(fā)酵工程固定化酶與固定化細(xì)胞發(fā)酵

發(fā)酵工業(yè)與發(fā)酵工程固定化酶與固定化細(xì)胞發(fā)酵一、固定化酶的定義與優(yōu)點所謂固定化酶，是指在一定的空間范圍內(nèi)起催化作用，并能反復(fù)和連續(xù)使用的酶。固定化酶的優(yōu)點：（1）同一批固定化酶能在工藝流程中重復(fù)多次地使用；（2）固定化后，和反應(yīng)物分開，有利于控制生產(chǎn)過程，同時也省去了熱處理使酶失活的步驟；（3）穩(wěn)定性顯著提高；（4）可長期使用，并可預(yù)測衰變的速度；（5）提供了研究酶動力學(xué)的良好模型。1、固定化酶的活力在大多數(shù)情況下比天然酶下降，其專一性也會受到影響發(fā)生改變?；盍ο陆档脑颍?/p>

酶分子在固定化過程中，酶的空間構(gòu)像發(fā)生了變化，甚至活性中心的氨基酸也會參加反應(yīng)。

固定化后的空間障礙效應(yīng)的影響。

內(nèi)擴(kuò)散阻力的影響使底物分子與活性中心的接近受阻。

包埋法時被高分子物質(zhì)半透膜包圍。

二、固定化酶（細(xì)胞）性質(zhì)的改變固定化后的酶與載體多點連接，可防止酶分子伸展變形。酶活力的緩慢釋放。反應(yīng)開始只有部分酶起作用，其余部分僅在開始起作用的酶變性后才起作用。抑制自降解，提高了酶穩(wěn)定性。

2、固定化后酶穩(wěn)定性提高穩(wěn)定性提高的原因：

酶固定化后，對底物的最適pH曲線常常發(fā)生偏移。一般來說，帶負(fù)電荷載體制備的固定化酶，其最適pH值較游離酶偏高，反之，若使用帶正電荷載體的話，其最適pH值較游離酶偏低，即向酸性偏移。

3、固定化酶（細(xì)胞）的作用pH變化

酶反應(yīng)的最適溫度是酶熱穩(wěn)定性與反應(yīng)速度的綜合結(jié)果。因為固定化后，酶的熱穩(wěn)定性提高，所以最適溫度也隨之提高，這是很有利的結(jié)果。

4、固定化酶（細(xì)胞）的最適溫度的變化

固定化酶的表觀米氏常數(shù)Km隨載體的帶電性能變化。簡單說，由于高級結(jié)構(gòu)變化及載體影響引起酶與底物親和力變化，從而使Km變化。而這種Km變化又受到溶液中離子強(qiáng)度影響：離子強(qiáng)度升高，載體周圍的靜電梯度逐漸減小，Km變化也逐漸縮小以至消失。5、米氏常數(shù)Km的變化三、固定化酶的制備方法固定化酶的制備方法、制備材料多種多樣，不同的制備方法和材料，固定化后酶的特性不同。對于特定的目標(biāo)酶，要根據(jù)酶自身的性質(zhì)、應(yīng)用目的、應(yīng)用環(huán)境來選擇固定化載體和方法。（1）必須注意維持酶的構(gòu)象，特別是活性中心的構(gòu)象。酶的催化反應(yīng)取決于酶本身蛋白質(zhì)分子所特有的高級結(jié)構(gòu)和活性中心，為了不損害酶的催化活性及專一性，酶在固定化狀態(tài)下發(fā)揮催化作用時，既需要保證其高級結(jié)構(gòu)，又要使構(gòu)成活性中心的氨基酸殘基不發(fā)生變化。在具體選擇時，一般應(yīng)遵循以下幾個原則。

（2）酶與載體必須有一定的結(jié)合程度。酶的固定化既不影響酶的原有構(gòu)象，又能使固定化酶能有效回收貯藏，利于反復(fù)使用。（3）固定化應(yīng)有利于自動化、機(jī)械化操作。這要求用于固定化的載體必須有一定的機(jī)械強(qiáng)度，才能使之在制備過程中不易破壞或受損。（4）固定化酶應(yīng)有最小的空間位阻。固定化應(yīng)盡可能不妨礙酶與底物的接近，以提高催化效率和產(chǎn)物的量。（5）固定化酶應(yīng)有最大的穩(wěn)定性。在應(yīng)用過程中，所選載體應(yīng)不和底物、產(chǎn)物或反應(yīng)液發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。（6）固定化酶的成本適中。工業(yè)生產(chǎn)必須要考慮到固定化成本，要求固定化酶應(yīng)是廉價的，以利于工業(yè)使用。酶的固定化方法主要可分為四類：吸附法、包埋法、共價鍵結(jié)合法和交聯(lián)法等。吸附法和共價鍵結(jié)合法又可統(tǒng)稱為載體結(jié)合法。吸附法吸附法是通過載體表面和酶分子表面間的次級鍵相互作用而達(dá)到固定目的的方法，是固定化中最簡單的方法。酶與載體之間的親和力是范德華力、疏水相互作用、離子鍵和氫鍵等。吸附法又可分為物理吸附法和離子吸附法。

（1）物理吸附法物理吸附法是通過物理方法將酶直接吸附在水不溶性載體表面上而使酶固定化的方法。是制備固定化酶最早采用的方法，如α-淀粉酶、糖化酶、葡萄糖氧化酶等都曾采用過此法進(jìn)行固定化。物理吸附法制備固定化酶，操作簡單、價廉、條件溫和，載體可反復(fù)使用，酶與載體結(jié)合后，活性部位及空間構(gòu)象變化不大，故所制得的固定化酶活力較高。（2）離子吸附法離子吸附法是將酶與含有離子交換基團(tuán)的水不溶性載體以靜電作用力相結(jié)合的固定化方法，即通過離子鍵使酶與載體相結(jié)合的固定化方法。此法固定的酶有葡萄糖異構(gòu)酶、糖化酶、β-淀粉酶、纖維素酶等，在工業(yè)上用途較廣。離子吸附法所使用的載體是某些離子交換劑。常用的陰離子交換劑有DEAE-纖維素、混合胺類(ECTEOLA)-纖維素、四乙氨基乙基(TEAE)-纖維素、等；陽離子交換劑有羧甲基(CM)-纖維素、纖維素檸檬酸鹽等。其吸附容量一般大于物理吸附劑。離子吸附法具有操作簡便、條件溫和、酶活力不易喪失等優(yōu)點。此外，吸附過程同時可以純化酶。包埋法包埋法是將酶包埋在高聚物的細(xì)微凝膠網(wǎng)格中或高分子半透膜內(nèi)的固定化方法。前者又稱為凝膠包埋法，酶被包埋成網(wǎng)格型；后者又稱為微膠囊包埋法，酶被包埋成微膠囊型。凝膠包埋法常用的載體有海藻酸鈉凝膠、角叉菜膠、明膠、瓊脂凝膠、卡拉膠等天然凝膠以及聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光交聯(lián)樹脂等合成凝膠或樹脂。（1）凝膠包埋法

微膠囊包埋即將酶包埋在各種高聚物制成的半透膜微膠囊內(nèi)的方法。它使酶存在于類似細(xì)胞內(nèi)的環(huán)境中，可以防止酶的脫落，防止微囊外的環(huán)境直接接觸，從而增加了酶的穩(wěn)定性。常用于制造微膠囊的材料有聚酰胺、火棉膠、醋酸纖維素等。（2）微膠囊包埋法共價鍵結(jié)合法共價鍵結(jié)合法是將酶與聚合物載體以共價鍵結(jié)合的固定化方法。（1）酶蛋白N末端的α-氨基或賴氨酸殘基的ε-氨基。（2）酶蛋白C末端的α-羧基、天門冬氨酸殘基的β-羧基以及谷氨酸殘基的γ-羧基。（3）半胱氨酸殘基的巰基。（4）絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基的羥基。（5）組氨酸殘基的咪唑基。（6）色氨酸殘基的吲哚基。（7）苯丙氨酸和酪氨酸殘基的苯環(huán)。交聯(lián)法交聯(lián)法是使用雙功能或多功能試劑使酶分子之間相互交聯(lián)呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固定化方法。由于酶蛋白的功能團(tuán)，如氨基、酚基、巰基和咪唑基，參與此反應(yīng)，所以酶的活性中心構(gòu)造可能受到影響，而使酶失活明顯。但是盡可能地降低交聯(lián)劑濃度和縮短反應(yīng)時間將有利于固定化酶活力的提高。常用的雙功能試劑有戊二醛、己二胺、異氰酸衍生物、雙偶氮聯(lián)苯和N,N′-乙烯雙順丁烯二酰亞胺等，其中使用最廣泛的是戊二醛。戊二醛和酶蛋白中的游離氨基發(fā)生Schiff反應(yīng)，形成薛夫堿，從而使酶分子之間相互交聯(lián)形成固定化酶。以上四種固定化酶方法各有其優(yōu)缺點（見表4-1）。三、影響固定化酶（細(xì)胞）性質(zhì)的因素

分配效應(yīng)空間障礙效應(yīng)擴(kuò)散限制效應(yīng)

由于載體和底物的性質(zhì)差異引起了微環(huán)境和宏觀環(huán)境之間的性質(zhì)不同。微環(huán)境是在固定化酶附近的局部環(huán)境，而將主體溶液稱為宏觀環(huán)境。1、分配效應(yīng)

由這種不同造成的底物、產(chǎn)物和各種效應(yīng)物在兩個環(huán)境之間的不同分配，被稱為分配效應(yīng)。

固定化之后，由于酶的空間自由度受到限制(因為載體的空隙太小，或者固定化方式與位置不當(dāng)，給酶的活性部位造成了空間屏障)，使酶分子的活性基團(tuán)不易于底物或效應(yīng)物接觸，影響酶分子的分子活性中心對底物的定位作用,所造成的對固定化酶的活力的影響效應(yīng)，被稱為空間障礙效應(yīng)。

2、空間障礙效應(yīng)1）外擴(kuò)散阻力是底物從宏觀環(huán)境向酶顆粒表面?zhèn)鬟f過程中的一種擴(kuò)散限制效應(yīng)，它發(fā)生在反應(yīng)之前，發(fā)生在固定化顆粒周圍的液膜層。它會使底物在固相酶周圍形成濃度梯度，通過增加攪拌速度和底物流速的方法可以減少外擴(kuò)散效應(yīng)。3、擴(kuò)散限制效應(yīng)

酶固定化使生物催化反應(yīng)從均相轉(zhuǎn)化為多相，于是產(chǎn)生了擴(kuò)散阻力：2）內(nèi)擴(kuò)散阻力是指底物分子達(dá)到固相酶表面后傳遞到酶活性部位時的一種擴(kuò)散阻力，它與催化反應(yīng)同時進(jìn)行。載體小而彎曲的細(xì)孔是產(chǎn)生內(nèi)擴(kuò)散阻力的要原因。因此使用低分子量底物，小的粒徑、載體孔盡可能大而直且互相連通，或僅僅將酶固定在載體表面都可以降低這種內(nèi)擴(kuò)散阻力。第二節(jié)固定化細(xì)胞發(fā)酵一、定義?固定化細(xì)胞就是被限制自由移動的細(xì)胞，即細(xì)胞受到物理化學(xué)等因素約束或限制在一定的空間界限內(nèi)，但細(xì)胞仍保留催化活性并具備能被反復(fù)或連續(xù)使用的活力。是在酶固定化基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一項技術(shù)。?固定化細(xì)胞可以將微生物發(fā)酵改為連續(xù)酶反應(yīng)?可以獲得更高的細(xì)胞濃度；?細(xì)胞可以重復(fù)使用；?在高稀釋率時，不會產(chǎn)生洗脫現(xiàn)象；?單位容積的產(chǎn)率高；?提高遺傳穩(wěn)定性；?細(xì)胞不會受到剪切效應(yīng)的影響。?發(fā)酵液中菌體含量少，有利與產(chǎn)品的分離純化。二、固定化細(xì)胞的優(yōu)點1.與游離細(xì)胞相比?免去了破碎細(xì)胞提取酶的手續(xù)?酶在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性較高，完整細(xì)胞固定化后酶活性損失少?固定化細(xì)胞制備的成本比固定化酶低?無需輔酶再生2.與固定化酶相比?僅能利用胞內(nèi)酶；?細(xì)胞膜、細(xì)胞壁和載體都存在著擴(kuò)散限制作用；?載體形成的孔隙大小影響高分子底物的通透性；?可能有副反應(yīng)。三、固定化細(xì)胞的缺點1，按細(xì)胞類型分為三類：?微生物?動物?植物四、固定化細(xì)胞的分類?死細(xì)胞：完整細(xì)胞、細(xì)胞碎片、細(xì)胞器。適用于一種酶催化的反應(yīng)。?活細(xì)胞：增殖細(xì)胞、靜止細(xì)胞、饑餓細(xì)胞。適用于多酶反應(yīng)，特別是需要輔酶的反應(yīng)。2.按生理狀態(tài)分為兩大類Adsorption（吸附）

covalentbonding（共價結(jié)合）

Crosslinking（交聯(lián)）

Entrapment（包埋）

Encapsulation（微膠囊）五、細(xì)胞固定化的方法?利用載體和細(xì)胞表面所帶電荷的靜電引力，使細(xì)胞吸附于載體上。吸附法可分為物理吸附和離子吸附兩種。該法操作簡單，固定化過程對細(xì)胞活性影響小。吸附法1.原理?硅藻土?木屑?多孔玻璃?活性炭?多孔陶瓷?離子交換樹脂?塑料2.載體的材料Z-電位細(xì)胞的性質(zhì)和細(xì)胞壁的組成載體的性質(zhì)

pH3.影響吸附固定化的因素?利用細(xì)胞表面的反應(yīng)基團(tuán)（如氨基、羧基、羥基、巰基、咪唑基）與活化的無機(jī)或有機(jī)載體反應(yīng)，形成共價鍵將細(xì)胞固定。用該法制備的固定化細(xì)胞一般為死細(xì)胞。共價結(jié)合法?利用雙功能或多功能試劑與細(xì)胞表面的反應(yīng)基團(tuán)（如氨基、羧基、羥基、巰基、咪唑基）反應(yīng)