基因操作和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用

基因操作和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用基因操作的概念

基因操作的基本策略定義：在基因水平上進(jìn)行人工操作并改變其生物遺傳性的技術(shù)稱(chēng)基因操作。所采用的主要手段為DNA重組技術(shù)，主要程序是將DNA片段插入到質(zhì)粒、病毒等載體中，形成遺傳物質(zhì)的新組合，然后轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞產(chǎn)生新的表型?；虿僮骱推溽t(yī)學(xué)應(yīng)用WhatistheGene?

基因（gene）是核酸鏈上貯存遺傳信息的遺傳單位，是貯存有功能的蛋白質(zhì)多肽信息及表達(dá)這些信息所必需的全部核苷酸序列。基因操作和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用WhatistheGenome?

基因組（genome）指細(xì)胞或生物中，一套完整單倍體遺傳物質(zhì)的總和，包括全套基因及間隔序列。人類(lèi)基因組包含22條常染色體和XY兩條性染色體（核基因組）以及線粒體上的遺傳物質(zhì)（線粒體基因組）?；虿僮骱推溽t(yī)學(xué)應(yīng)用原核基因組和真核基因組真核生物基因組遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于原核生物的基因組，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，基因數(shù)龐大，具有許多復(fù)制起始點(diǎn)，每個(gè)復(fù)制子大小不一人類(lèi)染色體單倍體DNA全長(zhǎng)3×109bp，含3~4萬(wàn)個(gè)基因。大腸桿菌DNA全長(zhǎng)106bp，含4000個(gè)基因?；虿僮骱推溽t(yī)學(xué)應(yīng)用原核基因組

ProkaryoteGenome

基因組通常僅由一條環(huán)狀雙鏈DNA分子組成?；蚪M中只有1個(gè)復(fù)制起點(diǎn)?；蚪M中的重復(fù)序列很少，編碼蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因多為單拷貝。基本結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：?jiǎn)?dòng)子（promoter）、操縱基因（operator）、調(diào)控序列、結(jié)構(gòu)基因（structuregene）、終止子（terminator）?；蛐蛄惺沁B續(xù)的，無(wú)內(nèi)含子結(jié)構(gòu)連續(xù)密碼區(qū)mRNA→Protein基因操作和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用基本結(jié)構(gòu)：結(jié)構(gòu)基因（structuralgene）指能轉(zhuǎn)錄成為mRNA、rRNA或tRNA的DNA順序。結(jié)構(gòu)基因不連續(xù)，編碼序列被非編碼序列打斷，分割成幾段，編碼序列稱(chēng)為外顯子(exon)，其間的序列稱(chēng)為內(nèi)含子(intron),稱(chēng)為斷裂基因（splitgene）。

非編碼區(qū)剪切編碼區(qū)編碼區(qū)mRNAProtein

真核基因組

EukaryoteGenomeintronexonexon有大量重復(fù)序列基因操作和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用

獲取目的基因常常是基因操作的首要步驟?；瘜W(xué)合成法基因文庫(kù)法（或cDNA文庫(kù)法）

PCR法獲取目的基因基因操作和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用較短的基因（60-80bp）用途：PCR引物測(cè)序引物定點(diǎn)突變核酸雜交探針化學(xué)合成法基因操作和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用構(gòu)建不同的基因文庫(kù)通過(guò)核酸雜交的篩選或通過(guò)抗原抗體反應(yīng)的篩選基因文庫(kù)法獲取目的基因基因操作和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用

聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction,PCR）是在體外進(jìn)行的由引物介導(dǎo)的酶促DNA擴(kuò)增反應(yīng)。是獲取已知序列候選基因的主要方法。PCR法基因操作和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用PCR技術(shù)的基本過(guò)程模板DNAdNTP引物Buffer預(yù)變性模板DNAdNTP引物BufferTaqDNA聚合酶循環(huán)儀94oC5’94℃55℃72℃基因操作和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用基因重組基因操作的關(guān)鍵步驟和核心內(nèi)容關(guān)系到研究的成敗或質(zhì)量包括：基因分離，基因組合，基因轉(zhuǎn)化，基因篩選基因操作和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用分:基因操作和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用切:限制性?xún)?nèi)切酶

“分子手術(shù)刀”

基因操作和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用限制性核酸內(nèi)切酶命名Smith和Nathame命名原則（1973）

屬名+種名+株名+流水號(hào)

舉例：流感噬血桿菌d株

（Haemophilusinfluengaed）

HindⅠ

HindⅡ

HindⅢ5’AAGCTT3’

HindⅣ3’TTCGAA5’

基因操作和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用限制性核酸內(nèi)切酶

restrictionendonuclease

在特異位點(diǎn)上切割DNA分子分三類(lèi)，常用為Ⅱ類(lèi)酶識(shí)別序列呈回文對(duì)稱(chēng)（palindromesequence）5’GAATTC3’5’GGATCC3’

3’CTTAAG5’3’CCTAGG5’

基因操作和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用EcoRⅠ的識(shí)別序列5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’HaeⅠ的識(shí)別序列5’-GTTAAC-3’3’-CAATTG-5’基因操作和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用限制性核酸內(nèi)切酶酶切單酶切

用一種限制酶酶切目的基因和載體易發(fā)生自身連接雙酶切

用二種限制酶酶切目的基因和載體不易發(fā)生自身連接基因操作和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用接:“分子針線”基因操作和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用目的基因片段與載體的連接

★粘末端法：堿性磷酸酶退火★平接法：T4噬菌體DNA連接★接頭法：人工合成識(shí)別順序

★聚尾法：分別加連polyA(T)或G基因操作和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用

是獨(dú)立于許多細(xì)菌及某些真核細(xì)胞染色體外共價(jià)閉合環(huán)狀的雙鏈DNA分子，大小在1—200kb之間，能獨(dú)立復(fù)制的最小遺傳單位。質(zhì)粒（plasmid）基因操作和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用質(zhì)粒的分類(lèi)克隆載體(cloningvector,Puc18,19)都有松弛的復(fù)制子，能帶動(dòng)外源基因在宿主細(xì)胞中復(fù)制擴(kuò)增。帶有一些基本元件（ori,Ampr,Mcs等），用來(lái)克隆和擴(kuò)增基因片段。表達(dá)載體(Expressionvector,PET30a,pMV361)除了有克隆載體的基本元件，還具有轉(zhuǎn)錄/翻譯所必需的DNA順序。為了有效的轉(zhuǎn)錄，必需有強(qiáng)大的啟動(dòng)子(Trp,Lac)?；虿僮骱推溽t(yī)學(xué)應(yīng)用

重組DNA的轉(zhuǎn)化與增殖制備CompetenceCell（氯化鈣處理幼嫩E.coli,yeast,動(dòng)物cell,昆蟲(chóng).)C．Cell--——>”Hotshock”(42℃，2’)

——>L．B．Culture-->37℃，lhr．

-->LB．a(chǎn)gar．plate-->genomiclibrary．轉(zhuǎn):基因操作和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用1.陽(yáng)性重組體的篩選抗藥基因抗Ampicilin基因

Ampicilin敏感受體細(xì)胞＋

Ampicilin培養(yǎng)基↓未轉(zhuǎn)化菌落不能存活篩:

基因操作和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用2.顏色反應(yīng)

Lac+Polylinker+β-半乳糖苷酶Xgal藍(lán)色/白色利用基因操作和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用

3影印原位雜交（SituHybridization)菌落ＤＮＡ

硝酸纖維濾膜陽(yáng)性重組體原位固定重組探針雜交基因操作和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用4.斑點(diǎn)雜交(DotBlots)

已知重組DNA濾膜重組DNA同源性和特異性方陣打點(diǎn)陽(yáng)性重組DNA探針雜交基因操作的基本策略基因操作和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用5.southern雜交

DNA片段吸印重組探針雜交后處理基因操作和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用外源基因表達(dá)克隆基因在原核細(xì)胞中表達(dá)克隆基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)克隆基因在其它表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)昆蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)酵母表達(dá)系統(tǒng)基因操作和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用在原核表達(dá)體系（以Ecoli為代表）：優(yōu)點(diǎn)1.遺傳背景清楚,易于調(diào)控;2.表達(dá)技術(shù)經(jīng)典成熟,應(yīng)用廣泛,目前無(wú)以取代;3.目的基因表達(dá)水平高培養(yǎng)周期短，“物美價(jià)廉”.缺點(diǎn)1.缺少真核蛋白質(zhì)翻譯后加工修飾系統(tǒng),如剪切,糖基化,及正確二硫鍵形成等;2.表達(dá)蛋白質(zhì)多以包涵體形式存在,需經(jīng)復(fù)性才能恢復(fù)構(gòu)象與活性；3.宿主本身雜蛋白質(zhì)多,純化步驟復(fù)雜,故某些蛋白質(zhì),特別時(shí)糖蛋白或脂蛋白,酌情選擇真核表達(dá)載體。基因操作和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用真核表達(dá)體系（酵母、昆蟲(chóng)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞）

優(yōu)點(diǎn)：能轉(zhuǎn)錄后加工，即能剪接內(nèi)含子；能翻譯后加工，即能糖基化修飾等；通常不形成包涵體，能正確折疊。

缺點(diǎn)：但技術(shù)難度較大，成本較高，表達(dá)量較低?；虿僮骱推溽t(yī)學(xué)應(yīng)用轉(zhuǎn)基因和基因治療基因操作和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用

轉(zhuǎn)基因和基因治療

1．概念和研究現(xiàn)狀

2．基因治療的基本類(lèi)型

3．轉(zhuǎn)基因的基本方法

4.轉(zhuǎn)基因的表達(dá)和調(diào)控

5．基因治療的運(yùn)用和前景內(nèi)容提綱基因操作和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用

基因治療是以正?；蛱娲蛑脫Q靶細(xì)胞染色質(zhì)基因組中的致病基因從而產(chǎn)生新表型的治療方法。轉(zhuǎn)基因技術(shù)則是將目的基因?qū)氚屑?xì)胞以建立治療效應(yīng)的方法和過(guò)程。轉(zhuǎn)基因及基因治療基本概念基因操作和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用轉(zhuǎn)基因及基因治療基因治療的程序目的基因轉(zhuǎn)基因基因表達(dá)基因治療viralnonviralInvivoexvivo體內(nèi)調(diào)控基因操作和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用基因治療的基本類(lèi)型

★細(xì)胞介導(dǎo)的基因治療(exVivo)是當(dāng)前較常用的形式。是選用適當(dāng)?shù)陌屑?xì)胞載體外進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移，篩選陽(yáng)性細(xì)胞重新移植入體內(nèi)?？捎迷蚣?xì)胞系進(jìn)行。但靶細(xì)胞存活較短暫（Transit)?；虿僮骱推溽t(yī)學(xué)應(yīng)用★體外表達(dá)基因治療(inVitro)

是傳統(tǒng)的基因表達(dá)形式?；虿僮骱推溽t(yī)學(xué)應(yīng)用1、病毒法(Viral)1)逆轉(zhuǎn)錄病毒(Restrovirus)RNA病毒，結(jié)構(gòu)缺陷

PackagingCell轉(zhuǎn)基因及基因治療轉(zhuǎn)基因的基本方法基因操作和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用★體內(nèi)直接轉(zhuǎn)基因治療（inVivo）轉(zhuǎn)基因及基因治療基因治療的基本類(lèi)型

是最有前途的方式。已在肝、氣管、肌肉、乳腺、腹腔動(dòng)、靜脈初獲成功。效果持久。但轉(zhuǎn)移和表達(dá)效率低。基因操作和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用優(yōu)勢(shì)：①整合率高;②對(duì)外源DNA影響小;③單拷貝整合，利于表達(dá)調(diào)控；④安全。轉(zhuǎn)基因及基因治療轉(zhuǎn)基因的基本方法基因操作和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用劣勢(shì)：①容量小;②只能感染分裂活躍細(xì)胞，體外(Exvivo)轉(zhuǎn)基因;③Transiteexpression;④R.V.+P.C+P.C實(shí)驗(yàn)室要求高。轉(zhuǎn)基因及基因治療轉(zhuǎn)基因的基本方法基因操作和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用2）腺病毒(Adenovirus)

腺相關(guān)病毒(Adenoassociatedvirus)DNA病毒

E1和E3基因缺乏

263細(xì)胞系生長(zhǎng)轉(zhuǎn)基因及基因治療轉(zhuǎn)基因的基本方法基因操作和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用特點(diǎn)：①能感染靜止細(xì)胞，體內(nèi)(invivo)轉(zhuǎn)基因②對(duì)某些細(xì)胞類(lèi)型特別親和力，利于局部基因治療③包容量大④尚無(wú)PackagingCell，欠安全⑤有較強(qiáng)免疫原性，易引起體內(nèi)免疫反應(yīng)轉(zhuǎn)基因及基因治療轉(zhuǎn)基因的基本方法基因操作和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用2、非病毒法(Nonviral)1）顯微注射法(Microinjection)2)基因定位整合技術(shù)(Genetargeting)3)受體介導(dǎo)(Receptor-mediatedmethods)4)組織內(nèi)直接注射(DirectinjectionofDNA)5)磷酸鈣沉淀法(CaPO4precipitation)轉(zhuǎn)基因及基因治療轉(zhuǎn)基因的基本方法基因操作和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用1、腫瘤的基因治療

1)腫瘤的免疫基因治療．★載體細(xì)胞靶向表達(dá)細(xì)胞因子載體細(xì)胞:腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(TILs)

淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞(LAKs)

細(xì)胞因子:IL-1,2,4,6,7,IFNs，TNF-α,CSF?！锬[瘤疫苗:改變腫瘤細(xì)胞免疫原性，誘導(dǎo)強(qiáng)烈免疫反應(yīng)轉(zhuǎn)基因及基因治療基因治療的應(yīng)用基因操作和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用2)反義技術(shù)抑制腫瘤基因功能人工合成癌基因DNA或RNA(mRNA)互補(bǔ)寡核苷酸，“封閉”癌基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯。轉(zhuǎn)基因及基因治療基因治療的應(yīng)用基因操作和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用3)病毒導(dǎo)向酶解藥物前體療法(VDEPT)---“自殺基因”(Suicidegene)

該基因編碼的酶能活化無(wú)毒藥物前體殺傷該酶所在的細(xì)胞。將“自殺基因”轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞，使用對(duì)正常細(xì)胞無(wú)毒藥物前體，選擇殺傷腫瘤細(xì)胞。轉(zhuǎn)基因及基因治療基因治療的應(yīng)用基因操作和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用轉(zhuǎn)基因及基因治療基因治療的應(yīng)用(肝癌細(xì)胞）單純皰疹胸苷激酶(HSV-Tk)甲氧嘌呤阿拉伯糖苷AM(D.T)

阿拉伯糖苷酸殺傷肝癌細(xì)胞（無(wú)毒前體）活化基因操作和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用2．傳染病基因治療

1）刺激更強(qiáng)的機(jī)體抗HIV免疫反應(yīng)轉(zhuǎn)基因及基因治療基因治療的應(yīng)用(HIV患者