07 流式應用研究進展1112

鄭芳流式分子技術（流式細胞術）應用研究進展流式細胞術(flowcytometry,FCM)

是用流式細胞儀測量液相中懸浮細胞或微粒的一種現(xiàn)代分析新技術,能快速、精確的對單個細胞理化特性進行多參數(shù)定量分析和分選。它是眾多不同學術背景、不同科技領域相結合的結晶。它是物理學、生物學、醫(yī)學等綜合運用的產(chǎn)物。流式細胞術2流式細胞術最大的特點是能在保持細胞及細胞器或微粒的結構及功能不被破壞的狀態(tài)下，通過熒光探針的協(xié)助，從分子水平上獲取多種信號對細胞進行定量分析或純化分選。細胞不被破壞，測量快速、大量、準確、靈敏、定量流式細胞術的特點3從流式細胞術的發(fā)明、發(fā)展直到今天在各個領域應用的拓展,每一步都是諸如電子技術、流體力學、計算機科學、激光技術、生物學、生物技術、高等數(shù)學、臨床醫(yī)學、分子生物學、有機化學和生物物理學等學科知識綜合運用的結晶?，F(xiàn)代流式細胞術更是由于它結合單克隆抗體技術、定量細胞化學技術和定量熒光細胞化學,使其在生物學、臨床醫(yī)學、藥物學、材料學等眾多研究領域中的應用有更加突飛猛進的發(fā)展。流式細胞術4

流式細胞儀是測量染色細胞標記物熒光強度的細胞分析儀，是在單個細胞分析和分選基礎上發(fā)展起來的對細胞的物理或化學性質(zhì)（如大小、內(nèi)部結構、DNA、RNA、蛋白質(zhì)、抗原等）進行快速測量并可分類收集。流式細胞術5流式細胞術6細胞組成細胞功能大小細胞表面/胞漿/核--特異性抗原粒度細胞活性DNA,RNA含量胞內(nèi)細胞因子蛋白質(zhì)含量激素結合位點鈣離子,PH值,膜電位酶活性流式細胞儀常檢測的細胞特性7采用激光作為激發(fā)光源，保證其具有更好的單色性與激發(fā)效率；利用熒光染料與單克隆抗體技術結合的標記技術，保證檢測的靈敏度和特異性；用計算機系統(tǒng)對流動的單細胞懸液中單個細胞的多個參數(shù)信號進行數(shù)據(jù)處理分析，保證了檢測速度與統(tǒng)計分析精確性。工作原理8流式細胞術流式細胞術的基本原理910

前向散射光（forwardscatter,FSC）：激光束照射細胞時，光以相對軸較小角度(0.5°～10°)向前方散射的訊號用于檢測細胞等粒子的表面屬性，信號強弱與細胞體積大小成正比。11

側(cè)向散射光（sidescatter,SSC）：激光束照射細胞時，光以90°角散射的訊號，用于檢測細胞內(nèi)部結構屬性。12 測得的FSC與SSC信號通過計算機處理，可得到FS-SS圖，由此可僅用散射光信號對未染色的活細胞進行分析或分選。此為血細胞分類的基本原理，但不能分析表面分子。光散射測量最有效用途：從非均一群體中鑒別出某些亞群

13熒光信號由被檢細胞上標記的特異性熒光染料受激發(fā)后產(chǎn)生，發(fā)射的熒光波長與激發(fā)光波長不同。每種熒光染料會產(chǎn)生特定波長的熒光和顏色，通過波長選擇通透性濾片，可將不同波長的散射光和熒光信號區(qū)分開，送入不同的光電倍增管。選擇不同的單抗及染料就可同時測定一個細胞上的多個不同特征。線性放大器和對數(shù)放大器熒光測量14熒光染料的特性激發(fā)波長(EXCITING)發(fā)射波長(EMISSION)15FSC：反映顆粒的大小SSC：反映顆粒的內(nèi)部結構復雜程度FL：反映顆粒被染上的熒光數(shù)量多少參數(shù)16D1

CD4+/CD3-D2

CD4+/CD3+D3

CD4-/CD3-D4

CD4-/CD3+如十字門分析時，起就可以由四個區(qū)域構成，即G=D1+D2+D3+D4。

17免疫細胞的檢測免疫細胞的分離流式細胞術18免疫細胞的檢測19免疫細胞的檢測免疫細胞的計數(shù)T細胞及其亞群Th細胞亞群B細胞NK細胞20

CellsurfacemarkersIntracellularcytokinesSortingtoisolatecellpopulations流式細胞儀的基本應用21流式細胞術流式細胞術發(fā)展趨勢:

①流式細胞儀從單純大型儀器發(fā)展為適應各種實際應用的便攜式、臺式、分辨率、高質(zhì)量分選的研究型流式細胞儀;②對流式細胞術檢測熒光參數(shù),從采用熒光單色、雙色分析發(fā)展為多色分析,目前最多可同時檢測15種熒光信號;③從檢測參數(shù)的相對定量發(fā)展為絕對定量;④從檢測參數(shù)的手動人工分析發(fā)展為利用計算機軟件的自動分析;⑤所采用的熒光試劑,從非配套試劑發(fā)展為配套的試劑盒試劑222325流式細胞術目前已廣泛地被應用于免疫學基礎研究和逐步進入臨床應用各方面，用流式細胞儀對細胞表面的抗原成分進行標記分析，可區(qū)別多種細胞的特性，為細胞免疫的研究增加了有效的手段和幫助。流式細胞術在臨床中的應用26流式細胞儀的臨床應用HIV免疫分型，CD4絕對計數(shù)淋巴細胞亞群分析白血病和淋巴瘤的免疫分型腫瘤的細胞周期和倍體分析網(wǎng)織紅細胞計數(shù)細胞移植的免疫狀態(tài)監(jiān)測干細胞計數(shù)陣發(fā)性血紅蛋白尿HLA-B27檢查血小板功能及相關疾病27T淋巴細胞及其亞群分析

Th(CD3+CD4+CD8-T);Tc(CD3+CD4-CD8+T)B淋巴細胞及其亞群分析

B1(CD19+CD5+):產(chǎn)生IgM型自身抗體,參與免疫調(diào)節(jié)、與自身免疫病的發(fā)生有關

B2(CD19+CD5-):受外來抗原刺激,產(chǎn)生高親和性特異性抗體NK細胞分析

NK(CD3-CD16+CD56+)一、淋巴細胞及其亞群的分析28細胞介導細胞毒性試驗(死細胞與活細胞比例)細胞內(nèi)細胞因子測定二、淋巴細胞功能分析29三、淋巴造血系統(tǒng)及白血病免疫分型對淋巴瘤和白血病進行多色免疫分型用于選擇化療方案、判斷預后及檢出微小殘留病變30CD4+Th細胞、CD4+/CD8+比例

MDR(+)表示對化療藥物耐藥四、腫瘤耐藥基因分析五、AIDS病檢測中的應用31HLA-B27可出現(xiàn)在58%～97%的強直性脊椎炎(As)患者 六、自身免疫病相關HLA抗原分析32流式細胞儀的科研應用免疫功能研究（淋巴細胞亞群分析、細胞活化、細胞因子）磷酸化蛋白的檢測干細胞研究/樹突細胞研究細胞功能研究（細胞內(nèi)PH值、細胞內(nèi)鈣離子流、細胞膜電位、線粒體膜電位）血小板分析（心腦血管疾?。┠[瘤相關基因表達的研究抗腫瘤藥物作用機制以及多藥耐藥性的研究細胞周期和倍體分析細胞凋亡及凋亡相關蛋白轉(zhuǎn)染&基因沉默效率檢測細胞分選、分選后培養(yǎng)及相關生物學研究33近期流式應用研究進展細胞因子檢測樹突狀細胞調(diào)節(jié)性T細胞34細胞因子檢測細胞活化細胞數(shù)目增殖細胞表面表達活化標記分泌細胞因子36細胞因子病毒、細菌寄生蟲、過敏源37細胞因子相關的主要研究領域腫瘤腎炎感染（SARS/禽流感）自身免疫病超敏反應移植排斥反應免疫缺陷病血液疾病基于細胞水平的研究胞內(nèi)因子胞外因子38胞內(nèi)因子測定原理：

未活化的細胞所分泌的細胞因子很少，很難在流式細胞儀上檢測。需用刺激劑PMA+Ionomycin等激活細胞分泌細胞因子，為了阻止產(chǎn)生的細胞因子分泌到細胞外，需要同時加入BrefedlinA或Monensin等共孵育細胞，使胞內(nèi)細胞因子蓄積。胞內(nèi)染色前需用多聚甲醛固定，保留細胞形態(tài)完整性和胞內(nèi)物質(zhì)抗原性，隨后用皂角苷（破膜劑）增加細胞膜通透性，使細胞因子特異性抗體滲入到胞內(nèi)，達到流式細胞儀檢測目的。39樹突狀細胞

（dendriticcell，DC）DC的生物學特點DC因其具有膜樣或樹突樣突起而得名DC包括郎罕氏細胞、間隙DC、濾泡DC（FDC）、并指DC（IDC）等等。其在體內(nèi)含量甚微，僅占外周血單個核細胞（PBMC）的1％以下，但分布非常廣泛，在血液、肝、脾、淋巴結及非免疫器官組織中都有存在。41DC的生物學功能是一類抗原呈遞細胞（APC），將抗原遞呈給特殊的初始T淋巴細胞，引發(fā)初次免疫反應，在誘導免疫耐受和調(diào)控免疫活性方面扮演著重要角色，是機體內(nèi)惟一能激活初始T細胞的APC。通過激活巨噬細胞，NK細胞和嗜酸性粒細胞引發(fā)機體對入侵感染因素的反應，連接天然免疫系統(tǒng)和適應性免疫系統(tǒng)受細胞因子調(diào)控的同時,本身也可產(chǎn)生多種細胞因子,如IFN-α,IL-12,GM-CSF,IL-1,IL-6和TNF-α等42DC的表面標志人DC的主要特征性表面標志為CD1a和CD83，CD83還是DC充分成熟的標志。成熟DC高表達CD80（B7-1），CD86，CD40和CD54等共刺激分子，而未成熟DC不表達或低表達這些分子未成熟DC具有強大的內(nèi)吞作用，并高表達大多數(shù)趨化因子受體43DC的表面標志所有DC共同的突出特點是能高水平表達MHC-II類分子如HLA-DR。DC成熟過程突出的標志是MHC-II類分子的重分布，從主要在細胞漿內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)橹饕诩毎け砻?4體外人DC制備前體DC來源外周血單個核細胞/單核細胞密度梯度離心BD?IMagCellSeparationSystem骨髓、新生兒臍帶血的CD34+細胞在細胞因子（如GM-CSF，IL-4和TNF-α）的作用下誘導DC體外分化45DC體外誘導分化46樹突狀細胞分泌的細胞因子DC分泌的細胞因子有很多種，但各種細胞因子與DC功能的相關性尚在探討中47DC臨床和科研應用1腫瘤發(fā)生發(fā)展機制的探討腫瘤通過分泌免疫抑制性細胞因子阻止DC成熟，并降低抗原遞呈能力導致機體的免疫耐受，使腫瘤細胞逃避宿主免疫反應。DC瘤苗研發(fā)將經(jīng)腫瘤抗原在體外沖擊致敏的DC回輸體內(nèi)，再與自體T細胞共育，有利于打破免疫耐受，有效誘導CTL介導的特異性抗腫瘤免疫應答。已用于黑色素瘤，前列腺癌，腎癌，多發(fā)性骨髓瘤，淋巴瘤，肝癌，婦科腫瘤，惡性腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤等的臨床治療實驗48DC臨床和科研應用2病毒感染背景：DCs的功能缺陷也是病毒逃避宿主免疫反應的重要機制，很多病毒的持續(xù)性感染（如HBV，HIV）均伴有不同程度的DCs數(shù)量減少，表型不成熟（如共刺激分子表達水平下降）及功能的下降，造成感染的免疫耐受，使感染慢性化與對照組和HBV攜帶者相比，慢性乙型肝炎患者外周血PDC單位數(shù)量和功能下降，且PDC數(shù)量隨病程進展而進行性下降49DC與HIVTheJournalofImmunology,2002,168:4796–4801.PDC↓↓MDC--50DC臨床和科研應用3移植物抗宿主反應抑制受者體內(nèi)DC的成熟，使DC表面的共刺激分子表達下調(diào)，抗原呈遞能力減弱，從而有助于誘導同種移植免疫耐受，延長移植器官存活時間。過敏和超敏反應肺DC&哮喘：皮膚、腸道和氣道中的MDC為未成熟形式，捕捉外來抗原后，攜帶抗原由外周血遷移到肺，12h內(nèi)即可在肺縱隔淋巴結的T細胞區(qū)出現(xiàn)肺DC，因此在吸入抗原刺激6～24h后MDC在血液中的數(shù)量迅速下降，誘導Th2分化（在兒童和特應性成人個體中肺呼吸道對吸入抗原的反應傾向于Th2）自身免疫性疾病51調(diào)節(jié)性T細胞調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）是一類具有獨特免疫調(diào)節(jié)功能的T細胞亞群，可分為：天然存在的Treg誘導產(chǎn)生的Treg調(diào)節(jié)性T分類及生物學特征53天然存在的Treg表型為CD4+CD25int/hiFoxP3+，1995年由Sakaguchi等首次報道，是研究最多的調(diào)節(jié)性T細胞，是由胸腺T細胞在胸腺內(nèi)經(jīng)自身抗原刺激后、經(jīng)陽性選擇自然分化發(fā)育形成的，在小鼠和正常人的外周血及脾臟組織中天然存在的CD4+CD25+Treg約占CD4+T細胞群體的5-10%；調(diào)節(jié)性T分類及生物學特征54天然存在的TregCD4+CD25+Treg一定要經(jīng)TCR介導信號的刺激才能活化，活化后主要通過接觸抑制方式、粒酶B依賴性的細胞殺傷作用抑制CD4+及CD8+T細胞的活化和增殖，從而抑制免疫反應CD25是IL-2R的α鏈FOXP3（ForkheadboxproteinP3）是天然CD4+CD25+Treg細胞相對特異性的蛋白標記，表達于胞內(nèi)，該轉(zhuǎn)錄因子可調(diào)控Treg細胞發(fā)育并維持其免疫抑制功能。調(diào)節(jié)性T分類及生物學特征55誘導產(chǎn)生的Treg