總谷胱甘肽(T-GSH)檢測試劑盒(DTNB速率比色法)

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總谷胱甘肽(T-GSH)檢測試劑盒(DTNB速率比色法)寫為G-SH或GSH(GSSG)，其存在形式會隨著細胞內代謝的情況而發(fā)生相互轉變。(T-GSH(DTNB)(TotalGlutathioneAssay(T-GSHG還原成的H和樣品本身含有的GSH都與發(fā)色底物DTNB反應，生成黃色的TNB和GSSG。前后兩個反應合并起來，總谷胱甘肽(GSSG+GSH)就相當于一個呈色的限速反應，總谷胱甘肽(T-GSH)含量決定了黃GSH標準比較，獲得樣品的總谷胱甘肽(T-GSH)即(GSSG+GSH)含量?？捎糜跈z測血漿、血清、組織、細胞等樣編號TO1049編號TO1049Storage名稱100T試劑(A):還原型谷胱甘肽(GSH)標準10mg4℃避光試劑(B):GSHassaybuffer250mlRT試劑(C):DTNB40mgRT避光試劑(D):蛋白沉淀劑4gRT避光試劑(E):NADPH10mg-20℃避光試劑(F):DMSO1.5mlRT避光試劑(G):ddH2O50mlRT避光試劑(H):GSH還原酶原液90μl-20℃避光使用說明書1份自備材料：北京雷根生物技術有限公司1、離心管或小試管2、蒸餾水3、離心機4、水浴鍋5、96孔板6、酶標儀或生化分析儀操作步驟(僅供參考)：1、配制GSH標準儲存液：取還原型谷胱甘肽(GSH)標準加入ddH2O，溶解并混勻，即為還原型GSH標準儲存液(10mM)。一部分立即使用，其余適當分裝后-20℃保存。2、配制BB中加入儲存液(40mg/ml-20℃保存。3、配制50×GSH還原酶：按GSH還原酶原液：GSHassaybuffer混合，即為50×GSH還原酶。-20℃保存，3個月有效。4、配制T-GSH檢測工作液：按下表配制T-GSH檢測工作液。GSHassaybuffer1個樣品1.6ml10個樣品16ml50個樣品80mlDTNB儲存液5μl50μl250μl50×GSH還原酶43.2μl432μl2160μl5、配制蛋白沉淀工作液：在本試劑盒提供的蛋白沉淀劑中加入ddH2O，配制成5%的水溶液，即為蛋白沉淀工作液，4℃保存。6、配制標準品：把還原型GSH標準儲存液(10mM)用蛋白沉淀工作液稀釋成標準溶液。然后依次稀釋成25151052μMGSH5025151052μMGSH標準溶液6個點做標準曲線。注意：由于GSHGSH7、配制NADPH工作液：在本試劑盒提供的10mgNADPH中加入1mlddH2O，溶解并混勻，即為NADPH儲存液(10mg/ml)。一部分立即使用，其余適當分裝后-20℃保存。取按NADPH儲存液(10mg/ml)加入GSHassaybuffer，充分混勻，即為NADPH工作液(0.12mg/ml)。8、準備樣品：清為血漿。對于紅細胞，用PBS洗滌兩次。取約紅細胞沉淀或血漿，加入蛋白沉淀工Vortex4℃或冰浴放置(T-GSH)測定，樣品需暫時4℃保存?zhèn)溆茫涣⒓礈y定的樣品可以-70℃保存，但不宜超過1010北京雷根生物技術有限公司而對于血漿樣品，應直接取進行測定。②組織樣品的制備：取組織用液氮速凍，迅速研磨，加入300μl蛋白沉淀工作液，充分x4℃孵育4℃離心10min(T-GSH)測定。樣品需暫時4℃保存?zhèn)溆?，不立?70℃保存，但不宜超過10天。對于處理好的組織樣品通常需用蛋白沉淀工作液進行適當稀釋后再進行測定，稀釋倍數(shù)通常為5～20洗滌細胞1次，離心收集細胞，吸盡上清。加入細胞沉淀3倍體積的蛋白沉淀工作液，充分Vortex10ml℃或冰上孵育5min品需暫時4-7010天。對于處理好的組織樣品通常需用蛋白沉淀工作液進行適當稀釋后再進行測定室溫或25℃孵育5min。NADPH工作液(0.12mg/ml)室溫或25℃孵育5min。NADPH工作液(0.12mg/ml)加入物(ml)空白管標準管測定管蛋白沉淀工作液0.08——系列標準品(2～50μM)—0.08—待測樣品——0.08GSH檢測工作液10、T-GSH檢測：立即用酶標儀或自動生化分析儀于處每隔檢測一次，空白管調零，共檢測6min(亦可加入NADPH工作液反應6min后檢測，只檢測1次)，以檢測其反應速率ΔA/min。如果酶標儀不能檢測410nm，可測定405～420nm處吸光度。計算：①動力學測定法：根據(jù)不同時間點測定得到的吸光度值計算出，以GSH標準的濃度(50、25、15、10、5、2μM)為橫坐標，以ΔA410/min為縱坐標，做出標準曲線。根據(jù)待測的的使用量，可以計算出每毫克組織或細胞中的總谷胱甘肽的含量，通過測定蛋白濃度，從而計算出樣品的蛋白量，最后計算出每mg蛋白中總谷胱甘肽的含量。北京雷根生物技術有限公司即反應6min僅測定1GSH標準的濃度251510、52μM)為橫坐標，以為縱坐標，做出標準曲線。樣品對照標準曲線即可計算出總谷胱甘肽的含量。終點測定法比動力學法快捷。根據(jù)樣品的稀釋倍數(shù)mg蛋白中總谷胱甘肽的含量。成年全血GSH1.02～mmol/L成年全血GSH1.02～mmol/L注意事項：1、GSH比較穩(wěn)定，血液樣品以ACD抗凝后冰箱4℃保存，3～4周內穩(wěn)定。2、請盡量用新鮮的細胞進行測定，而不要使用凍存的細胞進行測定，避免使酶活性下降。3、全血GSH與吸煙和鍛煉成正比。4、測定各孔時，各孔溫度均需達到室溫或25℃，否則影響結果。5、輕度溶血樣本對GSH測定無影響。6、為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一