新分子學(xué)技術(shù)在產(chǎn)前診斷非整倍性染色體疾病中的應(yīng)用

新分子學(xué)技術(shù)在產(chǎn)前診斷非整倍性染色體疾病中的應(yīng)用SOGC【摘要】目的綜述分子學(xué)技術(shù)在快速產(chǎn)前診斷胎兒非整倍性染色體疾病中的應(yīng)用進展,及尚處于研發(fā)階段的新性技術(shù).局限性本文僅初步探討了快速非整倍性染色體疾病診斷的方案.證據(jù)來源MEDLINE數(shù)據(jù)庫1992年至今的相關(guān)文獻,本文提供其摘要信息.證據(jù)價值本報道所涉及技術(shù)進展由加拿大婦產(chǎn)科學(xué)會基因委員會提供,由加拿大婦產(chǎn)科學(xué)會執(zhí)行委員會批準.收益、風險及成本本進展提供了分子學(xué)技術(shù)快速診斷非整倍性染色體疾病的方法,以及支持上述技術(shù)在胎兒產(chǎn)前診斷臨床應(yīng)用的證據(jù).此類方法在診斷胎兒非整倍性染色體疾病方面具有可靠、低成本的特點,但在診斷整倍體性的染色體畸變等疾病方面,部分疾病雖然臨床特征很顯著,這些分子學(xué)技術(shù)仍顯示出不足之處.【期刊名稱】《中國產(chǎn)前診斷雜志（電子版）》【年(卷),期】2010(002)003【總頁數(shù)】5頁(P55-59)【作者】SOGC【作者單位】【正文語種】中文簡要說明目前可利用的非整倍性染色體疾病快速診斷（RAD）方法包括熒光原位雜交（FISH）及定量熒光聚合酶鏈反應(yīng)（QF-PCR）。多樣性連接依賴的探針擴增技術(shù)（MLPA）是仍處于研究階段的新技術(shù)。FISHQF-PCR（MLPA），在細胞遺傳學(xué)全核型分析方面擁有相似的敏感性和特異性（13、18、21色體的“金標準”）。MLPA和QF-PCR技術(shù)的優(yōu)勢在于顯著地降低了檢測時間，且自動化檢測批量樣本使得單位樣本的檢測費用大大降低。FISH技術(shù)難以做到自動化，仍比PCR技術(shù)檢測費用高。目前非整倍性染色體疾病快速診斷（RAD）方法的主要缺陷是無法檢測目標染色體除了非整數(shù)倍性染色體疾病以外的染色體畸變。其中一些疾病在臨床上可預(yù)測有一定的發(fā)病率。未來，RAD技術(shù)可能適合胎兒非整倍體畸形風險增加而需侵入性診斷明確的孕婦，但不適合有其他風險如B超提示的胎兒結(jié)構(gòu)異?；蛴腥旧w重排（如平衡易位）的個人或家族史者。此類孕婦仍需進行細胞遺傳學(xué)全核型分析。在產(chǎn)前診斷中引入這項新技術(shù)時應(yīng)該綜合分析它所帶來的風險、收益和成本。RAD色體疾病的診斷。本文僅綜述該領(lǐng)域當前的臨床和科學(xué)研究進展。文中所涉及內(nèi)容不應(yīng)作為授課內(nèi)容或成為指導(dǎo)臨床治療和操作的依據(jù)。各地學(xué)術(shù)機構(gòu)可以對本文內(nèi)容和觀點做修正。若根據(jù)當?shù)厮胶颓闆r作相應(yīng)修正的，需做好備案或記錄。若未獲得SOGC組織書面許可，禁止以任何形式復(fù)制本文內(nèi)容。引言加拿大預(yù)防及健康中心推薦產(chǎn)前篩查染色體疾病，特別是對唐氏綜合征的篩查，并允許孕婦自己做出是否繼續(xù)妊娠的選擇［1］。通過羊水穿刺或絨毛膜活檢技術(shù)進行的檢查有0.5%的流產(chǎn)風險，且上述技術(shù)受到有限公共醫(yī)療資源的限制而不能推廣。因此，新的指南建議通過非侵入性方法篩選唐氏綜合征高風險的孕婦作為侵入性檢查的對象［2］。除了診斷唐氏綜合征、13和18三體，在某些情況下仍需用到侵入性檢查。例如B超發(fā)現(xiàn)胎兒結(jié)構(gòu)異常，或父母一方有染色體重排可能造成胎兒染色體異常時，其他類型的染色體異常（缺失或重疊）風險增加，仍需用到侵入性檢查。G顯帶全核型分析是目前對高風險胎兒染色體病標準的侵入性檢查方法，檢出率大于1／300，這和該技術(shù)導(dǎo)致的流產(chǎn)率接近。核型分析在診斷常染色體13、18、21三倍體和性染色體一些非倍數(shù)性畸變時有100%的敏感性和特異性，這些畸形占胎兒染色體結(jié)構(gòu)異常的大部分且與孕婦年齡偏大有關(guān)［3］。此外，核型分析在檢測其他染色體畸形時也有作用，包括數(shù)目上（如三體和特定結(jié)構(gòu)異常染色體）和結(jié)構(gòu)上（缺失、易位、倒置或插入），其分辨能力在1000萬個堿基對左右。這種染色體畸變常與母親年齡無明顯關(guān)系且與生化篩查結(jié)果無關(guān)，常為偶然發(fā)現(xiàn)或超聲提示胎兒結(jié)構(gòu)異常時檢出［4，5］。核型分析也有很多應(yīng)用上的局限［6］。由于檢測需要細胞培養(yǎng)和收獲，同時需要大量實驗分析處理，故全核型分析需要7～14天時間。各個實驗室的核型分析費用不一，平均一次全核型分析大約需要500加元，包括材料和技術(shù)人員時間（J.Chernos，personalcommunication，June2006）。為研制有力的分子基因此可以提供更加快捷的檢測結(jié)果同時降低醫(yī)療費用，節(jié)約醫(yī)療資源。這種新方法的主要缺陷是無法檢測目標染色體除了非整數(shù)倍性染色體疾病以外的染色體畸變，而其中一些疾病在臨床上有顯著的發(fā)病率。非整倍性染色體疾病快速診斷方法目前臨床應(yīng)用的有效的RAD檢測技術(shù)主要有2種：FISH和QF-PCR，需要指出的是它們作為核型分析的補充，而不是替代。MLPA是一項針對其他適應(yīng)證的新技術(shù)，目前仍處于研究階段，將來可能用于產(chǎn)前診斷。熒光原位雜交（FISH）FISHDNA13、1821XY10010%～15%的染色體鑲嵌，該水平近似于全核型分析。FISH和高齡妊娠附加檢查，以便為決定終止妊娠的夫婦提供更快速的診斷。FISH11點基因缺失綜合征，與某些心臟畸形有關(guān)）或者夫婦已生育一染色體微缺失的后代。FISH100%［10］FISHFISH［10，11］。FISHFISH核型分析使得費用加倍，可達1000美元（J.Chernos，personalcommunication，June2006）。熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）是一項公認的分子遺傳學(xué)技術(shù)，它通過特異性引DNA（QF-PCR）是一項可以測量DNA序列拷貝數(shù)的新技術(shù)［11-13］。通過QF-PCR技術(shù)，科學(xué)家可以對未培養(yǎng)的羊水細胞或絨毛中提取的DNA中感興趣的染色體上（13，18，21，X和Y）特異的DNA多態(tài)性標記物進行擴增。熒光標記引物結(jié)合到每個靶序列，使DNA聚合酶鏈復(fù)制，合成雙鏈DNA。擴增后，毛細管電泳分離產(chǎn)物。計算機輔助測量熒光信號強度可以測量每個靶序列即每個染色體的拷貝數(shù)。QF-PCR產(chǎn)前診斷。QF-PCR95.6599.97%［10］。此外，這一技術(shù)還可以準確地檢測出三倍體。QF-PCR［18］。由于母源細胞污棱兩可的，通過比較母親的血液樣本可以用來作出裁決［11］。這一技術(shù)相比FISH的主要優(yōu)點是易于自動化操作和樣本的定量，從而降低成本至每樣本約20美元［10］QF-PCR多重連接探針擴增（MLPA）PCRDNA［19］MLPADNA1根據(jù)擴增峰的改變就可以測量靶序列甚至每條染色體的拷貝數(shù)。MLPA于非整倍體檢測的產(chǎn)前診斷應(yīng)用［20-23］。然而，這一新技術(shù)并未被那些使用FISH或QF-PCR的研究中心作為常規(guī)的檢測方法。MLPA技術(shù)還有其他方面的應(yīng)用，包括結(jié)合FISH技術(shù)進行微缺失綜合征的產(chǎn)前診斷。目前，更多研究專注于一些MLPA試劑盒的研發(fā)，以此來進行一些其他方法不能檢測的疾病的產(chǎn)前診斷（例如Prader-Willi和Angelman）。MLPAQFPCR［21］。目前已報道的非嵌合體性非整倍體異常10099.852740）。當然這一技術(shù)也有合體異常的檢測靈敏度；以及該檢測方法比較費時。MLPA目前仍處于研究階段，尚無法廣泛應(yīng)用于產(chǎn)前診斷。討論我們已經(jīng)分析了RAD檢測方法的優(yōu)點及其局限性。顯然，分子遺傳學(xué)作為一個輔助手段，在染色體疾病的產(chǎn)前診斷方面有積極的推動作用，而不是替代細胞遺傳學(xué)。FISH和QF-PCR技術(shù)是眾所周知的，而MLPA檢測法的在胎兒非整倍體檢測方面（13、1821及性染色體異常）的靈敏度及特異度同全核型分析無差。而QF-PCR和MLPAFISH動化檢測，并且成本高于基于PCR的其他檢測方法。在加拿大大多數(shù)的研究中心，會對一些高風險妊娠孕婦進行RAD檢測（主要是FISH），因為這可以更快地提供結(jié)果給她們以決定是否終止妊娠。RAD檢測資格是基于地區(qū)確定的標準來評定的，這需要考慮到額外的成本、陽性結(jié)果的可能性、20FISHFISHQF-PCR［5，13，17，24-27］QF-PCR10013、1821X有超聲檢測出異常的病例（3.5mm）或者有疾病遺傳史的孕婦，全核型分析作為備用培養(yǎng)檢測方式是必要的。另一個支持RAD檢測的理由是這可以避免使用侵入性方法對罕見的染色體異常進行不必要的檢測鑒定（13、1821）。染色體異常預(yù)測結(jié)果通常是沒有或者不確定，這在遺傳咨詢上臨床意義的表述是有困難的，這有可能會引起孕婦夫婦的焦慮，可能會導(dǎo)致想繼續(xù)妊娠的孕婦選擇終止妊娠。然而事實上，其他染色體異常的預(yù)測（或有可能）有臨床意義，Ogileve等［24］非整倍體染色體異常的檢測率在產(chǎn)前和產(chǎn)后是相似的。孕婦通常因為懷有非整倍體胎兒風險較高而要承受侵入性檢測，但其實她們生育非整倍體染色體異常胎兒的風險并不比未選中的妊娠婦女高［4］。在產(chǎn)前診斷方面，如同其他醫(yī)療領(lǐng)域，進展的衡量標準是隨著時間的推移是否可以為患者提供更多的信息和選擇（例如，更多的篩查方法選擇和更好的診斷性檢測）然而在某些情況下，僅做RAD而不是更多。分子生物學(xué)技術(shù)很可能成為解決這一問題的關(guān)鍵，從而可以向患者提供更多的信息。MLPA和微陣列分析（Rickman等［3，28］的綜述）這些最佳的技術(shù)可以同時檢測更多的疾病，同時，生物技術(shù)行業(yè)的競爭也大大降低了檢測的成本?？梢韵胂笤诓贿h的將來，接受羊水穿刺的婦女可以通過這一項檢查來選擇檢測全部或者部分染色體非整倍體異常，而所需的費用比目前的核型分析要低。詞匯表非整倍體：染色體數(shù)目不是23的整倍數(shù)，通常是指在配子產(chǎn)生過程中由于減數(shù)分裂時未發(fā)生分離錯誤引起的。常染色體：除了性染色體外的其他染色體。染色體：包含一條DNA單鏈的線性結(jié)構(gòu)，人體通常含有46條染色體，分成23對。DNA雜交：標記的DNA探針與互補的靶序列結(jié)合。染色體組型：一個人的染色體組成，即個體的染色體顯微照片，系統(tǒng)地排列成23對。單體型：1條染色體缺失。嵌合型：個體或組織中存在2個或更多不同基因型的細胞系。染色體數(shù)量畸變：染色體數(shù)量不是46。染色體結(jié)構(gòu)畸變：染色體數(shù)量為46，但存在部分染色體缺失（刪除）、增加（插入）或重排（易位或倒置）。三倍體：1條染色體數(shù)量為69（每條染色體存在3份拷貝）。三體型：存在1條額外的染色體。參考文獻［1］DickPT.Periodichealthexamination，1996update：1.PrenatalscreeningforanddiagnosisofDownsyndrome.CanadianTaskForceonthePeriodicHealthExamination［J］.CMAJ，1996，154：465-479.［2］SummersAM，LangloisS，WyattP，etal.Prenatalscreeningforfetalaneuploidy［J］.JObstetGynaecolCan，2007，29：146-161.［3］RickmanL，F(xiàn)ieglerH，Shaw-SmithC，etal.PrenataldetectionofunbalancedchromosomalrearrangementsbyarrayCGH［J］.JMedGenet，2006，43：353-361.［4］RyallRG，CallenD，CoccioloneR，etal.KaryotypesfoundinthepopulationdeclaredatincreasedriskofDownsyndromefollowingmaternalserumscreening［J］.PrenatDiagn，2001，21：553-557.［5］LeungWC，LauET，LaoTT，etal.Canamnio-polymerasechainreactionalonereplaceconventionalcytogeneticstudyforwomenwithpositivebiochemicalscreeningforfetalDownsyndrome［J］？ObstetGynecol，2003，101：856-861.［6］ShafferLG，BejjaniBA.Acytogeneticist'sperspectiveongenomicmicroarrays［J］.HumReprodUpdate，2004，10：221-226.［7］KlingerK，LandesG，ShookD，etal.Rapiddetectionofchromosomeaneuploidiesinunculturedamniocytesbyusingfluorescenceinsituhybridization（FISH）［J］.AmJHumGenet，1992，51：55-65.［8］BryndorfT，ChristensenB，VadM，etal.Prenataldetectionofchromosomeaneuploidiesbyfluorescenceinsituhybridization：experiencewith2000unculturedamnioticfluidsamplesinaprospectivepreclinicaltrial［J］.PrenatDiagn，1997，17：333-341.［9］TepperbergJ，PettenatiMJ，RaoPN，etal.Prenataldiagnosisusinginterphasefluorescenceinsituhybridization（FISH）：2-yearmulti-centerretrospectivestudyandreviewoftheliterature［J］.PrenatDiagn，2001，21：293-301.［10］GrimshawGM，SzczepuraA，HultenM，etal.Evaluationofmoleculartestsforprenataldiagnosisofchromosomeabnormalities［J］.HealthTechnolAssess，2003，7：1-146.［11］MannK，DonaghueC，F(xiàn)oxSP，etal.Strategiesfortherapidprenataldiagnosisofchromosomeaneuploidy［J］.EurJHumGenet，2004，12：907-915.［12］MansfieldES.DiagnosisofDownsyndromeandotheraneuploidiesusingquantitativepolymerasechainreactionandsmalltandemrepeatpolymorphisms［J］.HumMolGenet，1993，2：43-50.［13］SchmidtW，JendernyJ，HecherK，etal.DetectionofaneuploidyinchromosomesX，Y，13，18and21byQF-PCRin662selectedpregnanciesatrisk［J］.MolHumReprod，2000，6：855-860.［14］PertlB，PieberD，Lercher-HartliebA，etal.RapidprenataldiagnosisofaneuploidybyquantitativefluorescentPCRonfetalsamplesfrommothersathighriskforchromosomedisorders［J］.MolHumReprod，1999，5：1176-1179.［15］CiriglianoV，EjarqueM，CanadasMP，etal.Clinicalapplicationofmultiplexquantitativefluorescentpolymerasechainreaction（QF-PCR）fortherapidprenataldetectionofcommonchromosomeaneuploidies［J］.MolHumReprod，2001，7：1001-1006.［16］CiriglianoV，EjarqueM，F(xiàn)usterC，etal.XchromosomedosagebyquantitativefluorescentPCRandrapidprenataldiagnosisofsexchromosomeaneuploidies［J］.MolHumReprod，2002，8：1042-1045.［17］LeungWC，WatersJJ，ChittyL.Prenataldiagnosisbyrapidaneuploidydetectionandkaryotyping：aprospectivestudyoftheroleofultrasoundin1589second-trimesteramniocenteses［J］.PrenatDiagn，2004，24：790-795.［18］DonaghueC，MannK，DochertyZ，etal.DetectionofmosaicismforprimarytrisomiesinprenatalsamplesbyQFPCRandkaryotypeanalysis［J］.PrenatDiagn，2005，25：65-72.［19］SchoutenJP，McElgunnCJ，WaaijerR，etal.Relativequantificationof40nucleicacidsequencesbymultiplexligation-dependentprobeamplification［J］.NucleicAcidsRes，2002，30：e57.［20］GerdesT，KirchhoffM，LindAM，etal.Computer-assistedprenatalaneuploidyscreeningforchromosome13，18，21，XandYbasedonmultiplexligation-dependentprobeamplification（MLPA）［J］.EurJHumGenet，2005，13：171-175.［21］HochstenbachR，MeijerJ，vandeBJ，etal.Rapiddetectionofchromosomalaneuploidiesinunculturedamniocytesbymultiplexligation-dependentprobeamplification（MLPA）［J］.PrenatDiagn，2005，25：1032-1039.［22］GerdesT，KirchhoffM，BryndorfT.Automaticanalysisofmultiplexligation-dependentprobeamplificationproducts（exemplifiedbyacommercialkitforprenatalaneuploidydetection）［J］.Electrophoresis，2005，26：4327-4732.［23］SlaterHR，BrunoDL，RenH，etal.Rapid，highthroughputprenataldetectionofaneupl