生物技術(shù)基因工程篇

關(guān)于生物技術(shù)基因工程篇第一頁，共六十二頁，2022年，8月28日基因工程(geneticengineering)基因工程又稱DNA重組技術(shù)，即在體外把兩種或者兩種以上不同來源的DNA分子重新組合成新的DNA分子，通過載體轉(zhuǎn)入受體細胞內(nèi)，將所需要的經(jīng)過修飾的基因在受體細胞內(nèi)表達，產(chǎn)生人類所需要的基因或產(chǎn)物，或轉(zhuǎn)基因生物。第二頁，共六十二頁，2022年，8月28日基因工程的基本步驟分離/制備目的基因選擇載體使目標基因與載體DNA連接形成重組體以重組體轉(zhuǎn)化宿主細胞（細菌或其他細胞）篩選出能夠表達重組DNA的宿主細胞，使這些細胞擴增、繁殖獲得大量拷貝的目的基因使目的基因在宿主細胞表達出編碼的多肽第三頁，共六十二頁，2022年，8月28日基因工程（原核表達系統(tǒng)）操作的基本步驟第四頁，共六十二頁，2022年，8月28日一、目標基因的制備1、限制性內(nèi)切酶法（鳥槍法或散彈法）2、酶促合成法/反向轉(zhuǎn)錄法3、人工合成法4、通過PCR把目的基因擴增出來第五頁，共六十二頁，2022年，8月28日1、限制性內(nèi)切酶法（鳥槍法或散彈法）第六頁，共六十二頁，2022年，8月28日優(yōu)點：原理簡單，操作簡便，具有一定的應(yīng)用范圍

基因組文庫（genomiclibrary）的制備：用限制性內(nèi)切酶將基因組DNA切成片段，每一段與一個載體連接成重組DNA，并引入宿主細胞進行擴增，得到分子克隆的混合體，稱基因文庫。缺點：所獲得的DNA含有內(nèi)含子，不能在原核細胞中表達。第七頁，共六十二頁，2022年，8月28日2、酶促合成法/反向轉(zhuǎn)錄法

mRNA→逆轉(zhuǎn)錄→cDNA第八頁，共六十二頁，2022年，8月28日3、人工合成法蛋白質(zhì)的氨基酸序列※用于結(jié)構(gòu)清楚、分子量較小的基因核苷酸序列化學(xué)合成目的基因按密碼子推算第九頁，共六十二頁，2022年，8月28日

利用化學(xué)合成法已成功合成人生長激素釋放因子、胸腺素、血管升壓素、胰島素、α干擾素等基因，并進一步生產(chǎn)出相應(yīng)的藥物。第十頁，共六十二頁，2022年，8月28日4、通過PCR把目的基因擴增出來第十一頁，共六十二頁，2022年，8月28日第十二頁，共六十二頁，2022年，8月28日二、載體的選擇

載體（vector）：運載外源性DNA有效地進入到受體細胞內(nèi)的工具。

載體應(yīng)具備的條件分子相對較?。?~10kb）,能進行復(fù)制，且具有高拷貝數(shù);具有幾個單一的酶切位點，酶切位點應(yīng)在復(fù)制子以外適當?shù)奈恢?能接納盡可能大的外源性DNA。外源性DNA插入后，載體在受體細胞中的復(fù)制不受影響。第十三頁，共六十二頁，2022年，8月28日④必須有便于篩選的明顯標志，如耐藥性和空斑形成等,以便于陽性克隆細胞容易被選出；有促進外源性DNA表達的調(diào)控區(qū)；對受體細胞無害。

※天然載體有很多缺點，遠遠達不到理想載體的要求，通常使用的載體都是經(jīng)過改造過的載體。第十四頁，共六十二頁，2022年，8月28日質(zhì)粒（plasmid）噬菌體（phage）病毒(vector)

載體的種類按來源分

克隆載體(cloningvector)按作用分表達載體(expressionvector)第十五頁，共六十二頁，2022年，8月28日1、質(zhì)粒載體質(zhì)粒的存在與否一般對細菌的生存沒有決定性的影響。帶有選擇性遺傳標志，如基因的產(chǎn)物可能是降解某些抗生素的酶。在添加真核復(fù)制信號和啟動子后，可以構(gòu)建出能在原核細胞或真核細胞均可復(fù)制的穿梭質(zhì)粒（shuttleplasmid）。在基因工程中應(yīng)用廣泛

。實際應(yīng)用的都是人工構(gòu)建的質(zhì)粒，其中最常用的是pBR322,pUC19等。第十六頁，共六十二頁，2022年，8月28日質(zhì)粒在宿主細胞中的復(fù)制有兩種類型嚴密型質(zhì)粒：復(fù)制需要蛋白質(zhì)合成和DNA聚合酶Ⅲ的存在，它的復(fù)制與宿主細胞的增殖密切相關(guān)，每個宿主細胞內(nèi)只有1~5個嚴密型質(zhì)粒。

松弛型質(zhì)粒：復(fù)制需要DNA聚合酶Ⅰ，可以在沒有蛋白質(zhì)合成的情況下繼續(xù)復(fù)制，每個宿主細胞內(nèi)可存有10~200個以上的松弛型質(zhì)粒，在細胞蛋白質(zhì)合成及染色質(zhì)復(fù)制停止的情況下，可繼續(xù)大量擴增至上千份。

利用此原理可在質(zhì)粒擴增時，加入氯霉素抑制宿主菌蛋白質(zhì)合成，達到進一步擴增松弛型質(zhì)粒的目的。第十七頁，共六十二頁，2022年，8月28日PBR322抗氨芐青基因抗四環(huán)素基因第十八頁，共六十二頁，2022年，8月28日質(zhì)粒的構(gòu)建第十九頁，共六十二頁，2022年，8月28日質(zhì)粒攜帶外源基因第二十頁，共六十二頁，2022年，8月28日第二十一頁，共六十二頁，2022年，8月28日（1）λ噬菌體2、噬菌體載體感染細菌的病毒特點：雙鏈DNA分子（線性或環(huán)形）兩端具有12個nt單鏈互補粘性末端COS位點具非必需區(qū)（中間區(qū)約1/3長度）可在體外包裝成病毒顆粒，可高效感染宿主細胞（大腸桿菌）容量大，可以插入23～25Kb左右的外源基因。第二十二頁，共六十二頁，2022年，8月28日第二十三頁，共六十二頁，2022年，8月28日根據(jù)生活周期分

溶菌性：在細菌中連續(xù)增殖直到細菌裂解，釋放噬菌體溶源性：將其DNA整合入細菌基因組DNA中，與宿主DNA一起復(fù)制，然后傳給子代，宿主細胞不發(fā)生裂解。**只有雙鏈DNA的噬菌體才具有溶源周期。第二十四頁，共六十二頁，2022年，8月28日噬菌體的溶源周期和溶菌周期第二十五頁，共六十二頁，2022年，8月28日類型：

插入型載體：只有一個限制性內(nèi)切酶位點可供插入外源性DNA片段。替代型載體：含有某個限制性內(nèi)切酶的兩個切點，這兩個切點間的片段可以被外源性DNA替代。第二十六頁，共六十二頁，2022年，8月28日第二十七頁，共六十二頁，2022年，8月28日藍白篩選載體中含一個LacZ基因

β-半乳糖苷酶

X-gal(無色)X(藍色)+gal(半乳糖)其中X為顯色底物：5-溴-4-氫-3-吲哚-β-D半乳糖苷

在含X-gal和Lac操縱子誘導(dǎo)物IPTG（異丙基硫代半乳糖苷）的培養(yǎng)基中

◆非重組的噬菌體轉(zhuǎn)化的宿主菌可以合成β-半乳糖苷酶，分解X-gal，菌落形成藍色噬菌斑。

◆重組的的噬菌體因LacZ基因被外源DNA插入而破壞，故其轉(zhuǎn)化的宿主菌不能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，因而菌落形成無色噬菌斑。編碼第二十八頁，共六十二頁，2022年，8月28日第二十九頁，共六十二頁，2022年，8月28日第三十頁，共六十二頁，2022年，8月28日（2）M13噬菌體（M13phage）特點：單鏈線性DNA分子大腸桿菌被感染后，并不死亡，只是生長緩慢，而新的噬菌體被釋放到菌體外。感染大腸桿菌后，單鏈線性DNA分子可轉(zhuǎn)變成雙鏈復(fù)制型(RF)。從大腸桿菌中分離出雙鏈復(fù)制型的M13還可作為克隆雙鏈DNA的載體具非必需區(qū)(IS)第三十一頁，共六十二頁，2022年，8月28日從宿主菌體中釋放出來的M13噬菌體粒子只含單鏈DNA,其中包含有被克隆的外源性DNA片段中兩條中的一條，因此可用來制備單鏈DNA探針，也可以用作DNA測序的模板。篩選：藍白篩選第三十二頁，共六十二頁，2022年，8月28日

是指含有入噬菌體粘性末端的雜種質(zhì)粒。

由入噬菌體的cos區(qū)與質(zhì)粒重組建造而成。

在宿主細胞中可以作為正常噬菌體進行復(fù)制，但不表達噬菌體的任何功能。（3）粘尾質(zhì)粒(cosmid)/粘性質(zhì)粒/粘粒/cos質(zhì)粒第三十三頁，共六十二頁，2022年，8月28日cosmid的構(gòu)造特點:

含有抗藥標志和復(fù)制起始部位；

一個或多個單一酶的限制位點；

帶有入噬菌體粘性末端；

分子小，可容納大的外源DNA片段。第三十四頁，共六十二頁，2022年，8月28日將染色體端粒序列（TEL）、自主復(fù)制序列（ARS）、著絲粒（CEN）以及必要的選擇標記（HISA4和TRP）基因和多克隆位點（MSC）的DNA片段克隆到pBR322中，轉(zhuǎn)化酵母細胞YAC。（1）酵母為宿主的載體3、真核細胞為宿主的克隆載體人工構(gòu)建的酵母質(zhì)粒

酵母人工微小染色體（YAC）第三十五頁，共六十二頁，2022年，8月28日第三十六頁，共六十二頁，2022年，8月28日（2）以植物細胞為宿主的基因克隆載體Ti質(zhì)粒第三十七頁，共六十二頁，2022年，8月28日（3）DNA病毒載體1）SV40載體（猴腎病毒）完整的SV40載體利用SV40元件組建的穿梭質(zhì)粒載體，如pSVK3質(zhì)粒：由噬菌體三種載體構(gòu)建而成質(zhì)粒SV402）乳頭瘤病毒載體

如pBPV載體是在牛乳頭瘤病毒基礎(chǔ)上構(gòu)建的穿梭載體。3）腺病毒載體

如pBPV載體是在牛乳頭瘤病毒基礎(chǔ)上構(gòu)建的穿梭載體。第三十八頁，共六十二頁，2022年，8月28日

克隆載體(cloningvector)用于在受體細胞中進行目的基因擴增的載體。

表達載體(expressionvector)在受體細胞中表達（轉(zhuǎn)錄和翻譯）外源基因的載體。第三十九頁，共六十二頁，2022年，8月28日啟動子、核糖體結(jié)合位點、克隆位點、轉(zhuǎn)錄終止信號大腸桿菌表達載體除克隆載體的特性外還含有：哺乳動物表達載體除含有原核序列（在E-Coli中的復(fù)制起始點、便于篩選的抗性基因）還包括：啟動子/增強子、克隆位點、終止信號和加poly（A）信號。第四十頁，共六十二頁，2022年，8月28日三、目標基因與載體DNA連接形成重組體

工具酶限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease)

能識別DNA分子內(nèi)部的特異的對稱序列,水解磷酸酯鍵，切斷分子。

識別序列的特點

①專一；②常由4~6個堿基組成；③具有回文序列BamH1酶-GGATCC-

-CCTAGG-第四十一頁，共六十二頁，2022年，8月28日

限制性內(nèi)切酶都是從原核生物中發(fā)現(xiàn)的。到目前為止已發(fā)現(xiàn)上千種限制性內(nèi)切酶，其中數(shù)十種被經(jīng)常使用。

水解磷酸二酯鍵，產(chǎn)生DNA片段的5′端為P，3′端為—OH第四十二頁，共六十二頁，2022年，8月28日第四十三頁，共六十二頁，2022年，8月28日限制酶的命名

EcoRⅠ細菌的屬名從該細菌中分離出的第幾個酶細菌種名細菌株系第四十四頁，共六十二頁，2022年，8月28日切口類型：

（1）形成粘末端(cohesiveend)：第四十五頁，共六十二頁，2022年，8月28日目的基因第四十六頁，共六十二頁，2022年，8月28日第四十七頁，共六十二頁，2022年，8月28日

連接酶的作用是：將互補配對的兩個黏性末端連接起來，使之成為一個完整的DNA分子。第四十八頁，共六十二頁，2022年，8月28日（2）形成平末端SmaⅠCCC↓GGG

GGG↑CCC第四十九頁，共六十二頁，2022年，8月28日DNA連接酶(DNAligase)第五十頁，共六十二頁，2022年，8月28日四、重組DNA導(dǎo)入受體細胞轉(zhuǎn)化（transformation）

以質(zhì)粒為載體，將攜帶外源基因進入受體細胞的過程。轉(zhuǎn)染（transfection）由噬菌體或病毒介導(dǎo)外源DNA進入宿主細胞的過程。第五十一頁，共六十二頁，2022年，8月28日受體細胞

大腸桿菌、枯草桿菌、酵母菌細胞、哺乳動物細胞、昆蟲細胞※受體細胞必須是限制性內(nèi)切酶缺陷型，即R-菌株，使載體或重組DNA不被水解第五十二頁，共六十二頁，2022年，8月28日受體細胞

大腸桿菌、枯草桿菌、酵母菌細胞、哺乳動物細胞、昆蟲細胞

細菌細胞作為表達系統(tǒng)

優(yōu)點：操作簡單、增代時間短、價格低廉；

某些蛋白質(zhì)的表達水平很高

缺點:表達多肽分子常不能適當?shù)卣郫B,蛋白質(zhì)常無生物活性；

異體蛋白質(zhì)，常對細菌有毒性作用；

缺乏真核細胞進行轉(zhuǎn)錄后修飾的酶，例如使蛋白質(zhì)磷酸化、糖基化

第五十三頁，共六十二頁，2022年，8月28日轉(zhuǎn)化的方法（1）化學(xué)轉(zhuǎn)化法Cacl2致敏轉(zhuǎn)化法宿主：大腸桿菌感受態(tài)細胞（CompetentCell）：E-coli經(jīng)Cacl2處理（0-5℃），使細胞膜通透性增加，從而具有攝取外源DNA的能力。第五十四頁，共六十二頁，2022年，8月28日轉(zhuǎn)化程序：

感受態(tài)細胞+質(zhì)粒DNA42℃、90sec不含抗生素的培養(yǎng)基熱休克37℃涂布選擇性平板37℃得到細胞的克隆

30-60min